一种高纯度辣椒基因组dna提取技术的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于应用生物技术育种领域，其主要内容是从作为辣椒育种亲本的杂种材 料中提取高纯度基因组DNA。其特点是以操作简便、重复性好、纯度高的DNA为样品实施分 子标记，并在辣椒杂交育种、亲本配合力的选择上获得遗传型稳定可靠、杂种优势明显的杂 种一代。本专利采用一种特有的技术方法提取和纯化用以辣椒基因组学和亲本杂种优势鉴 定的DNA。 技术背景
[0002] 辣椒（C. annuum)是一种广泛种植的茄科作物，基因组学的研宄是辣椒新品种培 育的一种重要的生物学基础。应用基因组学的差异比较和功能基因的序列分析可以有效的 分离和鉴定不同品种的亲缘关系及其亲本杂交的遗传配合力。辣椒杂交种的杂种优势主要 来源于杂合基因间的相互作用，其遗传学基础在于双亲间的遗传差异。DNA分子标记的发 展为杂种优势预测提供了新的手段。直接以DNA结构多态性为基础建立的遗传标记，在植 物的各个组织、各个发育阶段均可检测，不受季节和环境限制。以DNA为标记的分子鉴定技 术具有操作简便、重复性好、稳定可靠等特点在植物育种上的应用甚为广泛。例如，辣椒抗 黄瓜花叶病毒（CMV)的抗性是受多个基因性状控制的，符合加性显性遗传模型。华中农业 大学的姚明华（华中农业大学学报2013)对6份抗感差异的辣椒材料，采用完全双列杂交 的方法对其抗CMV的遗传力和配合力等遗传参数进行分析，结果表明，辣椒对黄瓜花叶病 毒株系CMV-HB的抗性由多基因控制，以加性效应为主；并且抗性的正反交效应不显著，表 明配制杂交组合要选择双亲均具较高抗性的亲本。吴立东（2011)以福建省三明市农科所 收集的34份具有较高利用价值的辣椒种质资源为研宄材料，采用SRAP分子标记分析了 34 份辣椒种质资源的遗传多样性，并基于分子聚类结果选出11个亲本材料，按不完全双列杂 交设计（5X6)组配成一套包括辣椒亲本和杂种一代2个世代的遗传材料，分析计算遗传距 离与杂种优势。实验应用30对引物组合进行相关序列扩增多态性分析（即，SRAP扩增）， 其中有28个引物组合可以获得多态性扩增，共扩增出356条带，其中多态性条带298条，多 态性条带比例83. 7%。扩增出的DNA带的大小在200~3000bp之间。SRAP标记可明显区 分34个辣椒自交系材料的基本类型即长椒（C. f. var. Iongum Sent)和灯笼椒（C. f. var. grossum Sent)。这些研宄表明以辣椒基因组学为基础的杂交品种的培育必须基于DNA的 提取、PCR扩增以及核苷酸序列的差异性比较才能够达到分子水平上的鉴定和区别。为了 获得高度纯化、高质量的DNA，采用一种特有的技术方法提取和纯化用以辣椒基因组学和杂 种优势鉴定的DNA是本专利的主要技术内容。其特点是，1)使用聚乙烯基吡咯烷酮用以提 取液中的DNA的提取；2)使用山梨醇作为辣椒DNA提取液的组成成分；3)使用十二烷基肌 氨酸作为DNA裂解液的主要组成成分。
【发明内容】
[0003] 辣椒杂交种的杂种优势主要来源于杂合基因间的相互作用，其遗传学基础在于双 亲间的遗传差异，也就是DNA的核苷酸序列的多态性。以DNA的核苷酸序列差异为标记的 分子鉴定技术，具有操作简便、重复性好、稳定可靠等特点。专利发明的目的就是通过辣椒 高纯度基因组DNA的提取与纯化技术的应用，在辣椒杂交育种、亲本配合力的选择上获得 遗传型稳定可靠、杂种优势明显的亲本材料和一代杂种。本专利发明采用一种特有的技术 方法提取和纯化辣椒基因组DNA。其主要内容是：
[0004] 1、辣椒叶片细胞的温浴裂解：辣椒叶片用液氮研磨后放入EP离心管中，加入 600ul EB 提取液（0. 35M 山梨醇、0. 2% 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)，0.1 M Tris-HCl、0. 005M EDTA，ρΗ7· 5) 65°C 温浴 20 分钟。
[0005] 2、叶片细胞的离心再裂解：14000rpm离心（4°C )10分钟，弃上清液，加入600ul 裂解液（0.2M Tris-HC1、0.05M EDTA，0.5M NaCl，2%CTAB 和 5%十二烷基肌氨酸钠， pH7. 5)65°C 温浴 40 分钟。
[0006] 3、使用裂解液的核酸分离：加入氯仿、异戊醇（24 : l)250ul，颠倒混匀；12000rpm 离心（4 °C ) 20分钟，取上清液。
[0007] 4、针对提取液的核酸分离：加入氯仿、苯酚：异戊醇（24 : 25 : l)250ul，颠倒混 匀；12000rpm离心（4°C )10分钟，取上清液。重复一次。
[0008] 5、针对提取液的核酸纯化：加入异丙醇（_20°C保存）400ul以及4ul醋酸钠 (3M)，-20°C静置30分钟。12000rpm离心（4°C ) 10分钟，弃上清液。
[0009] 6、样品核酸的纯化溶解：沉淀加入70%乙醇，12000rpm离心（4°C ) 10分钟，弃上 清液。沉淀吹干，加入TE 60ul。-20°C保存。
[0010] 7、样品DNA的质量标定：用紫外分光光度计测定所提取的辣椒DNA的A260/A280 值，纯度较高，可以达到1. 9左右。经过A260值计算，DNA的含量可以达到400-500ng/ul。
[0011] 与其它植物基因组DNA的提取方法不同，该方法的特点是在提取液中加入了 0. 35M山梨醇和聚乙烯基吡咯烷酮（PVP)、在裂解液中加入了十二烷基肌氨酸钠，以及在核 酸的纯化中加入了醋酸钠。这些化学成分的加入，使得辣椒细胞的裂解过程减少了酚类化 合物对核酸裂解的干扰，有效地保护了基因组大片段的DNA链，有助于辣椒基因组的核酸 大片段DNA的稳定和保存，有利于DNA的核苷酸差异序列的PCR扩增和分子鉴定。三者缺 一不可。
[0012] "一种辣椒基因组高纯度DNA提取技术"的专利发明仅仅适用于辣椒细胞核基因组 大片段DNA的提取，并应用于不同辣椒亲本以及杂种一代DNA的核苷酸差异的PCR扩增和 分子鉴定。为保障所提取的DNA链的长度的完整性以及DNA片段的高纯度，该专利发明体现 了纯化获得的基因组DNA的四大特点：1)使用PVP用以提取液中的DNA的提取；2)使用山 梨醇作为辣椒DNA提取液的组成成分；3)使用十二烷基肌氨酸钠作为DNA裂解液的主要组 成成分。4)纯化所获得的DNA纯度高、质量好，含量达到500ng/ul，A260/280值为1. 8-2. 0 之间。 具体实施例
[0013] 1、提取DNA的辣椒材料：辣椒103号父本、辣椒103号母本、103F12006-1、 103F12011-2,辣椒 106