专利名称：一种辅助选育抗条锈病小麦品种的方法及其专用pcr试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种辅助选育抗条锈病小麦品种的方法及其专用PCR试剂。
背景技术：
小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)引起的一种气传性叶部病害，该病发生后将影响植株发育和麦粒灌浆，进而严重影响小麦产量和品质，全世界有4300万hm2易发区，占小麦总种植面积的19.4% (http://www. cimmyt. orR/aRricdb/fao/Pefault. aspx)。我国是世界上最大的小麦条锈病流行区，约2000万 hm2 (Stubbs，1988 ；Wan等，2004，2007)，在冷凉和高海拔地区尤为严重。20世纪50年代以来，我国先后出现8次条锈病大流行，其中1950、1964、1990和2002年四次大流行发生面积最大、危害最重，前两次发病面积达2亿亩以上，后两次发病1. 1亿亩以上，分别损失小麦 600、320、180和130万吨，给小麦生产带来巨大损失(李振岐等，1989 ；李师默，2001 ；Li等， 2000 ；Wan等，2004)。最近几年由于气候变化、粉锈宁的普遍使用等原因，其相对重要性有所下降，2004-09我国条锈病每年平均发生面积约0. 63亿亩，但最大年份也有1亿亩左右 (张跃进等，2005-2009)，而且随着全球气候变暖、气候变化异常，小麦条锈病很可能再次跃升为主要病害，从而严重威胁我国小麦的高产稳产。目前国际上正式命名的小麦条锈病抗性基因共51个，分布于48个染色体位点，即 Yrl-Yr48 (Mcintosh RA等，2010)。这些抗条锈病基因大多属于具有小种专化性的苗期抗病基因，苗期抗病基因由于其对条锈病害的高抗深受育种家喜爱，近几十年来小麦群体的抗性基因大多数为小种专化性抗性，但大面积种植抗病基因单一的品种，会加速病原菌小种的定向选择，结果导致抗病品种在生产上大面积应用几年之后“丧失”原有的抗性，失去应用价值(庄巧生1996)。历史上，由于大面积种植的“洛类”和“繁6”衍生系，导致新致病类群条中31号(CYR31)和条中32号(CYR3》生理小种出现并迅速跃升为优势小种，从而引起了 2002年全国小麦条锈病大流行。认识到单一抗病基因的潜在危害之后，育种学家和植物病理学家希望通过多基因聚合、基因布局和多系品种等方法来延长苗期抗病基因的抗性寿命。如果能将抵抗不同生理小种的抗病基因聚合到一个品种中，那么该品种就具有抵抗多种生理小种的能力，即具有多抗性，这样就不容易因致病小种的变化而丧失抗性，从而使抗性持续时间延长。要实现这一目的，一方面需要丰富的抗源，另一方面要运用便捷的方法更有效的实现基因聚合。目前在我国仍然保持条锈病抗性的主效基因有扑5、YrlO, Yrl5, Yr24, Yr26和ft~ZH84等少数几个，因此发掘新的抗源迫在眉睫，同时借助分子标记辅助抗病育种，从而更有效的利用抗源也异常重要。分子标记辅助选择是借助与目标性状紧密连锁或者共分离的分子标记对后代株系进行目标基因或者染色体区段的筛选，进而在早代即可获得含有目标基因的优良单株， 提高育种效率(方宣钧等，2001)。利用分子标记辅助抗病育种可减去常规抗病鉴定工作， 进而克服由于发病不充分或者鉴定不准确带来的选择错误，同时，该技术使检测多个抗病基因导入工作成为可能，极大地提高基因聚合的效率。目前，分子标记辅助选择在世界小麦主产国的抗病育种中已取得了一些可喜成果。如澳大利亚西部已将涉及锈病抗性基因在内的42个性状或基因，通过分子标记辅助选择技术对其进行品种选育和种质改良(Caki等， 2008)；澳大利亚南部利用分子标记和DH技术，已将小麦品种Armuello里的抗锈和优质基因成功地转入感病品系Mylet中(Kuche等，2008)；美国在“将小麦基因应用于实践”项目的支持下，通过分子标记辅助回交选育法，已将27个抗病、抗虫基因以及20个优质等位基因有效地转入美国小麦生产区的180个品系中(Sorrell等，2007)，并且位于戴维斯的加利福尼亚大学利用分子标记辅助技术已将条锈病抗性基因扑17和叶锈病抗性基因Lr37成功转入小麦品种I^atwin中(Hospita等，2009)；国际玉米小麦改良中心(CIMMTY)利用分子标记辅助选择和常规育种相结合方法，已将25个不同的抗病虫、优质和农艺性状优良基因进行聚合，使得小麦品种得以改良(Willia等，2007)；加拿大已获得一些锈病、黑穗病、赤霉病、优质和穗发芽等性状的分子标记，目前，通过分子标记辅助选择，已有2个优质小麦品种得以推广，即Lillian和Goodeve (DePauw等，2005，2009)，而病害分子标记的利用工作处于进行中。综上所述，分子标记(包括RAPD、RFLP、SSR和RGAP)辅助选择在全球小麦抗病育种中已得以广泛应用，其中SSR标记由于其共显性、重复性高和技术简单等优点，较适合分子标记辅助育种。我国虽有一些相关研究，但具体应用成效的报道较少。李在峰等Q006)利用国内条锈病流行小种CYR32对周8425B进行苗期抗性鉴定，结果发现周8425B携带一对表现中抗的显性抗病基因，进而利用SSR标记将其定位在7BL染色体上，定名为％·ΖΗ84，与该基因紧密连锁的分子标记包括Xgwm577、Xwmc276、Xwmc273、Xcfa2040、Xbarc32、Xbarc 182 和 Xwmc526，遗传距离为1. 4cM到12. OcM，其中在YrZH84两侧最近的SSR标记为)(cfa2040-7B 和Xbarc32-7B，遗传距离分别为1. 4cM和4. 8cM。殷贵鸿等Q009)利用RGAP标记，通过基于标记基因型和表型选择的分离群体分组分析法(BSA)，获得了与小麦抗条锈病基因％·ΖΗ84 连锁更紧密的RGA标记)Crga-I，与ft~ZH84的连锁距离为0. ScM0任妍等Q010)最近利用国内条锈病流行小种CYR32对周8425B进行苗期抗性鉴定，结果发现周8425B携带一个表现高抗的新的显性抗条锈病基因，进而利用SSR标记将其定位在IB染色体上，暂定名为 Yrcaas，与该基因紧密连锁的分子标记包括H20、Xbarc8、Xgwm582、Xgwml31和Xwmc216，遗传距离为0. 6cM到16. 8cM，其中在YrZH84两侧最近的SSR标记为)(barc8和Xgwm582，遗传距离分别为0. 6cM禾口 0. 7cM，如图1所示。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种辅助选育抗条锈病植物的引物。本发明提供的引物，为如下1)-4)中任意一种1)所示引物由引物对l()(barc3》、引物对2 0(cfa2040)、引物对3 0(barc8)、引物对4( 碰582)和引物对5(H20)组成，引物序列详见表1 ；2)所示引物由引物对1、引物对2和如下A-C中的任意两种组成=A 引物对3、B 引物对4和C 引物对5 ；3)所示引物由引物对1、引物对2组成；4)所示引物由如下A-C中的任意两种组成=A 引物对3、B 引物对4和C 引物对5 ；所述引物对1中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述引物对2中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述引物对3中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物对4中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列7，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述引物对5中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列9，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列10。本发明的另一个目的是提供辅助选育抗条锈病植物的PCR试剂。本发明提供的如下1)-4)中任一所示的辅助选育抗条锈病植物的PCR试剂1)所示PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4和PCR试剂5 组成；2)所示PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2和如下A-C中的任意两种组成A =PCR 试剂3, B =PCR试剂4和C =PCR试剂5 ； 3)所示PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2组成；4)所示PCR试剂由如下A-C中的任意两种组成A :PCR试剂3、B :PCR试剂4和C PCR试剂5 ；所述PCR试剂1由所述引物对1、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂2由所述引物对2、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂3由所述引物对3、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂4由所述引物对4、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂5由所述引物对5、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所有所述引物对中各引物在其所在的PCR试剂中的终浓度均为4pmol。所述PCR试剂1、所述PCR试剂2、所述PCR试剂3和所述PCR试剂4中所述dNTP 中的每一种在其所在的PCR试剂中的终浓度均为0. 2mM ；所述PCR试剂5中的dNTP中的每一种的终浓度为0. 15 μ M ；所有所述DNA聚合酶在其所在的PCR试剂中的终浓度为0. 067U/ μ L。所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striifirmis f. sp. tritici)， 所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)小种条中 32 号。本发明的第三个目的是辅助选育抗条锈病植物的试剂盒。本发明提供的如下1)-4)中任一所示辅助选育抗条锈病植物的试剂盒1)所示试剂盒为含有所述1)所示PCR试剂的试剂盒；2)所示试剂盒为含有所述2)所示PCR试剂的试剂盒；3)所示试剂盒为含有所述3)所示PCR试剂的试剂盒；4)所示试剂盒为含有所述4)所示PCR试剂的试剂盒。
所述的引物或所述的PCR试剂或所述试剂盒在植物抗病育种中的应用也是本发明保护的范围；或所述的引物或所述的PCR试剂或所述试剂盒在辅助选育抗条锈病植物中的应用也是本发明保护的范围，所述植物具体为小麦；所述小麦的亲本为周麦22和周麦M。所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)，所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)具体为条中32号生理小种。本发明的第四个目的是提供一种鉴别或辅助鉴别抗条锈病小麦的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤用所述1)所示的引物或所述1)所示PCR试剂或所述1)所示试剂盒中的所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4和所述引物对5分别对待测小麦进行PCR 扩增，检测PCR扩增产物；若PCR扩增的产物为如下A)_E)中的5种，则所述待测小麦为或候选为抗条锈病小麦；若PCR扩增的产物不为如下A)-E)中的5种，则所述待测小麦为或候选为非抗条
锈病小麦A)所述引物对1扩增得到200bp的PCR产物；B)所述引物对2扩增得到150bp的PCR产物；C)所述引物对3扩增得到560bp的PCR产物；D)所述引物对4扩增得到350bp的PCR产物；E)所述引物对5扩增得到1598bp的PCR产物。所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3和所述引物对4进行PCR扩增时的退火温度均为55°C，退火时间均为Imin ；所述引物对5进行PCR扩增时的退火温度为60°C，退火时间为45S ；所述检测采用琼脂糖凝胶电泳。本发明的第五个目的是提供一种辅助选育高产和/或抗条锈病小麦的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)以周麦M和周麦22进行杂交，得到F1代；2)将步骤1)得到的F1代小麦进行自交，得到&代小麦；3)用所述1)所示的引物或所述1)所示PCR试剂或1)所示试剂盒中的所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4和所述引物对5分别对步骤2、得到的F2 代小麦进行PCR扩增，检测PCR扩增产物；若PCR扩增的产物为如下A)_E)中的5种，则所述待测小麦为或候选为抗条锈病小麦；若PCR扩增的产物不为如下A)-E)中的5种，则所述待测小麦为或候选为非抗条
锈病小麦A)所述引物对1扩增得到200bp的PCR产物；B)所述引物对2扩增得到150bp的PCR产物；C)所述引物对3扩增得到560bp的PCR产物；D)所述引物对4扩增得到350bp的PCR产物；
E)所述引物对5扩增得到1598bp的PCR产物。在所述步骤幻后，还包括如下步骤4)将步骤幻得到的候选为抗条锈病&代小麦进行自交得到F3代小麦，将所述& 代小麦自交得到F4代小麦，将所述F4代小麦自交得到F5代小麦，将所述F5代小麦自交得到 F6代小麦；5)用1)所示的引物或1)所示PCR试剂或1)所示试剂盒对步骤4)得到的F6代小麦进行PCR扩增，得到PCR产物，检测PCR扩增产物，若PCR扩增的产物为如下A) -E)所示，则所述F2代小麦为或候选为抗条锈病F6代小麦；若PCR扩增的产物不为如下A) -E)所示，则所述F2代小麦为或候选为非抗条锈病 F6代小麦A)所述引物对1扩增得到200bp的PCR产物；B)所述引物对2扩增得到150bp的PCR产物；C)所述引物对3扩增得到560bp的PCR产物；D)所述引物对4扩增得到350bp的PCR产物；E)所述引物对5扩增得到1598bp的PCR产物；6)将所述候选为抗条锈病F6代小麦进行自交，得到F7代小麦，筛选产量高于周麦 22的F7代小麦，即为高产、抗条锈病小麦；步骤3)中的所述PCR扩增，均以F2代小麦的基因组DNA为模板；步骤5)中的所述PCR扩增，均以F6代小麦的基因组DNA为模板；所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)， 所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)小种条中 32 号； 所述检测均采用琼脂糖凝胶电泳。所述高产、抗条锈病小麦的产量与周麦22相比，提高的比例不低于5%。本发明的实验证明，提供的用于辅助筛选抗条锈病小麦的分子标记有5个，分别是Xcfa2040、Xbarc32, Xbarc8, Xgwm582和H20。本发明提供了一种分子标记辅助抗病育种的方法，该方法与常规育种的过程一致，不同的是，在双亲选配后，首先利用上述引物对其进行分子检测，进而确定哪些组合可以利用该方法；对这些适用的组合，在F2时，用所述 2个SSR标记对育种家选择的候选单株分别进行PCR扩增，检测扩增产物，扩增产物中有上述所有引物对应的目的片段时，该单株为含有上述两个抗条锈病基因的候选单株，仅将这些单株用于下一步的育种工作；在F6时，由育种家选择之后，再次利用所述5对引物对基本纯合的株系进行分子检测，从而验证所选株系是否仍然含有上述两个抗条锈病基因，保留含有抗条锈基因的株系，进一步通过综合农艺性状评比，进而得到农艺性状优良并且高抗条锈病的高代品系，最终获得品种。
图1为5个SSR标记与ftxaas基因的连锁2为小麦品种存麦7号的系谱
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图3为SSR引物对F2代植株和对F6株系的扩增结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的引物的序列如下表1所示，为人工合成实施例1、小麦材料周8425B中一个新抗条锈基因ftxaas的发现及其SSR标记的
获得一、表现型的获得及其群体苗期表现情况用周8425B与Avocet S杂交，获得F1群体，将F1群体自交得到F2群体，F2群体为 586个单株。用我国目前的条锈病流行小种条中32号生理小种对实验材料进行接种鉴定， 结果表明周8425B苗期表现为高抗(反应型IT = 0 ；)到免疫(IT = 0) ,AvocetS苗期表现为高感(IT = 4)，F1群体均表现为高抗(IT = O ；)，F2群体中439株为抗病单株，147株为感病单株，表明周8425B中携带1对高抗条锈病的显性基因。依据苗期鉴定结果选用10 个极抗病单株和10个极感病单株分别将其DNA进行等量混合组成抗病池和感病池。二、专用引物对的获得选用655对SSR引物对亲本进行多态性筛选，所有引物合成均由北京奥科生物公司完成。结果表明位于IB染色体上的3个标记H20、)(barC8和Xgwm582在亲本和抗感池之间均有多态性。初步表明这些标记与抗条锈病基因arcaas)连锁。三、连锁图谱的获得及其来源用IB上的3个标记H20、Xbarc8和Xgwm582对586个F2单株分别进行扩增，获得群体基因型，所得数据利用作图软件MapMaker 3. 0及Map Manager QTX20进行连锁分析，结果显示这5个标记均与抗条锈病基因ftxaas连锁，其中距ftxaas两侧最近的标记为 Xbarc8和Xgwm582，遗传距离分别为9. 5cM和9. 6cM，见图1所示。2个SSR标记(即Xbarc8和Xgwm582)的PCR反应体系均为15 μ 1，即8. 8 μ 1无菌水，1. 5 μ 110 XPCR buffer(汇天东方)，0. 3μ 1 IOmM dNTPs (汇天东方)，每条引物 4pmol， Taq DNA聚合酶0. 067U/ μ L (汇天东方)，20ng模板DNA ；反应程序是94°C预变性5分钟， 每个循环94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸lmin，;35个循环，最后72°C延伸IOmin ； PCR产物保存于4°C ；每份扩增产物加入3μ1变性载样指示剂[98%无离子甲酰胺，IOmM EDTA (ρΗ 8.0)，0. 二甲苯青，0. 溴酚蓝]，95°C变性10分钟。在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中点样5 μ 1进行电泳分离。银染显影STS 标记 Η20 的反应体系为 20 μ 1，含 10XPCR buffer 2 μ 1，dNTP (A、T、 C、G)各 ΖΟΟμπιοΙΓ1，每条引物 4pmol，Taq DNA聚合酶(TaKaRa)O. 067U/μ L，模板DNA 50ng ； PCR程序为94°C预变性5min ；94°C变性45s，60°C退火45s，72°C延伸1. 5min，38个循环； 72°C延伸IOmin ；PCR扩增产物以1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，缓冲液体系为IXTAE溶液，220V电压电泳lOmin，溴化乙锭染色。3个标记为H20、Xbarc8和Xgwm582，上述3个标记对应的引物对如表1所示。标记Xbarc32和)(cfa2040为检测抗条锈病基因ft~ZH84的专用标记。表1检测苗期抗条锈病基因ft~ZH84和ftxaas所需的引物序列表
权利要求
1.一种辅助选育抗条锈病植物的引物，为如下1)-4)中任意一种1)所示引物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4和引物对5组成；2)所示引物由引物对1、引物对2和如下A-C中的任意两种组成A引物对3、B 引物对4和C 引物对5 ；3)所示引物由引物对1、引物对2组成；4)所示引物由如下A-C中的任意两种组成A引物对3、B 引物对4和C 引物对5 ； 所述引物对1中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列1，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述引物对2中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述引物对3中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列5，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述引物对4中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列7，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述引物对5中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列9，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列10。
2.如下1)-4)中任一所示的辅助选育抗条锈病植物的PCR试剂1)所示PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2、PCR试剂3、PCR试剂4和PCR试剂5组成；2)所示PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2和如下A-C中的任意两种组成A=PCR试剂 3、B =PCR试剂4和C =PCR试剂5 ；3)所示PCR试剂由PCR试剂1、PCR试剂2组成；4)所示PCR试剂由如下A-C中的任意两种组成A=PCR试剂3、B =PCR试剂4和C =PCR 试剂5 ；所述PCR试剂1由权利要求1所述引物中的所述引物对1、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂2由权利要求1所述引物中的所述引物对2、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂3由权利要求1所述引物中的所述引物对3、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂4由权利要求1所述引物中的所述引物对4、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所述PCR试剂5由权利要求1所述引物中的所述引物对5、dNTP、DNA聚合酶和PCR扩增缓冲液组成；所有所述引物对中各引物在其所在的PCR试剂中的浓度均为4pmol。
3.根据权利要求1或2所述的PCR试剂，其特征在于所述PCR试剂1、所述PCR试剂2、所述PCR试剂3和所述PCR试剂4中所述dNTP中的每一种在其所在的PCR试剂中的终浓度均为0. 2mM ；所述PCR试剂5中的dNTP中的每一种的终浓度为0. 15 μ M ； 所有所述DNA聚合酶在其所在的PCR试剂中的终浓度为0. 067U/ μ L。
4.根据权利要求2-3中任一所述的PCR试剂，其特征在于所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)，所述小麦条锈菌具体为条中32号生理小种。
5.如下1)-4)中任一所示辅助选育抗条锈病植物的试剂盒1)所示试剂盒为含有权利要求2-4所述PCR试剂中的所述1)所示PCR试剂的试剂盒；2)所示试剂盒为含有权利要求2-4所述PCR试剂中的所述幻所示PCR试剂的试剂盒；3)所示试剂盒为含有权利要求2-4所述PCR试剂中的所述幻所示PCR试剂的试剂盒；4)所示试剂盒为含有权利要求2-4所述PCR试剂中的所述4)所示PCR试剂的试剂盒。
6.权利要求1所述的引物或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂或权利要求5所述试剂盒在植物抗病育种中的应用；或权利要求1所述的引物或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂或权利要求5所述试剂盒在辅助选育抗条锈病植物中的应用，所述植物具体为小麦；所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)，所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)小种条中 32 号。
7.一种鉴别或辅助鉴别抗条锈病小麦的方法，包括如下步骤用权利要求1所述引物中的所述1)所示的引物或权利要求2-4中任一所述的PCR试剂中的所述1)所示PCR试剂或权利要求5所述的试剂盒中1)所示试剂盒中的所述引物对 1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4和所述引物对5分别对待测小麦进行PCR扩增，检测PCR扩增产物；若PCR扩增的产物为如下A)-E)中的5种，则所述待测小麦为或候选为抗条锈病小麦；若PCR扩增的产物不为如下A)-E)中的5种，则所述待测小麦为或候选为非抗条锈病小麦A)所述引物对1扩增得到200bp的PCR产物；B)所述引物对2扩增得到150bp的PCR产物；C)所述引物对3扩增得到560bp的PCR产物；D)所述引物对4扩增得到350bp的PCR产物；E)所述引物对5扩增得到1598bp的PCR产物。
8.根据权利要求7中任一所述的方法，其特征在于所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3和所述引物对4进行PCR扩增时的退火温度均为55°C，退火时间均为Imin ；所述引物对5进行PCR扩增时的退火温度为60°C，退火时间为45S ；所述检测采用琼脂糖凝胶电泳。
9.一种选育或辅助选育抗条锈病和/或高产小麦的方法，包括如下步骤1)以周麦M小麦和周麦22进行杂交，得到F1代；2)将步骤1)得到的F1代小麦进行自交，得到F2代小麦；3)用权利要求1所述的引物中的1)所示的引物或权利要求2-4中任一一种所述PCR 试剂中的1)所示PCR试剂或权利要求5所述试剂盒中1)所示试剂盒中的所述引物对1、所述引物对2、所述引物对3、所述引物对4和所述引物对5分别对步骤2~)得到的F2代小麦进行PCR扩增，检测PCR扩增产物；若PCR扩增的产物为如下A) -E)中的5种，则所述F2代小麦为或候选为抗条锈病F2代小麦；若PCR扩增的产物不为如下A) -E)中的5种，则所述F2代小麦为或候选为非抗条锈病 F2代小麦A)所述引物对1扩增得到200bp的PCR产物；B)所述引物对2扩增得到150bp的PCR产物；C)所述引物对3扩增得到560bp的PCR产物；D)所述引物对4扩增得到350bp的PCR产物；E)所述引物对5扩增得到1598bp的PCR产物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于在所述步骤幻后，还包括如下步骤4)将步骤幻得到的候选为抗条锈病F2代小麦进行自交得到F3代小麦，将所述F3代小麦自交得到F4代小麦，将所述F4代小麦自交得到F5代小麦，将所述F5代小麦自交得到F6 代小麦；5)用1)所示的引物或1)所示PCR试剂或1)所示试剂盒对步骤4)得到的F6代小麦进行PCR扩增，得到PCR产物，检测PCR扩增产物；若PCR扩增的产物为如下A) -E)中的5种，则所述F6代小麦为或候选为抗条锈病F6代小麦；若PCR扩增的产物不为如下A) -E)中的5种，则所述F6代小麦为或候选为非抗条锈病 F6代小麦A)所述引物对1扩增得到200bp的PCR产物；B)所述引物对2扩增得到150bp的PCR产物；C)所述引物对3扩增得到560bp的PCR产物；D)所述引物对4扩增得到350bp的PCR产物；E)所述引物对5扩增得到1598bp的PCR产物；6)将所述候选为抗条锈病F6代小麦进行自交，得到F7代小麦，筛选产量高于周麦22的 F7代小麦，即为高产、抗条锈病小麦；步骤幻中的所述PCR扩增，均以F2代小麦的基因组DNA为模板；步骤幻中的所述PCR扩增，均以F6代小麦的基因组DNA为模板；所述条锈病的病原菌为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)，所述小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)具体为小麦条锈菌(Puccinia striiformis f. sp. tritici)小种条中 32 号；所述检测均采用琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
本发明公开了一种利用分子标记辅助筛选抗条锈病小麦的方法及其专用引物。本发明提供的辅助筛选抗条锈病小麦的引物对序列见引物序列表(表1)。本发明提供的辅助筛选抗条锈病小麦的方法在常规育种为基础上进行的，并不影响育种家的选育过程，只是在F2和F6代时，经育种家选择之后，利用所述引物对候选单株进行分子标记检测，仅保留含有所述两个抗条锈病基因的单株，从而帮助育种家更高效的选出含有多个抗条锈病基因的优良株系，提高所选株系抗病的持久性。本发明在小麦品种周8425B中发现了一个新的抗条锈病基因Yrcaas及其专用引物，该基因位于小麦1B染色体上，定位于SSR标记Xbarc8和Xgwm582之间，这两个标记可用于辅助抗条锈病育种工作中。本发明的抗病基因的专用引物将在小麦抗病育种中发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK102229986SQ20111013690
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者任妍, 何中虎, 夏先春, 郑天存, 郑继东, 郑继周 申请人:中国农业科学院作物科学研究所, 河南省天存小麦改良技术研究所