一个与小麦垂直抗叶锈相关的TaPDRABCG基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及小麦7?/?/?/?!?基因及其编码的蛋白与其 在小麦抗叶锈性中的作用，通过VIGS技术将基因沉默，反向证明其与小麦抗叶 锈性相关。
【背景技术】
[0002] 由小麦叶锈病菌iriiiciflia)引起的小麦叶锈病是小麦的主要病害之 一，严重发生时可造成45%以上的产量损失（Kolmer J A，1996)。在我国，小麦叶锈病曾几 度大面积流行，造成小麦严重减产。抗病品种的利用是控制该病害的有效方法，揭示小麦抗 叶锈性表达机制，对于有效提高小麦的抗叶锈性具有重要的意义。
[0003] ABC 转运蛋白（ATP-binding cassette transporters)是一大类跨膜蛋白，广泛 存在于自然界生物体中，是生物体中最大的蛋白家族之一（Higgins C F，1992)。最典型 的ABC转运蛋白包括：多药抗性蛋白（multidrug resistance, MDR)，多药抗性相关蛋白 (multidrug resistance-associated protein, MRP),多向耐药蛋白（pleiotropic drug resistance, PDR)，其中PDR类仅在植物与真菌中被发现，决定着对一大类从功能、结构上 不相关的有毒物质的抗性（Kretzschmar T et al，2011)，该类蛋白可以参与植物防卫反应 (Jasinski M et al，2001 ;Stukkens Y et al，2005)，与抗灰霉病、抗细菌性病害、抗小麦赤 霉病密切相关（Stukkens Y et al，2005 ;Bultreys A et al，2009 ;Mitterbauer R et al， 2003 ;尚毅等，2009)。一些PDR类ABC转运蛋白可以受病原物产生的激发子诱导，产生抗 菌、抗毒素物质（Sasabe M et al，2002 ;Hayashi M et al，2002)，也有一些则转运抗真菌成 分（Kang J U et al，2010;Jasinski M et al，2001)或有毒物质（Mitterbauer R et al， 2003)。转运蛋白ABCG是植物免疫系统中的重要组成之一，这些蛋白参与许多次生代谢产 物在细胞中的转运（Banasiak J et al，2013;Wang Y et al，2013)。
[0004] 关于小麦中PDR类ABC转运蛋白的报道，至今只发现了一个决定等位基因对 小麦叶锈、条锈和白粉病持久抗病性（Krattinger S G et al，2009)的ABCG转运蛋白。本 发明中提到的7?/?/?沒基因编码的PDR类ABC转运蛋白与TcLr34中的转运蛋白的相似 性仅有47%，而且其来源于TcLrl9,说明7?/?/?沒基因是小麦中一个新的ABC基因。分离 与小麦抗叶锈相关的ABC转运基因，探明其功能对丰富小麦抗叶锈分子机制理论及开辟新 的抗病途径具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供一个从小麦中分离得到的新PDR类ABC转运基因， 命名为7?/?/?汝基因。
[0006] 本发明的第二个目的在于通过VIGS技术证明7?/?/?沒基因与小麦叶锈病的抗 性相关。
[0007] 一个与抗小麦叶锈病相关的I3DR类ABC转运基因7?/?/?汝的cDNA序列如SEQ ID No. 2所示，7?/?/?汝7(?的DNA序列如SEQ ID No. 3所示。小麦抗叶锈病相关基因7?/?/?汝7(? 编码的蛋白质，具有序列表中的SEQ ID No. 4所述的氣基酸序列。
[0008] 本发明是通过应用cDNA-AFLP技术，从mRNA表达水平研究抗小麦叶锈病的TcLrl9 和感病对照Thatcher与小麦叶锈菌05-21-116③（THTS)互作时基因表达的差异，分离得到 长为218 bp的PDR类ABC转运基因的片段，首先通过电子克隆技术对该片段进行延伸得到 长477 bp的序列，其次利用RACE技术，分别设计3' RACE和5' RACE引物，进行扩增，得 到一个长为4359 bp的拼接序列，对该序列进行cDNA和DNA的验证，最终在cDNA中扩增出 4182 bp的片段，在DNA中扩增出6452 bp的片段。利用大麦条纹花叶病毒(fere# mosaic ri/YAs^BSMV)介导的基因沉默技术开展了该基因的功能验证，证明该基因与小麦的 小种转化抗叶锈性相关。从而获得了一个新的与抗叶锈相关的ABCG基因 --TaPDMBCG。
[0009] 本发明的有益效果是：本发明获得的小麦PDR类ABC转运基因7?/?/?说i?通过病 毒介导的基因沉默试验，发现原本抗小麦叶锈病的材料出现感病现象，证明参 与了小麦对接种叶锈病生理小种的防御反应，是一个抗小麦叶锈病的相关基因。本发明中 基因的克隆及其在小麦抗叶锈中的作用，对于丰富抗叶锈分子机制理论具有重 要意义，对抗病育种的实践工作具有指导意义。
【附图说明】
[0010] 图1是从TcLrl9和Thatcher中获得的差异表达的PDR类ABC转运基因的片段。 箭头表示差异片段；1-4分别为：未接菌Thatcher、接菌Thatcher、未接菌TcLrl9、接菌 TcLrl9〇
[0011] 图2是7?/?/?汝电子克隆的扩增结果。M :DL2000 Marker ;1 :在小麦TcLrl9中 电子克隆的片段。
[0012] 图3是以电子克隆的序列为靶序列进行Y RACE的扩增结果，即7?/?/?说i?的 3' RACE的扩增结果。M :DL2000 Marker ;1 # RACE的扩增片段。
[0013] 图4是以电子克隆的序列为靶序列进行Y RACE的扩增结果，即7?/?/?说i?的 5' RACE的扩增结果。M :DL2000 Marker ;1 # RACE的扩增片段。
[0014] 图5是将3' RACE和5' RACE的序列进行拼接的模式图。
[0015] 图6是以3' RACE和5' RACE拼接的序列为靶序列设计引物在小麦TcLrl9中 进行cDNA和DNA扩增的结果，即7?/?/?汝的cDNA和DNA扩增的结果。M : λ DNA/Hind III Marker ;C :cDNA中的扩增片段；D :DNA中的扩增片段。
[0016] 图7是从基因7?/?/?说i?中选取的沉默片段的扩增结果图。M :DL2000 Marker ; 1-4均是在TcLrl9中扩增的沉默片段。
[0017] 图8是从基因中选取的沉默片段连接到Y载体上双酶切验证的结果 图。M :DL2000 Marker ;1 : γ :TaPDRABCG 双酶切的结果。
[0018] 图 9 是 α、β、γ :〇〇、γ :PDS 和 Y :TaPDRABCG 线性化后的结果。M :DL2000 Marker ;1-5 分别为 α、β、γ :〇〇、γ :PDS、Y :TaPDRABCG。
[0019] 图 10 是 α、β、γ :〇〇、γ :PDS 和 Y :TaPDRABCG 体外转录后的结果。M :DL2000 Marker ;1-5 分别为 α、β、γ :〇〇、γ :PDS、Y :TaPDRABCG。
[0020] 图11是7?/?/?说i?在抗小麦叶锈病的TcLrl9上进行功能验证的结果图。CK :既 没有接种病毒又没有接种小麦叶锈菌的TcLrl9 ;19+ :只接种小麦叶锈菌THTS的TcLrl9 ; BSMV = OO :接种病毒空载体和小麦叶锈菌THTS的TcLr 19 ;BSMV:H)S :接种携带沉默/??基因 的病毒载体和小麦叶锈菌THTS的TcLrl9 ;BSMV:ABC :接种携带沉默基因的病毒 载体和小麦叶锈菌THTS的TcLrl9 ;Tc+ :只接种小麦叶锈菌THTS的感病对照Thatcher。
【具体实施方式】
[0021] 实施例(一)、基因克隆 1. TcLrl9和Thatcher中PDR类ABC转运基因差异片段的获得 利用cDNA-AFLP技术，从mRNA表达水平研究抗小麦叶锈病的TcLr 19和感病对照 Thatcher与小麦叶锈菌05-21-116③（THTS)互作时基因表达的差异，通过对功能已知的基 因分析，分离得到长为218 bp的PDR类ABC转运基因的片段（图1)。
[0022] 2. 7?/?/?汝的电子克隆 2.1引物设计 根据218 bp片段设计电子克隆引物19F :5' - GCCCCTGAAACGTACAACTT - 3'和19R : 5' - ACGGAAGAAGAGCGTCATTG - 3'。以小麦 TcLrl9 的 cDNA 为模板