蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2及其编码的蛋白及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程技术领域，涉及蓝莓耐盐、抗旱L0N2蛋白酶基因VcLON2R实编码的蛋白及应用。
【背景技术】
[0002]干旱和土壤盐渍化等非生物逆境是当今限制作物产量的主要环境因素，植物的生产量大大关系着人们的生活。干旱发生频率较高、范围较广，全球多数国家均遭受干旱的影响，干旱已经成为全球最严重的自然灾害之一，每年干旱造成经济损失达数千亿美元。而土壤盐渍化方面，全世界约有10亿公顷的土地存在不同程度的盐渍化，占世界陆地总面积的约10%，而我国就有近一亿公顷盐渍化土地。因此，提高作物的耐盐和抗旱能力已经成为现代作物育种工作急需解决的关键问题之一。
[0003]利用转基因技术将具有优良性状的基因转入植物中，以此开发高效的转基因新品种具有广阔的应用前景。一些研宄已表明将植物本身及其他植物中耐盐抗旱相关基因转入植物中，可以提高转基因植物的耐盐抗旱能力。
[0004]LON蛋白酶是细胞器中蛋白质质量控制的最主要成分，其可以通过降解损伤或者错误折叠的蛋白来控制蛋白的命运，在多种生理过程中都有着重要的作用。然而，目前大多数研宄主要集中在古生菌、原核生物和动物等非植物体中，在植物体内的研宄相对较少。尤其该基因在植物抗逆(生物胁迫或非生物胁迫)中的功能研宄尚无相关报道，因此，对于植物中LON蛋白酶的研宄具有重要的研宄价值和前景。特别是几乎没有关于蓝莓VcLO酿抗逆等功能方面的研宄。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中的问题，本发明提出一种提高植物耐盐、抗旱性的蓝莓L0N2蛋白酶基因KcZftV么所述KcZftVi基因cDNA核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]本发明提出一种蓝莓耐盐、抗旱基因KcZftVi的克隆方法，提取蓝莓RNA，将其反转录为cDNA，以cDNA为模板，以下述序列为引物，通过RT-PCR获得KcZftVi基因序列，引物序列为:
VcL0N2-F:5，-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’ ；
VcL0N2-R:5’ -TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’ 。
[0007]本发明还提出一种蓝莓耐盐、抗旱基因KcZftVi编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2 所示。
[0008]本发明提出一种权利要求1所述的蓝莓耐盐、抗旱基因KcZftVi在培育耐盐、抗旱植物中的应用。
[0009]进一步的，所述植物是烟草、玉米、水稻、小麦和蓝莓。
[0010]本发明还提出一种植物超表达载体，其含有蓝莓耐盐、抗旱基因VcLON2。
[0011]进一步的，所述植物超表达载体为pSH737-CaMV35S- VcLON2。
[0012]此夕卜，本发明还提出一种提高耐盐性和抗旱性的方法，利用pSH737-CaMV35S- KcZftVi借助于基因工程手段介导植物遗传转化，获得的转基因植物。
[0013]本发明的有益效果:利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR技术，分离与鉴定蓝莓耐盐、抗旱相关基因序列信息，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入本氏烟，经过耐盐、抗旱表型鉴定证明转入KcZftVi基因的植株耐盐力和抗旱力明显提高。
【附图说明】
[0014]图1为KcZftVi基因全长cDNA序列的扩增结果；
图2为实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)分析盐胁迫和干旱胁迫下KcZftVi的表达情况； 图3 -a为大肠杆菌pMD19-T- VcLON2 PCR检测电泳结果；
图3-b为pSH737质粒和目的基因酶切图；
图4为KcZftVi转基因本氏烟植株的PCR鉴定；
图5为转基因本氏烟及野生型在盐胁迫和干旱胁迫处理30 d后的生长情况；
图6为转基因本氏烟及野生型在盐胁迫和干旱胁迫处理30d后的株高、根长、鲜重和干重。
【具体实施方式】
[0015]实施实例1、KcZftVi基因的获得 1.1RNA的提取
(1)取蓝莓组织0.1-0.2 g于研钵中，用液氮研磨成粉末状并快速转移至事先65°C预热的2 mL离心管(离心管中盛有0.9 mL CTAB提取液(20 g/L CTAB、20 g/L PVPUOO mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),25 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl)+30 μ L β-巯基乙醇)中，用涡旋震荡仪震荡均匀；置于65°C水浴锅中预热10 min，期间颠倒混匀3次；
(2)水浴后7000r/min离心5 min，取上清，加入1/3体积的5 mol/L醋酸钾(pH 4.8)混匀后冰浴30 min,再加入700 μ L氯仿/异戊醇(24:1)涡旋混匀；
(3)4°C下12000 r/min离心5 min，取上清，加入500 μ L水饱和酚(pH 5.2)混匀后，再加入500 μ L氯仿/异戊醇(24:1)涡旋混匀；
(4)4°C下12000 r/min离心5 min，取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)祸旋混匀；
(5)4°C下12000 r/min离心5 min，取上清，加入等体积的异丙醇混勾后冰浴沉淀30
min ；
(6)40CT 12000 r/min离心10 min，去上清，加入I mL 75%酒精洗涤沉淀两次；
(7)室温自然干燥10min，适量DEPC水溶解，得到蓝莓RNA，-80°C保存备用。
[0016]1.2 cDNA 的合成
本发明所用的反转录试剂盒为:PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa)0
[0017]I) 10 uL 体系:01igo dT Primer (50 μ Μ) I μ L dNTP Mixture (10 mM each)I μ L Total RNA <5 μ g RNase free dH20Up to 10 μ L
2)65°C变性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:
上述变性后反应液10 UL
RNase free dH204.5 μ L
5 X PrimeScript Buffer4 μ L
RNase Inhibitor (40 U/μ L)0.5 μ L
PrimeScript RTase (200 U/μ L )I μ L
3)轻轻混匀步骤2得到的反应液，42°C反应Ih ;
4)70°C保温15min，使酶失活，冰上放置冷却，-20 °C保存备用。
[0018]1.3 cDNA 的克隆
1.3.1完整ORF预测及引物设计
根据葡萄的LO纖因cDNA序列(XM_002282621.2)对NCBI中的蓝莓EST库进行比对分析，获得一系列同源 EST 序列(SRR353286.100950.2、SRR353286.98047.2、SRR353287.39645.2、SRR353282.58737.2、SRR353291.8534.2、SRR353285.2047.2、SRR353283.12456.2、SRR353285.54358.2)。拼接序列，经基因预测，然后用软件 ORF Finder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测完整 0RF。
[0019]在ORF 序列两侧设计上游引物 VcL0N2-F:5’-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’ (SEQ IDN0.3)和下游引物 VcL0N2-R:5’ -TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’ (SEQ ID N0.4)，用蓝莓cDNA (由步骤1.2合成的)进行RT-PCR。
[0020]1.3.2 PCR 扩增 KcZftVJ PCR反应体系(25 yL)
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus)2.5 μ L
dNTP Mixture (各 2.5 mM)2.0 μ L
SEQ ID N0.31.0 yL
SEQ ID N0.41.0 yL
蓝莓cDNA (由步骤1.2合成的)l.0yL
LA Taq (5 U/ μ L)0.25 μ L
ddH2017.25 μ L
1.3.3 PCR 扩增程序:94°C 4 min ；94°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 3 min，30 个循环；72°C 15 min ;4°C保温。
[0021]1.3.4扩增得到该基因的ORF序列，回收扩增产物，并克隆到pMD19_T载体，筛选阳性克隆，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0022]1.3.5得到包含整个编码框的VcLon2 cDNA序列，全长2667 bp，如图1所示。测序结果与预测的ORF进行比对，序列相似度为98%。
[0023]1.4基因表达分析(qRT-PCR)
1.4.2盐胁迫和干旱胁迫下RNA的提取
将2年生的蓝莓苗‘戴安娜’和‘泽西’从土中取出，洗去根上的泥土，预培养I周后，以浸在Hogland营养液中为对照组，将苗分别浸在含200 mM NaCl (盐胁迫)和2% PEG6000(干旱胁迫)的Hogland营养液中处理24 h，取叶片提取RNA，提取方法与实施例1中的1.1RNA的提取方法相同，在此不再赘述。
[0024]1.4.3 cDNA 的合成
合成方法与实施例1中的1.2 cDNA的合成方法相同，在此不赘述。
[0025]1.4.4 PCR 反应以cDNA为模板，引物为
VcL0N2-DL-F:5’ -CCTTTCAAAGGTTGTATTTGTGGC-3’ (SEQ ID N0.5)
VcL0N2-DL-R:5’ - AACTCGTGGAATGAGATGTCGC-3’ (SEQ ID N0.6)qRT-PCR反应体系:
SEQ ID N0.5 (10 μΜ)0.4 μ L
SEQ ID N0.6 (10 μ Μ)0.4 μ L
cDNA 模板1.0 μ L
SYBR Premix Ex Taq II (Tli ENaseH Plus), ROX plus 10 μ LddH208.2 μ L
PCR程序
用 Applied B1systems 7500 Fast Real-Time PCR System 进行 qRT-PCR，米用两步法 PCR 扩增标准程序:95°C 30 s ； 95°C 5 s，58°C 35 s，总共 40 个循环；95°C 15 sec，58°C I min, 95°C 15 sec进行qRT-PCR检测，并使用2_Λ AGt法进行计算分析。
[0026]结果表明:参考图2在盐胁迫和干旱胁迫下蓝莓‘戴安娜’和‘泽西’的VcLON2敦达量均上调10倍以上，这说明其可能有利于提高植物对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性。
[0027]实施例2、植株