专利名称：一种控制植物花芽着生位置的方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用生物工程手段对植物花芽着生位置进行控制的方法以及该方法的应用。
背景技术：
高等植物开花是其生活周期中的重要环节，花的数量与农作物的产量密切相关，对于花卉植物来讲，花的着生位置、花器官的数目对其观赏价值有决定性的作用。
植株地上部分是在生长的过程中由茎尖分生组织(the shoot apical meristem，SAM)逐渐分化而来，茎尖分生组织是地上部分各器官发育的源泉。茎尖分生组织为一个半球型的结构，其中心区域(也叫中央带)(central zone，CZ)由有丝分裂活动不旺盛的干细胞组成，是顶端生长所必需的；分生组织周边(也叫周围带)(peripheralzone，PZ)由分裂速度较快的细胞组成，器官原基由此产生。中央带中的干细胞分裂后产生两部分细胞，一部分仍然保留在分生组织的中央，称为干细胞后裔(progeny ofstem cells)，保持多潜能性，另一部分叫子代细胞(daughter cells)，将离开中央带逐渐向分生组织周边移动，在周边分化成为新的器官原基。
在植物的发育生长过程中，随着内、外因子的诱导(开花决定)，分生组织内相关基因有序地表达，使植物由营养生长向生殖生长状态转化，营养型的茎尖分生组织转变为花序分生组织(inflorescence meristem)，在花序分生组织的周边产生花分生组织(floral meristem)，花分生组织又产生一轮轮呈同心圆排列的花器官(Doerner，2001，Curr.Biol.11R785-R787)。
突变体wus是在1996年被分离出来的，其主要表型为茎尖平坦，花以中央雄蕊的形式提前终止，萼片花瓣正常。双突变分析表明，不论花的第三轮是什么器官，只要是WUS突变就会以第三轮器官终止，缺少第四轮器官(Laux et al.，1996，Development，12287-96)。随着对该基因的克隆和其表达模式的研究，发现WUS编码一个由291个氨基酸残基组成的转录因子，它的功能是在茎尖分生组织中决定干细胞的命运(Mayer et al.，1998，Cell，95805-815)，限制茎尖分生组织和花分生组织的大小。WUS是干细胞促进途径(stem cell-promoting pathway)中的组份。研究发现，让WUS异位过量表达时，植株茎尖分生组织膨大，同时，CLV3的表达区域也变大，说明异位表达的WUS激活了CLV3的表达。在35S∷CLV3转化植株中，CLV3的超表达使WUS的表达量严重下降。在clv突变体中WUS有更广的表达区域，表明野生型中CLV限制WUS的表达范围。CLV通过限制WUS的表达量和表达区域控制着分生组织中干细胞群的大小，WUS通过激活CLV而有效地将自己所决定的干细胞分化为器官原基(Schoof et al，2000，Cell，100635-644；Brand et al，2000，Science，289617-619)。
在决定干细胞数方面，除上述WUS和CLV之间的反馈环之外，在WUS和AG之间也有一个类似的反馈环WUS+LFY激活AG，AG抑制WUS的表达。该环的存在既为花器官的正常启动奠定了基础，同时也为正常的生殖生长提供了保证。该调节环负责花分生组织中细胞的分裂与分化之间的平衡，WUS和AG之间关系的重要性在于明确地把分生组织的组织者和花特征因子LFY放在了一起，自分子水平解答了造成花分生组织与花序分生组织之间差别的机理(Lenhard et al.，2001，Cell，105805-814；Lohmannet al.，2001，Cell，105793-803)。
WUS/AG环不能替代WUS/CLV、但能互补WUS/CLV环，事实上这两个调节环存在明显的不同WUS/CLV环中的抑制、激活是在同一时间不同地点时刻在发生着的两个过程；(WUS+LFY)/(AG+？)环中对AG的激活、抑制是在同一地点不同时间先后发生，先激活，再抑制，在时间上是分离的。
研究发现，WUS除了限制茎尖分生组织和花分生组织的大小之外，还可控制莲座叶的形态(Hamada et al.，2000，Plant J，2491-101)，促使正常的体细胞向胚性细胞的转变，从而诱导体细胞胚的发生(Zuo et al.，2002，Plant J.，30349-59)。
发明内容
本发明的目的是提供一种控制植物花芽着生位置的方法，以实现对花着生位置的人为控制。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种控制植物花芽着生位置的方法，是在内源WUS基因的调控区插入至少一个增强子或者是将连接有至少一个增强子的外源WUS基因导入受体植物中。
所述的增强子位于WUS基因阅读框之前是较优选的情况。
所述增强子可以是一个，也可以是几个，其中较为优选的是35S增强子。
为了便于操作和识别，所述插入的增强子序列还可以连接有适当的DNA标签，例如T-DNA边界序列，序列已知的转座子等。
一般情况下，利用DNA的体外重组技术，将35S增强子序列连接在WUS基因附近，插入在T-DNA的左右边界之中，借助农杆菌的侵染，将连接有增强子序列的WUS基因整合在植物染色体上。
由于增强子的存在，使WUS表达会增强，使植物在其正常的花序以外的其它位置异位启动新的花分生组织。
本发明巧妙地利用T-DNA插入的办法，通过现有的任意转化手段，将增强子序列插入到WUS基因阅读框附近，使其在原有位置过量表达，得到功能增强(gain-of-function)突变体，从而在分生组织过剩的同时让花分生组织在植物的茎(花序轴)表面等位置异位产生，改变茎的生长方式，使植物体表多处出现花结构，并可使花期延长，提高花卉的可观赏性。本发明的方法在培育欲改变花结构位置的品种，或在培育欲延长花期的植物品种中将得到广泛应用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
图1显示在花序轴表面有花芽异位出现。
具体实施例方式
本发明的实验均以模式植物拟南芥为材料，将模式植物拟南芥纯合突变体bril-5种子吸胀后，置于湿室中4℃春化3天，栽培于含有1/3蛭石的腐质土中，在每天16小时光照、21±1℃条件下生长。
实施例1、内源WUS基因超表达1、T-DNA转化利用质粒pSKIO15作为插入激活标签(Weigel et al.，2000，Plant Physiol.122，1003-1013.)，借助农杆菌介导(Clough & Bent，1998，Plant J.16，735-743.)，将携带有4个35S增强子的T-DNA引入拟南芥中，从功能增强(gain-of-function)突变群体中筛选到花序轴弯曲、生长缓慢、花器官异常、花序轴上出现愈伤状结构的个体(如图1所示)，即转化体。
2、WUS超表达质粒的构建人为地将35S增强子置于WUS基因的调控区，完成在体外的构建，借助农杆菌介导的遗传转化，将携带有35S增强子、WUS基因的调控区和编码区的重组DNA整合到植物染色体上，从而使WUS在其自己启动子调控之下超表达。
实施例2、插入位点鉴定用EcoRI对转化体的基因组DNA进行完全消化，加热失活EcoRI，酶切产物自身连接环化，用pSKIO15中T3启动子附近的序列和RB边界附近的序列为引物，反向PCR扩增，扩增产物进行DNA序列分析。
通过与已知序列比较，确定包含增强子的T-DNA所插入位置是在WUS基因上游。
实施例3、表达模式分析
1、定量RT-PCR收集突变体茎上含有花芽的部分100mg，在1ml TRIZOL试剂(GIBCIRBL)中研磨，室温放置20min，加入0.2ml氯仿，摇15min后12000g离心取水相，加0.5ml异丙醇沉淀RNA。按照RT-PCR试剂盒说明，以寡聚dT为引物，在54℃下反转录40min得到第一链cDNA。选用包含KpnI识别序列和起始密码子的序列(5’TTCTGGTACCATGGAGCCGCCAC AGCATCAG)作为5’端引物、选用包含SacI识别序列和终止密码子的序列(5’TCTTG GAGCTCCTAGTTCAGACGTAGCTCAAG)为3’端引物，在下列条件下扩增双链cDNA94℃变性2min，94℃ 30 Sec→60℃ 30 Sec→72℃ 60 Sec，30个循环后，72℃延伸5min，4℃保存备用。
扩增产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分析，证实在突变体茎上可以长出愈伤组织状结构的节间部分，有高水平WUS表达。
2、WUS cDNA的克隆参照上述RT-PCR，将扩增产物克隆在pGEM-T vector上。根据RT-RCR产物和克隆载体的大小及浓度，按照插入片段∶载体≈5∶1的比例，将连接酶0.5μl、10倍连接缓冲液1μl与适当体积的PCR产物、克隆载体pGEM-T vector混合，以无菌水调整体积至10μl，在4℃过夜，完成连接反应，转化大肠杆菌并由此得到含有WUS cDNA的阳性克隆。
3、原位表达分析借助克隆载体pGEM-T上的SP6和T7启动子，体外合成地高辛标记的正义和反义RNA探针，通过碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体进行免疫学检测，NBT/BCIP为底物进行显色反应，根据成色反应部位确定WUS转录产物的分布(XU YunYuan et al.，2001，Acta Bot Sin，43871-873)，分析WUS在不同组织内的表达模式。结果表明在花序轴上异位出现的花芽内，有WUS的表达，证明转化体中干细胞组织中心易位出现。
实施例4、杂交实验为了消除BRI突变可能对WUS所产生的效应，进行以下杂交实验在野生型Ws-2(BRI/BRI BRE/BRE)开花之前(大约花发育至12期，用肉眼刚刚可见花顶端有将要开放的花瓣)(Smyth et al.，1990 Plant Cell，2755-767)，用镊子剥去萼片和花瓣，去雄，套袋，次日观察裸露的心皮是否成活，以用本发明的方法获得的突变体bre(bri/bri bre/BRE)的雄蕊与之授粉，继续套袋，收种。
由于bri1-5为一隐性弱突变，F1代植株中未见典型的bri1-5表型(矮化)，而只出现两种表型花序轴弯曲(bri/BRI bre/BRE)和花序轴不弯曲(bri/BRI BRE/BRE)。在花序轴弯曲的个体中，仍然表现为花芽异位出现，开花较晚。说明35S增强子在基因WUS前的插入，确实使花分生组织出现了异位。
权利要求
1.一种控制植物花芽着生位置的方法，是在内源WUS基因的调控区插入至少一个增强子或者是将连接有至少一个增强子的外源WUS基因导入受体植物中。
2.根据权利要求1所述的控制植物花芽着生位置的方法，其特征在于所述方法是在内源WUS基因附近插入一个足以使WUS基因表达增强的增强子序列。
3.根据权利要求1所述的控制植物花芽着生位置的方法，其特征在于所述方法是将在阅读框之前插入至少一个增强子的WUS基因导入受体植物中。
4.根据权利要求1或2或3所述的控制植物花芽着生位置的方法，其特征在于所述增强子为35S增强子。
5.根据权利要求1或2或3所述的控制植物花芽着生位置的方法，其特征在于所述在内源WUS基因的调控区插入增强子或者是将连接有增强子的外源WUS基因导入受体植物中是利用T-DNA进行的。
6.权利要求1所述方法在培育欲改变花结构位置的植物品种中的应用。
7.权利要求1所述方法在培育花期延长的植物品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种控制植物花芽着生位置的方法及应用，目的是提供一种控制植物花芽着生位置的方法，以实现对花着生位置的人为控制。本发明所采用的技术方案是是在内源WUS基因的调控区插入至少一个增强子或者是将连接有至少一个增强子的外源WUS基因导入受体植物中。所述增强子可以是一个，也可以是几个，其中较为优选的是35S增强子。一般情况下，是利用T－DNA在内源WUS基因的调控区插入增强子或者是将连接有增强子的外源WUS基因导入受体植物中。本发明的方法在培育欲改变花结构位置的品种，或在培育欲延长花期的植物品种中将得到广泛应用。
文档编号C12N15/09GK1483819SQ02130750
公开日2004年3月24日 申请日期2002年9月20日 优先权日2002年9月20日
发明者种康, 徐云远, 黎家, 王孝民, 约翰·C·沃克, 许智宏, 谭克辉, C 沃克, 种 康 申请人:中国科学院植物研究所