玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、抗高温、抗盐能力的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及玉米ZmGolS2基因的应用，具体涉及玉米ZmGolS2基因提高植物抗旱、 抗高温、抗盐能力的应用。
【背景技术】
[0002] 通过调控相关基因表达提高植物抗旱、抗热、抗盐的研宄多有报道，但多数转基因 植物由于在正常条件下植物生长受到抑制，因此到目前为止，仍未见相关基因应用于商业 生产。通过调控棉籽糖代谢基因提高植物抗逆性的研宄报道极少。Himuro在2014年报道了 在二穗短柄草中超表达拟南芥AtGolS2基因提高了转基因植株抗旱性（1)。Zhuo在2013年 报道了在烟草中超表达紫花苜蓿MfGolSl基因提高了转基因烟草中的肌醇半乳糖苷、棉子 糖含量并提高了抗寒、抗旱和抗盐能力（2)。Sun在2013年报道了在拟南芥中表达TsGolS2 基因提高了转基因植株抗盐能力（3)。上述报道所用序列来自玉米以外其它物种，和本专利 所涉及的玉米ZmGolS2序列功能类似但序列不同。
[0003] I. Himuroj Y. , Ishiyamaj K. , Mori, F. , Gondoj T. , Takahashij F. , Shinozakij K .,Kobayashij M.and AkashijR. (2014)Arabidopsis galactinol synthase AtGolS2 improves drought tolerance in the monocot model Brachypodium distachyon. J Plant Physiol, 171, 1127-1131.
[0004] 2. Zhuo, C. L，Wang，T.，Lu，S. Y.，Zhao, Y. Q.，Li，X. G. and Guo, Z. F. (2013) A cold responsive galactinol synthase gene from Medicago falcata(MfGolSl) is induced by myo-inositol and confers multiple tolerances to abiotic stresses. Physiol Plantarumj 149, 67-78.
[0005] 3. Sun，Z. B.，Qi，X. Y.，Wang，Z. L.，Li, P. H.，Wu，C. X.，Zhang，H. and Zhao, Y. X. (2013) Overexpression of TsG0LS2，a galactinol synthase, in Arabidopsis thaliana enhances tolerance to high salinity and osmotic stresses. Plant Physiol Bioch，69, 82-89.
[0006] 4. Li, Z. , Peng, J. , Wen, X. and Guoj H. (2013)Ethylene-insensitive3 is a senescence-associated gene that accelerates age-dependent leaf senescence by directly repressing miR164transcription in Arabidopsis. Plant Cell，25, 3311-3328.
【发明内容】
[0007] 本发明通过PCR方法克隆了玉米GRMZM5G872256基因（命名为ZmG0LS2)，将该基 因在拟南芥中超表达，提高了转基因植物叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量，提高了植物 抗旱、抗热、抗盐能力。该基因超表达植株在正常条件下生长正常，表现优于已知抗逆基因 ZmDREB2A超表达植株。在干旱、高温、高盐胁迫条件下该基因生长优于对照，并和ZmDREB2A 超表达植株生长类似。
[0008] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0009] 在植物中过量表达玉米ZmGolS2基因能够提高肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量，提 高植物的抗旱、抗热和抗盐能力。过量表达玉米ZmGolS2基因对植物在正常环境条件下的 生长没有副作用。
【附图说明】
[0010] 图1为PCsGFP载体示意图。
[0011] 图2为ZmGolS2基因表达载体构建及转基因植株鉴定不意图，该图显不超表达 ZmGolS2的拟南芥植株叶片中肌醇半乳糖苷和棉子糖含量显著提高；(a)转拟南芥用载体 示意图；(b)ZmGolS2和ZmDREB2A基因在WT (野生型）和转基因拟南芥中表达水平分析；A : RT-PCR检测ZmGolS2的表达水平。B: RT-PCR和Western检测ZmDREB2A的表达水平；WT为 野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1, G2-2, G2-3为表达ZmGolS2基因植株，DR-5, DR-6， DR-9为表达ZmDREB2A植株；（c)超表达ZmGolS2和ZmDREB2A基因的拟南芥在正常生长条 件下的生长状态；（d) HPLC检测WT和各转基因株系中肌醇半乳糖苷和棉子糖的含量；星号 **表示与WT相比含量显著升高。
[0012] 图3为超表达ZmGolS2基因植株抗旱能力提高示意图，该图中（a)干旱胁迫前，干 旱胁迫2周，干旱胁迫后复水7天各个株系的表型；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系， G2-1, G2-2，G2-3 为表达 ZmGolS2 基因植株，DR-5，DR-6，DR-9 为表达 ZmDREB2A 植株；(b)正 常生长2周的各株系叶片失水率测定；将叶片从植株上剪下，放到玻璃纸上在室温条件下 失水，每隔半小时称重；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT相比失水率显著降低 (p〈0. 05) ; (c)各株系干旱处理后存活率统计；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT 相比差异显著（P〈〇. 05)。
[0013] 图4为超表达ZmGolS2基因植株抗热能力提尚不意图，该图显不超表达ZmGolS2 和ZmDREB2A基因提高了转基因拟南芥植株的抗热性；（a)各转基因株系热激前后表型观 察；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1，G2-2, G2-3为表达ZmGolS2基因植株，DR-5， DR-6，DR-9为表达ZmDREB2A植株；(b)各株系存活率统计；每个株系3个生物学重复；星号 *表示与WT相比差异显著（P〈0. 05)。
[0014] 图5为超表达ZmGolS2基因植株抗盐能力提尚不意图，该图中（a)盐胁迫处理如 和处理后植株表型；WT为野生型，GFP为超表达GFP株系，G2-1，G2-2, G2-3为表达ZmGolS2 基因植株，DR-5，DR-6，DR-9为表达ZmDREB2A植株。盐浓度为200mM NaCl ;(b)各株系盐胁 迫后电导率测定；每个株系3个生物学重复；星号*表示与WT相比差异显著（P〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0015] 1、发明人通过PCR方法克隆了玉米ZmGolS2基因的编码区，构建了该基因植物表 达载体。
[0016] 对水培的三叶期玉米幼苗进行脱水处理。从脱水处理2小时的叶片提取RNA并将 其反转录成cDNA。
[0017] 以 cDNA 为模板，用上游引物 5 ' -CGGGATCCTGGCTCCCGAGCTGATGACAGCCAAG-3 ' 和下 游引物 5'-GCTCTAGACAAACACTCTAGCCCAATTCCTGACC-3'对 ZmG0LS2 的编码区进行 PCR 扩增。
[0018] 扩增程序为：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 Imin 20s， 35个循环；72°C终延伸8min。
[0019] 将扩增产物切胶回收，用BamHI和XbaI酶切片段，后与pCsGFP载体（用于拟南芥 稳定转化，见图1)连接。将PCsGFP上NcoI与BamHI酶切位点之间的GFP表达框替换为一 段短序列，然后将扩增并酶切的ZmGolS20RF片段连在BamHI和XbaI位点之间，构建超表达 拟南芥载体。载体有植物转化筛选标记潮霉素基因（见图2a)。载体上的ZmGolS20RF片 段经测序正确后转入农杆菌Gv3101，用花序侵染法侵染拟南芥ColO野生型。TO代种子经 过70%乙醇室温lmin，20