柠条锦鸡儿中一个新的抗旱基因CkDHN1的制作方法
【专利摘要】本发明公开了柠条锦鸡儿(Caragana?korshinskii?Kom.)一个脱水素及其编码基因CkDHN1。该脱水素由134个氨基酸残基组成，具有一个K保守序列“QKKGIMDKIKDKLPG”，因此该蛋白属于Kn型脱水素。基因全长745bp，从5’端108bp到510bp是一个402bp开放阅读框，在植物受到干旱胁迫下强烈表达，使植物细胞减轻受害，提高抗旱能力，是植物耐旱机制的一个关键基因。该基因与栎树脱水素基因的氨基酸序列(CBE44592)相似度最高，仅为40％，是一个新基因。通过构建该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，可以提高植物的抗旱性能。
【专利说明】柠条锦鸡儿中一个新的抗旱基因 CkDHNI
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物基因工程领域，具体而言，涉及来自柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii Kom.)中一个新的抗旱基因 CkDHNl，该基因可编码植物脱水素，其功能是提高 植物的抗旱性能，属于植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 非生物胁迫是造成全球粮食减产的主要原因，每年可以导致平均粮食产量减少 50%以上。在各种非生物胁迫中，干旱是影响粮食产量最重要的因素。干旱是一种主要的 自然灾害，对农业、水资源和自然环境具有很大的危害，对粮食产量影响巨大，对经济和社 会稳定具有难以估计的影响。中国因为缺水带来的危机尤为严重，近年来，干旱灾害发生频 率高、持续时间加长、影响范围不断扩大，对中国的粮食安全带来重大危害。研究植物抵抗 干旱胁迫的机制，筛选和培育耐逆境农作物品种，通过基因工程应对干旱灾害是减低自然 灾害影响的重要途径之一。
[0003] 研究表明，干旱胁迫下，细胞水平上的生理生化指标发生一系列的变化，包括渗透 压的降低、膜的流动性和组成的改变、溶液浓度的变化、蛋白-蛋白以及蛋白-脂质间的相 互作用等。脱水素基因在植物抗旱、抗盐和耐低温等各种非生物胁迫中发挥着重要的作用。 脱水素（DHN)是LEA蛋白的一种，在植物的脱水组织中会大量积累，例如，种子成熟时或植 物处于干旱、低温和高盐等环境胁迫时，脱水素的积累是植物适应不利环境的重要手段。脱 水素可以保护植物细胞在逆境中免受伤害，增强植物的抗逆能力。体外实验研究表明脱水 素的主要功能是：结合蛋白和脂类；清除自由基；结合金属；低温保护。不同的植物中分离 到越来越多的脱水素基因，大量的转基因技术对这些基因的研究显示：脱水素基因在植物 抗旱、抗盐和耐低温等各种非生物胁迫中发挥着重要的作用。
[0004] 朽1条锦鸡儿（Caragana korshinskii Kom.)分布于荒漠、半荒漠地区，生长环境条 件恶劣，漫长的进化过程使其具备了较强的抗逆性。柠条锦鸡儿抗旱、抗盐碱、耐贫瘠、适应 极端温度，是研究植物抗逆机制的理想材料。利用柠条锦鸡儿抗旱相关基因进行农作物改 良，培育抗逆新品种具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供来自朽1条锦鸡儿（Caragana korshinskii Kom.)中的一个与 抗性相关的脱水素及其编码基因。
[0006] 本发明提供一种来自柠条锦鸡儿的编码基因，其名称为CkDHNl，基因全长748bp， 开放阅读框为405bp，拥有SEQ ID N0:2所示的全长DNA序列和SEQ ID N0:3所示的完整 读码框。
[0007] 所述CkDHNI基因为如下a) -d)中任一所述的基因：
[0008] a)其编码序列是序列表中SEQ ID N0 :2的自5'末端的第1-748位；
[0009] b)其核苷酸序列是序列表中的SEQ ID N0 :3 ;
[0010] c)在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码所述脱水素的基因；
[0011] d)与a)或b)的基因具有90%以上的同源性，且编码所述脱水素的基因。
[0012] 上述严格条件可为用0. 1XSSPE (或0. 1XSCC)，0. 1XSDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0013] 本发明还提供由CkDHNl编码的植物脱水素蛋白，来自柠条锦鸡儿，是LEA蛋白家 族中的一个，为下述1)或2)或3)的蛋白质：
[0014] 1)由序列表中SEQ ID N0 :1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0015] 2)将1)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加，且与脱水素相关的由1)衍生的蛋白质。
[0016] 序列表中SEQ ID N0 :1是由134个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量约13. 82KD， 等电点9. 13。
[0017] 所述植物脱水素编码基因 CkDHNl在培育抗旱植物中的应用也属于本发明的保护 范围。
[0018] 该基因首次在柠条锦鸡儿中克隆，该基因的表达受干旱、寒冷诱导，在抗寒和抗旱 反应中具有调控作用。
[0019] 本发明还提供了一种分离的多核苷酸在植物抗旱基因工程中的应用，其中所述多 核苷酸的序列如SEQ ID N0 :2或SEQ ID N0 :3所示。其中，植物优选为柠条锦鸡儿。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1 :CkDHNl干旱诱导表达
[0021] 图2 :CkDHNl核酸序列及氨基酸序列
【具体实施方式】
[0022] 以下结合【具体实施方式】对本发明的实验步骤进行详细说明：
[0023] 实施例1.拧条叶片干旱胁迫下SSH文库的构建
[0024] 取柠条锦鸡儿一个月苗龄小苗用于实验。从培养钵小心取出柠条苗，蒸馏水冲洗 干净所带泥土，尽量避免造成损伤。吸水纸吸干净水，在原生长环境中放置3小时进行干 旱处理，未处理的柠条苗做为对照。分别剪取对照和处理柠条苗的叶片置于50mL离心管 中，液氮速冻，保存于_80°C冰箱作为构建文库样品备用。TRIzole法提取样品总RNA，经 mRNA纯化试剂盒处理得到mRNA。以干旱处理的朽1条样品作为tester,未处理的朽1条样品 作为 driver，抑制性消减杂交法（Suppression subtractive hybridization，SSH)按照 PCR-SelectTM cDNA Subtract ion Ki t(Clontech)说明书进行文库构建。将消减后的PCR 产物与PMD19T Vector(TaKaRa)载体连接，转化到大肠杆菌感受态T0P10 (天根）细胞中， 筛选阳性克隆。
[0025] 实施例2. SSH文库的随机EST测序
[0026] 从文库中随机选取1359个单克隆进行5'端测序、拼接，将得到EST序列进行 BLAST并注释。
[0027] 选择经BLAST后注释为脱水素编码基因的EST序列，设计RACE引物，利用RACE技 术（具体操作步骤参照大连宝生物TaKaRa RACE试剂盒说明书）获得cDNA序列全长。
[0028] 3' RACE所用引物
[0029] DHN1-3, -0U :GGAGGAAGCACAGGAACAGGT
[0030] DHN1-3' -IN :TGATGCGTATGGTGCTGGACA
[0031] 5' RACE所用引物
[0032] DHN1-5, -0U :TGTTGTCCAGCACCATACGC
[0033] DHN1-5, -IN :CATAACCTGTTCCTGTGCTTCCT
[0034] 根据RACE拼接得到的cDNA序列设计如下特异性引物进行PCR验证，以柠条 锦鸡儿cDNA为模板，高保真酶PrimeSTAR(TaKaRa公司）扩增基因全长，将其克隆入 pEASY-Blunt-T载体（全式金公司）后华大基因有限公司测序，得到柠条锦鸡儿CkDNAl基 因全长cDNA。
[0035] F-DHN1 ：CGTTTTCCTCCTTTGTGC
[0036] R-DHN1 ：AATTATTGAAAAGTTAAAAAAGAGAC
[0037] PCR扩增条件
[0038] 1.98〇C lmin 2.98〇C 15s 3.58。。 15s 4.72 °C lmin 2 29cycles 5. 72 °C lOmin 6. 4°C pause
[0039] 实例3. CkDHNl基因的干旱诱导表达
[0040] 取干旱处理的柠条叶片提取RNA，同时提取正常生长的叶片提取RNA为对照，反转 录成cDNA，根据本发明的SEQ ID NO :2设计荧光定量PCR扩增引物，该引物扩增134bp的 核苷酸序列长度。
[0041] F-DHN1-RT ： GAAGAAAGGGATCATGGATAAGATCA
[0042] R-DHN1-RT ： GAAAAGTTAAAAAAGAGACACCAGTACG
[0043] 根据GeneBank数据库中公布的EF1 a (KC679842)序列设计内参基因引物。
[0044] F-EF1a -RT ：TGGGTGGGACATTCTCTGATT
[0045] R-EF1a -RT ：GCACGGTTCACTTCTTCTTAGC
[0046] 使用 SYBR? Green I 突光染料法，在 LightCycler480 (Roche Diagnostics)实时 荧光定量PCR仪上进行基因的转录表达水平进行分析，2-△ ACt法分析数据。结果发现干 旱诱导下本发明所涉及的CkDHNl基因的表达比对照显著增加，在干旱诱导12小时及24小 时时达到对照的600-800倍（图1)，证明其在抗旱中可发挥重要作用。
[0047] 本发明从柠条锦鸡儿中克隆了一个新的脱水素基因，经过GeneBank数据库中的 BLAST，该转录因子与栎树脱水素的氨基酸序列相似性最高，仅有40%，该蛋白含有1个K保 守结构域（图2)，是一个新脱水素基因。
[0048] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限 制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技 术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依 据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本 发明的技术方案的范围内。
[0001] 序列表.txt SEQUENCE LISTING <110〉内蒙古农业大学 <120〉柠条锦鸡儿中一个新的抗旱基因 CkDHNl <130〉柠条锦鸡儿中一个新的抗旱基因 CkDHNl <160> 3 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211〉 134 <212〉 PRT _ <213> Caragana korshinskii Kom. <400> 1 Met Ala His His Gin Gin Gly Gly His Gly Asn Lys Gly Val Met Asp 15 l〇 15 Gin lie Lys Glu Lys lie Pro Gly Met Lys Thr Thr Thr Gly Gly His 20 25 30 Thr His Asp Thr Gly Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr 35 40 45 Gly Tyr Gly Gly Thr Ala Gly Gin His His Asp His Gly Gly Ala Gin 50 55 60 Glv Asp His His Tyr Gin Lys Lys Gly Val Val Asp Gin He Lys Asp 65 70 75 80 Lys lie Pro Gly Met His Thr Thr Gly Thr Gly Thr Gly His Gly Thr 85 90 95 Thr Thr Gly Gly Thr Gly His His Gin Asn Ser His Asp Ala Tyr Gly 100 105 110 Ala Gly Gin His His Gin Lys Lys Gly lie Met Asp Lys He Lys Asp 115 120 125 Lys Leu Pro Gly Gly His 130 <210> 2 <211> 748 <212> DNA _ <213> Caragana korshinskii Kom. <400> 2 gaaaatcact cacatccgca tcataacaaa agttcttact tattacacac taaaccaaca 60 aaacttttac gttttcctcc tttgtgcatt ttgtctcgtt gcaatcaatg gcacatcatc 120 agcagggtgg tcatgggaat aaaggggtaa Lggatcagat caaggagaag attcctggaa 180 tgaaaaccac cactggcggt catactcatg acactggtta tggaaccact actggaggag 240 gcacaggaac aggttatggt ggaaccgcag ggcaacacca tgaccatggt ggtgcacagg 300 gagatcatca ttatcagaag aagggggtag tggatcagat caaggacaag attccaggaa 360 tgcacaccac tggcacaggc acggggcatg gaaccactac tgggggaact ggtcatcatc 420
[0002] 序列表.txt aaaattctca tgatgcgtat ggtgctggac aacatcatca gaagaaaggg atcatggata 480 agatcaagga taaacttcca ggaggacact gatatattta tcatcgatgc atacatggat 540 ggatgcatat gattgataat aaatatcgta ctggtgtctc ttttttaact tttcaataat 600 ttgctacata ctttgcgtta tttatgtaac aaatatcttg ttgtcatgtc atgtaagtat 660 agagcatata catacatgta tgttatgctg tatgttattg tttaatttga ttaatgaaat 720 tacatgtatg ttgtacaaaa aaaaaaaa 748 <210> 3 <211> 405 <212> DNA <213> Caragana korshinskii Kom. <400> 3 atggcacatc atcagcaggg tggtcatggg aataaagggg taatggatca gatcaaggag 60 aagattcctg gaatgaaaac caccactggc ggtcatactc atgacactgg ttatggaacc 120 actactggag gaggcacagg aacaggttat ggtggaaccg cagggcaaca ccatgaccat 180 ggtggtgcac agggagatca tcattatcag aagaaggggg tagtggatca gatcaaggac 240 aagattccag gaatgcacac cactggcaca ggcacggggc atggaaccac tactggggga 300 actggtcatc atcaaaattc tcatgatgcg tatggtgctg gacaacatca tcagaagaaa 360 gggatcatgg ataagatcaa ggataaactt ccaggaggac actga 405
【权利要求】
1. 蛋白质，为下述1)或2): 1) 由序列表中SEQ ID NO :1所不的氣基酸序列组成的蛋白质； 2) 将1)或2)所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加，且与植物脱水素相关的由1)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白质在培育抗旱植物中的应用。
3. 编码权利要求1所述蛋白质的基因。
4. 根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因为如下a)-d)中任一所述的基 因： a) 其编码序列是序列表中SEQ ID NO :2的自5'末端第1-748位； b) 其核苷酸序列是序列表中的SEQ ID NO :3 ; c) 在严格条件下与a)或b)的基因杂交，且编码权利要求1所述蛋白的基因； d) 与a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且编码权利要求1所述蛋白的基 因。
5. 权利要求3或4所述基因在培育抗旱植物中的应用。
6. 含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
7. 权利要求6所述的重组表达载体、表达盒或重组菌在培育抗旱植物中的应用。
8. 根据权利要求2、5、7所述的应用，其特征在于：所述植物为柠条锦鸡儿。
9. 一种分离的多核苷酸在植物抗旱基因工程中的应用，其中所述多核苷酸的序列如 SEQ ID No :2 或 SEQ ID No :3 所示。
10. 根据权利要求9的应用，其特征在于：所述植物为柠条锦鸡儿。
【文档编号】C12N1/15GK104086635SQ201410152592
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】杨杞, 李国婧, 王瑞刚, 齐力旺, 张涛, 王颖 申请人:内蒙古农业大学