专利名称：一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学制药技术领域，具体涉及一种优化的人溶菌酶基因及其表达载体和应用。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)全称为1，4_ β -N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它由英国细菌学家Fleming在1922年首先在人的唾沫、眼泪和鼻涕中发现，因其能溶解细菌细胞壁而具有溶菌作用而得其名。溶菌酶是人和动物体液和组织中的一种重要的防御因子，具有杀菌效果强，杀菌谱广，稳定性强，易被机体所接受的特点，还能促进免疫功能恢复，并且没有任何毒副作用和不良反应。因此溶菌酶作为一种生物制剂，被广泛应用于食品、饲料工业和临床医学。 人溶菌酶参与机体的防御机制，有抗感染、抗肿瘤和免疫调节的作用，具有潜在的临床应用价值，在饲料、食品工业上也具有广泛的用途。目前，国外已有小规模将人溶菌酶用于临床的报道，治疗效果也较好，且不会产生耐药性。人溶菌酶是溶菌酶中的一种，通常人溶菌酶是从人奶或胎盘中少量提取获得。由于其来源困难，不能进行工业化生产，采取DNA重组技术，从原核或真核表达系统生产人溶菌酶是解决其供需矛盾的有效途径。酿酒酵母表达系统已被广泛应用，虽已积累大量经验，但也存在诸多不足之处，如菌株生长速度慢、密度不高、外源蛋白的表达和翻译后加工都不够理想。
发明内容
本发明针对现有技术中利用酿酒酵母表达系统生产人溶菌酶所存在的菌株生长速度慢、密度不高且外源蛋白的表达和翻译后加工不理想的不足，提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体，本发明利用巴斯德毕赤酵母表达系统来作为生产人溶菌酶的表达系统，它具有生产成本低、操作简单、生长迅速、表达效率高、转录后加工修饰和良好的发酵与分泌性能等优点，本发明优化后的人溶菌酶基因经毕赤酵母表达系统产生的人溶菌酶具有高活性、高表达量的优点。为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现
本发明提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因HZ，它具有序列表SEQ ID N0:1的碱基序列，克隆所述基因的特异性引物为
引物 Fl :5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ 引物 Rl :5’ -ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’ 引物 AOXl :5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ 3’ - GCAAATGGCATTCTGACATCC -5，
本发明还提供了一种高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO: 1编码的SEQ ID NO:2 的氨基酸序列。本发明还提供了含有所述人溶菌酶基因HZ的重组载体，所述重组载体为 PUC18-T-HZ 禾口 pPICZ α A -HZ。
本发明还提供了所述人溶菌酶在作为饲料添加剂、食品添加剂和制药中的应用， 所述人溶菌酶可制备用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药物，所述人溶菌酶与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐物质配合使用。本发明选择活性较强的人溶菌酶基因，根据毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行优化，并人工合成优化后的人溶菌酶基因，将其与PUC18-T载体连接后转入大肠杆菌中获得重组质粒PUC18-T-HZ，以重组质粒pUClS-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增得到目的基因片段HZ。将合成的优化后的人溶菌酶基因与真核载体pPICZ α A连接，构建了重组质粒PPICZ α A -HZ。将重组质粒pPICZ α A -HZ线性化后经电击转化法转到毕赤酵母GS115中，筛选能在MD和匪上生长良好的Mut+的菌落，然后经抗生素kocin筛选获得阳性转化子，将阳性转化子接种于BMGY液体培养基中，于观250 r/min摇床培养至 0D_为2.0 — 6.0左右，离心收集菌体，后转接到装有新鲜BMMY液体培养基中进行诱导表达。同时进行最佳诱导表达条件的探索，以确定表达的最佳条件。诱导结束后，培养液室温离心收集上清，将诱导上清进行SDS-PAGE，得到与预期一致大小约为15. 26kD的目的条带， Western blot中将SDS-PAGE中的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用兔抗人溶菌酶的单抗作为一抗，用羊抗兔IgG的酶标抗体作为二抗，最后用二氨基联苯胺(DAB)显色。结果表明，目的条带与兔抗人溶菌酶的单抗发生特异反应，确证重组毕赤酵母分泌表达了人溶菌酶HZ。 用溶壁微球菌平板溶圈法鉴定表达产物的活性，检测得知具有明显抑菌活性。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是
本发明采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，不受原材料来源的限制，克服了以其他方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和活性低的缺点。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。结合附图阅读本发明的具体实施方式
后，本发明的其他特点和优点将变得更加清林疋。
图1是Genbank中现有人溶菌酶基因序列与本发明优化后人溶菌酶基因序列对比图谱。图2是本发明中以重组质粒PUC18-T-HZ为模板，用F1、R1引物进行PCR扩增产物的电泳图谱，图中1表示DL2000 DNA marker ； 2表示PCR扩增产物。图3是本发明中重组表达质粒pPICZ α A-HZ的构建图谱。图4是本发明中重组表达质粒pPICZ α A-HZ的PCR鉴定电泳图谱，1表示DL2000 DNA marker ；2 表示质粒 pPICZ α A-HZ 的 PCR 产物。图5是本发明中重组表达质粒pPICZ α A-HZ的酶切鉴定电泳图谱，图中1表示 DL2000 DNA marker ；2和3表示表达载体pPICZ α A-HZ经EcoR I +Not I酶切后产物。图6是本发明中重组菌株的通用引物AOXl的PCR验证图谱，1，2，3，4，5表示 GS115/ pPICZ α A-HZ 的 PCR 产物；6 表示 DL2000 DNA marker 图7是本发明中人溶菌酶蛋白SDS-PAGE的凝胶图谱，图中1表示蛋白MW Marker ； 2表示重组菌株GS115/ pPICZaA-HZ表达上清；3表示重组菌株GS115/ pPICZ a A诱导上清。图8是本发明中牛血清白蛋白标准曲线。图9是本发明中人溶菌酶蛋白的Western blot分析图谱。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明的技术方案作进一步详细的说明。实施例1
一、溶菌酶基因的选择、优化和合成 1、溶菌酶基因的选择
来源不同的溶菌酶活性存在差异，人溶菌酶活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍；而从牛、马、 羊等动物的乳汁中分离出的溶菌酶，其溶菌活性也远低于人溶菌酶；植物溶菌酶对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1 / 3。因此本发明选择活性较强的人溶菌酶基因进行表达。2、溶菌酶基因序列的优化
外源基因的内在特性如密码子偏好性是影响外源蛋白有效表达的重要因素。本发明根据毕赤酵母密码子偏好性，将溶菌酶基因的酵母低频密码子优化成高频密码子，以提高目的蛋白的翻译速度和表达量。人溶菌酶基因的核苷酸序列与Genbank中人溶菌酶基因序列对比如附图1所示。在附图1中，图谱上面一条序列是Genbank中人溶菌酶基因序列(NCBI序列号 NM_000239.幻，下面一条是优化后的人溶菌酶基因序列，两者对比后的黑色部分为相同碱基，白色部分为相异碱基。附图1表明，与Genbank中人溶菌酶基因序列相比，优化后的人溶菌酶基因有77
个碱基发生了置换，但氨基酸序列并没有改变。在人溶菌酶的C-端上加入5个氨基酸的肽链，使溶菌酶具有脂溶性，便于插入革兰氏阴性菌的脂多层中，可以在脂多层表面形成一个洞，切断下层的β-1，4糖苷键而发挥溶菌作用。因此在人溶菌酶基因序列3’端加上编码5个氨基酸的基因序列。通过专业软件分析，在基因序列的5’端和3’端分别加上EcoR I.Not I两个酶切位点，酶切位点如表1下划线所示的核苷酸。3、优化的人溶菌酶基因序列的合成
所述优化后的人溶菌酶基因序列由上海生工公司合成。合成的人溶菌酶基因HZ全序列如SEQ ID Νο:1所示。AAGGTTTTTGAAAGATGTGAATTGGCTAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGATGGTTACAGAGGTATT TCTTTGGCTAATTGGATGTGTTTGGCAAAGTGGGAATCTGGTTACAACACTAGAGCTACTAACTACAATGCAGGTGA TAGATCTACTGATTACGGTATCTTCCAGATCAACTCTAGATACTGGTGTAACGATGGTAAGACTCCAGGTGCTGTTA ACGCTTGTCATTTGTCTTGTTCTGCTTTGTTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTTGCATGTGCTAAGAGAGTTGTT AGAGATCCACAGGGTATTAGAGCTTGGGTTGCTTGGAGAAACAGATGCCAAAACAGAGATGTTAGACAGTATGTTCA AGGTTGTGGTGTTTTCTTCGTTGCTCCATAAGCGGCCGC
由SEQ ID Νο:1的核苷酸序列编码的人溶菌酶蛋白序列如SEQ ID Νο:2。
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGK TPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCGVFFVAP
其分子量为15洸1. 41Daltons。二、重组质粒pUC18-T_HZ的构建
所采用的载体是商业购买的PUC18-T载体，构建载体的宿主细胞是DH5 α。1、新合成的人溶菌酶基因与pUClS-T载体连接
将所述合成好的人溶菌酶基因与PUC18-T载体连接，连接体系如下
Solution I10μ1pUC18-T μ 合成产物HZ9μ1总体积20μ1
离心混勻后，16°C低温水浴连接过夜。连接产物直接用于转化。2、DH5a感受态细胞的制备
(1)取DH5a菌种，划线接种于LB固体培养基，培养过夜；
(2)取单个菌落，接种于含2mL LB液体培养基的10 mL试管中，37°C振荡培养过夜，次日按转种于含50 mL LB液体培养基的250 mL三角烧瓶中，继续振荡培养至0D600值达到0. 3-0. 5左右时取出；
(3)无菌条件下将细菌转移到无菌的用冰预冷的50mL聚丙烯离心管中，在冰上放置 10 min ；
(4)于4°〇以4000 rpm离心10 min，倒出培养液，将管倒置1 min使残留液体流尽；
(5)用10mL冰预冷的0. 1 mol/LCaC12溶液重悬细胞沉淀，冰上放置5 min ；
(6)于4°C以4000 rpm离心10 min,回收菌体；
(7)倒出培养液，将管倒置1min使残留液体流尽；
(8)用1mL冰浴预冷的0. 1 mol/LCaC12重悬细胞沉淀；
(9)用冷却的无菌吸头将感受态细胞分装于预冷的无菌微量离心管中，每管200μ 。3、合成的人溶菌酶基因与pUClS-T载体连接后的连接产物转化将上述制得的连接产物转化进DH5 α感受态细胞中。转化步骤如下
(1)将获得的连接产物10PL加入200 PL感受态细胞中，同时设阴性对照，以及不加入任何质粒DNA的感受态细胞对照；
(2)轻轻混勻后，立即冰浴30min ；
(3)将装有混合物的离心管移入预加温至42°C的循环水浴中，恰好静置90 s；
(4)将离心管快速转移到冰浴中，放置2min ；
(5)在超净台里，将离心管中的混合物加到800PL预热至37 ！的LB液体培养基中；
(6)轻轻颠倒混勻，将混合物于37！振荡培养45 min；
(7)将培养的菌液以3000rpm离心5 min，在超净台里弃掉部分上清，留约100 μ 上清，用加样器重悬菌体沉淀；
(8)取菌液涂布于含Amp的LB平板上，37！倒置培养过夜。4、重组质粒的序列测定
为了进一步确定上述步骤所得到的重组质粒，将阳性菌液由测序公司进行序列测定，并用DNAMar软件分析插入片段的正确性。将最终鉴定正确的重组质粒命名为PUC18-T-HZ。三、重组质粒pPICZ α A-HZ的构建
所采用的酵母表达载体为PPICZ α A，构建载体的宿主细胞是大肠杆菌DH5 α。1、设计引物
根据新合成的人溶菌酶基因序列设计上下游引物Fl、R1，及合成通用引物Α0Χ1，所述引物均由上海生工公司合成，所述引物的序列如下，下划线部分碱基代表相应酶切位点 表1 :PCR扩增所用引物
权利要求
1.一种优化的高活性人溶菌酶基因HZ，其具有序列表SEQ ID NO: 1的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的一种人溶菌酶基因HZ，其特征在于克隆所述基因的特异性引物为引物 Fl :5’ -ACGAATTCAAGGTTTTTGAAAGATGTGA-3’ ； 引物 Rl :5’ -ACGCGGCCGCTTATGGAGCAACGAAGAAAA-3’ ； 引物 AOXl :5’ -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’ ； 3’ - GCAAATGGCATTCTGACATCC -5，。
3.一种高活性人溶菌酶，其具有序列表SEQ ID NO: 1编码的SEQ ID N0:2的氨基酸序列。
4.重组载体，其含有权利要求1所述的人溶菌酶基因HZ。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pUClS-T-HZ和 pPICZa A-HZ0
6.一种根据权利要求3所述的人溶菌酶在作为饲料添加剂、食品添加剂和制药中的应用。
7.根据权利要求6所述的一种人溶菌酶在制药中的应用，其特征在于所述人溶菌酶在制备用于抗菌、抗病毒、抗肿瘤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种人溶菌酶在制药中的应用，其特征在于所述人溶菌酶与甘氨酸、植酸、聚合磷酸盐物质配合使用。
全文摘要
本发明提供了一种优化的高活性人溶菌酶基因及其表达载体，根据毕赤酵母密码子的偏好性对基因序列进行优化并人工合成人溶菌酶基因，构建重组质粒pUC18-T-HZ和pPICZαΑ-HZ，将重组质粒pPICZαΑ-HZ线性化后转到毕赤酵母中，筛选获得阳性转化子，经实验结果表明重组毕赤酵母分泌表达了高活性的人溶菌酶，表达产物具有明显抑菌活性。本发明采用毕赤酵母表达系统可以获得高表达量、高活性的人溶菌酶，克服了以其他方式获取溶菌酶的成本高、表达量低和活性低的缺点。通过高活性、低成本溶菌酶的生产与推广应用，不仅对我国饲料畜牧业的发展产生可观的经济效益和社会效益，同时也可产生巨大的生态效益。
文档编号C12N15/81GK102229939SQ20111013640
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者孙同毅, 张大伟, 王希辉 申请人:青岛根源生物技术集团有限公司