一种与小麦叶锈病抗性相关的类甜蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与小麦叶锈病抗性相关的类甜蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 小麦Linn.)作为重要的粮食作物，在食品工业和农业生产 中占有重要地位（曹亚萍，2008)。小麦叶锈病在中国各大产麦区均普遍发生，是影响小麦 产量和品质的重要病害之一（Bolton et al.，2008)。近年植物基因工程技术发展迅速，以 抗病基因和各类抗病相关基因的克隆和转化为核心的分子育种途径已经成为育种的新方 向。
[0003] 病程相关蛋白是指由寄主植物编码，在病理或病理相关环境下诱导产生的一类 蛋白（Van et al.，1999)。按植物来源、电泳迁移率（分子量）、血清学关系以及氨基酸 序列的同源性为标准的分类体系，可将PRP分为17个家族，即PRl到PR17(Van Loon et al.，2006)。其中，PR5蛋白也被称为类甜蛋白（Thaumatin-like Protein, TLP)，和非 洲植物西非竹竽￡/a/?ieT7i L.)的甜蛋白在氨基酸序列上有很高的同源 性（Pierpoint et al.，1990)，但两者的理化性质不相同，甜蛋白具有甜味无抗真菌活性， 类甜蛋白无甜味具有抗真菌活性（Ho et al.，2007);目前已经从很多植物中发现了 PR5 蛋白，例如大豆，玉米，杨树等，大多数PR5蛋白分子量在24~25KD (姜晓玲等，2012)， 能诱导植物的细胞程序性死亡（programmed cell death, P⑶），增加植物抗逆境能力 (D'angeli et al.，2007;高庆华等，2013)。植物基因组中的PR5基因以基因家族的形 式出现，分布于不同的细胞或组织中。PR5蛋白抗真菌活性非常显著（姜晓玲等，2012)，参 与超敏反应（HR)和植物系统获得性反应（SAR)，在植物抵抗生物和非生物的胁迫中扮演着 非常重要的作用。
[0004] 由于小麦基因组相对庞大（1.6X IO9 bp)，且结构复杂，直接从中克隆的防卫基因 数量较少，这些因素很大程度地限制了小麦抗叶锈病机制的研究和抗性资源的储备利用。 在小麦叶锈菌与寄主互作中PRs基因分子水平研究报道还较少，对小麦中PR5基因的表达 模式进行研究具有重要意义，将明确该基因在小麦抗叶锈病防御反应中发挥的作用，为深 入揭示PR5蛋白参与小麦与叶锈菌互作的分子机制和小麦抗叶锈病分子育种提供基础资 料。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是在优良的小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLrl9中分 离一类病程相关蛋白基因--类甜蛋白基因，明确及表达模式及其与小麦抗叶锈病的相关 性。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所用引物序列包括TcLrl9PR5_F和TcLrl9PR5_R，由 序列表中上游序列（29个碱基）和下游序列（33个碱基）组成，见表1。
[0007] 表1用于扩增类甜蛋白基因的引物上下游序列
【主权项】
1. 一种用于克隆与小麦叶锈病抗性相关的类甜蛋白基因的引物序列，是由序列表中引 物TcLrl9PR5_F和TcLrl9PR5_R核苷酸序列组成的引物对。
2. 根据权利要求1所述的引物序列在TcLrl9小麦中克隆类甜蛋白基因采 用的扩增反应条件特征在于：所述的PCR反应体系包含100 ng模板cDNA，lOiimol/L引物 liiL，10 mmol/L dNTP 0.5iiL，lU /即 DNA 聚合酶 0.31^，10\?0?缓冲液2.5111，加入 灭菌CldH2O至25 ii L ;PCR反应程序为：94°C预变性I min ;94°C变性30 s，62°C退火I min， 72°C延伸 2 min，35 个循环；72°C延伸 10 min。
3. 根据权利要求2所述，明确获得的类甜蛋白基因的结构特征：该序列不含内含子， 开放阅读框（open reading frame, 0RF)长516 bp，编码171个氨基酸残基，属于糖苷水 解酶 64 家族类甜蛋白超家族（glycoside hydrolases of family 64-thaumatin-like proteins, GH64-TLP-SF),具有一个甜蛋白保守结构域（thaumatin, THN)，，与小麦 aestira? Lina )PR5 蛋白相似性为 92%，与燕麦 satiFah 高梁（SbrgAtt? 办icoJror)、玉米（Zea 和大麦（//orofewfi? 等植物PR5蛋白的氨基酸序列相 似性在80%左右。
4. 根据权利要求3所述，明确基因在小麦中的时间和空间表达模式；特征 为：实时荧光定量PCR分析表明，在接种叶锈菌后不同时间点，该基因在非亲和组合中表达 量比亲和组合中高，表明基因的表达受小麦叶锈菌诱导，且茎部表达量高于叶 部和根部表达量，同时明确其表达受脱落酸（abscisic acid, ABA)和水杨酸（salicylic acid，SA)逆境信号分子的诱导。
5. 根据权利要求3和4,基因可能在小麦抗叶锈病防御反应中发挥作用，将 为深入探讨小麦与叶锈菌互作的分子机理提供基础资料，为培育抗叶锈病小麦品种提供理 论依据。
【专利摘要】本发明公开了一个与小麦叶锈病抗性相关的类甜蛋白基因TcLr19PR5及其编码的蛋白。是应用RT-PCR及电子克隆技术在小麦中克隆了一个516bp的类甜蛋白基因，编码171个氨基酸残基；实时荧光定量PCR分析表明，在接种叶锈菌后不同时间点，该基因在非亲和组合中表达量比亲和组合中高，表明其表达受小麦叶锈菌诱导，且茎部表达量高于叶部和根部表达量，同时明确其表达受脱落酸（abscisic acid，ABA）和水杨酸（salicylic acid，SA）逆境信号分子的诱导。本发明将为深入探讨小麦与叶锈菌互作的分子机理提供基础资料，为培育抗叶锈病小麦品种提供理论依据。
【IPC分类】C12N15-11, C12N9-24, C12N15-56
【公开号】CN104862307
【申请号】CN201410066121
【发明人】王海燕, 刘大群, 高琳
【申请人】河北农业大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月26日