专利名称：一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。
背景技术：
东方马脑炎病毒(Easternequine encephalitis virus,EEEV),西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus,WEEV),委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus, VEEV),森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV),乙型脑炎(日本脑炎)病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)都是高致病性病病毒。东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒和委内瑞拉马脑炎病毒属典型的人兽共患病毒 性疾病，该病毒属A组虫媒病毒披膜病毒科甲病毒属，含单股RNA，因先后从美国东部、西部和委内瑞拉的病马脑组织中分离出病毒，故而得名。随后从病人脑组织中也分离出同样病毒，其引起的人类脑炎症状十分危急而凶险，其临床表现与乙型脑炎很相似，病死率可达35%左右。该病毒也是目前国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，国内属一类管理的病毒种类，备受关注。森林脑炎病毒(简称森脑病毒)由蜱传播，在春夏季节流行于俄罗斯及我国东北森林地带，故又称苏联春夏脑炎病毒(Russian spring-summer encephalitis virus),本病主要侵犯中枢神经系统，临床上以发热，神经症状为特征，有时出现瘫痪后遗症。森脑病毒核酸也为单正链RNA。日本(乙型)脑炎，又称流行性乙型脑炎，由日本脑炎病毒引起，潜伏期为5-15天。主要的症状为发烧、抽筋与深度昏迷，乃至危及生命，治愈后也常常流下后遗症，目前为止，日本脑炎的治疗并未有很大的突破，仍是以支持疗法为主，给予生命症候的支持，以及降脑压药物。上述五种脑炎病毒引起的症状比较相似。在中国，日本脑炎发病最多，森林脑炎次之，东方马脑炎、西方马脑炎和委内瑞拉马脑炎很少见。日本脑炎目前的检测主要依靠血清学，由于抗体产生有一定窗口期，所以早期难以诊断出来，容易延误病情。森林脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒的检测还处于比较空白的阶段，没有令人满意的成熟的检测方法。针对病毒核酸进行分子检测是目前的应用趋势，主要是通过普通逆转录-链式聚合酶反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法进行检测。此方法窗口期短，检测灵敏，有很好的发展前景。这两种方法都有一个缺点，即只能一次检测一种病毒。由于几种脑炎病毒引起的症状比较相似，只检测一种病毒(目前常常只检测日本脑炎)会造成漏检。综上所述，本领域尚缺乏令人满意的、能够同时检测多种脑炎相关病毒的技术。因此，本领域迫切需要开发高灵敏的、简便快捷的、同时检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏的、简便快捷的、同时检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。在本发明的第一方面，提供一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤(a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集，其中所述的脑炎相关病毒选自东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。在另一优选例中，所述的反应体系中含有特异性扩增以下5种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。在另一优选例中，所述的引物集包括由含SEQ ID NO. :1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO. :4和5所示序列的引物所构成的引物对。在另一优选例中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO. :1_5所示的引物。在另一优选例中，该方法还包括步骤(b)对步骤(a)获得的扩增产物用脑炎相关病毒的特异性探针进行检测。在另一优选例中，所述引物的5’末端标记生物素。在另一优选例中，所述的特异性探针带有可检测标记。在另一优选例中，所述的可检测标记包括荧光团、荧光微球。在另一优选例中，在步骤(b)还包括使用作为阴性对照的探针。较佳地，所述的阴性探针含有SEQ ID NO. :6所示的序列。在另一优选例中，步骤(b)中用Luminex xMAP进行检测。在另一优选例中，所述的探针的5’端或3’端具有NH2-间隔臂；或者所述的探针通过“-NH-间隔臂”结合于微球或固相载体。在另一优选例中，所述的间隔臂选自下组⑴连续的脱氧胸腺嘧啶核苷即(dT)n，η = 10-15 ；(ii)烷基链-(CH2)m-，m = 6-12 ;和(iii)乙二醇己醚(HEG)。在另一优选例中，在步骤(b)中，先进行扩增产物与探针的杂交反应，杂交完成后加入标记了藻红蛋白(PE)的SA，最终形成微球-探针-PCR产物-生物素-SA-PE复合物。在本发明的第二方面，提供了一种引物集，所述的引物集可特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物，其中所述的脑炎相关病毒选自东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。
在另一优选例中，所述的引物集包括由含SEQ ID NO. :1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO. :4和5所示序列的引物所构成的引物对。在另一优选例中，所述的引物集包括由含SEQ ID NO. :1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO. :4和5所示序列的引物所构成的引物对。在另一优选例中，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO. :1_5所示的引物。在本发明的第三方面，提供了一种检测试剂盒，它包括第一容器以及位于所述容器内本发明第二方面所述的引物集。在另一优选例中，所述的引物集包括由2个引物所构成的引物对或3-6个引物所构成的引物集。 在另一优选例中，所述的引物集包括由含SEQ ID NO. :1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO. :4和5所示序列的引物所构成的引物对。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括使用说明书。在另一优选例中，所述的试剂盒还包括第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。在另一优选例中，所述的探针是针对东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒的特异性探针。在另一优选例中，所述试剂盒还包括可以被引物组合扩增但内部序列为其它非相关病毒的外源核酸片段，以及包被有可以与这个外源核酸片段良好杂交的探针的微球，作为内参。在本发明的第四方面，提供了本发明第二方面所述的引物集的用途，它被用于制备检测脑炎相关病毒的试剂盒。在另一优选例中，所述的脑炎相关病毒包括东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。在另一优选例中，所述的试剂盒用于同时检测5种脑炎相关病毒。在本发明的第五方面，提供了本发明第二方面所述的引物集或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，它们用于体外非诊断地检测样品中是否存在脑炎相关病毒。在另一优选例中，用于检测在环境样品是否存在脑炎相关病毒。在本发明的第六方面，提供了一系列寡核苷酸片段，它们具有选自SEQ IDN0. 1-17的核苷酸序列。所述的寡核苷酸可作为引物或探针。在本发明的第七方面，提供了本发明上述特异性引物对和特异性探针的用途，它们被用于制备用于检测脑炎相关病毒的试剂盒。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图I显示了部分脑炎病毒的相关核酸序列，其中下划线为引物所在位置，方框为探针所在位置。
具体实施例方式本发明人经过对多种脑炎病毒的核酸序列的广泛而深入的研究，并经过大量筛选，首次确定了多种脑炎病毒基因序列中相对保守的、且多病毒检测时相互干扰较小区域。针对所述区域不仅可以设计出特异性扩增多种脑炎病毒的引物，还可设计出特异性探针。这样，在一次PCR反应中，通过检测探针的荧光信号，就可快速简便地鉴定多种脑炎病毒(包括东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本(乙型)脑炎病毒)的同时检测。在此基础上完成了本发明。术语如本文所用，术语“脑炎相关病毒”包括引起哺乳动物(如人)的脑炎的病毒，其中包括(但并不限于)东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。如本文所用，术语“日本脑炎病毒”和“乙型脑炎病毒”可互换使用，都指Japaneseencephalitis virus。 引物如本文所用，术语“脑炎相关病毒特异性引物”指这样的引物(对)，它的扩增产物具有脑炎相关病毒基因组保守区域的核苷酸序列。本发明的脑炎相关病毒的保守区域是基本对应的。作为代表，东部马脑炎病毒、日本(乙型)脑炎病毒、森林脑炎病毒的保守区域的核苷酸序列示于图I (SEQ ID NO. 18,19和 20)。如本文所用，术语“特异性引物”，指长度通常为18_28nt的寡核苷酸链，其与多种脑炎相关病毒中一种病毒RNA逆转录后的cDNA序列完全互补或者相同。在一个优选例中，本发明人提供了一个引物集(或称为引物组合)，该引物集可以同时扩增上述五种脑炎相关病毒的核酸。本发明人通过精心比对和分析这五种病毒的遗传序列，发现JEV和TBEV亲缘性较高，有一些区域可以设计通用引物同时扩增两种病毒，另外EEEV, WEEV和VEEV的亲缘性较高，也存在一些相对保守区域。然后，发明人通过更深入研究和试验，找到了一个引物组合可以以较少的引物数覆盖全部五种病毒，其特点包括以下几点。第一、序列。本发明设计的引物组合通过精心的序列比对和筛选，选出了几个病毒基因序列相对保守的区域，并针对此区域设计引物，以保证对绝大部分病毒株都能进行扩增，防止漏检。第二、引物组合，引物数量少，仅由5条引物构成。一般扩增一种病毒核酸需要一对引物，扩增五种病毒需要五对，即10条引物。本发明设计的引物组合通过精心的序列比对和筛选，选出了几个病毒基因序列相对保守的区域，并针对此区域设计引物，其中JEV和TBEV共用一对引物，EEEV, WEEV和VEEV共用一条上游引物，EEEV和WEEV共用一条下游引物，VEEV独自使用一条下游引物。引物序列见表I。注R为简并碱基标志表示A或G。表IPCR引物名称
权利要求
1.一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤 (a)在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，从而获得扩增产物，其中所述的反应体系中含有特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物的特异性引物集，其中所述的脑炎相关病毒选自东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO. :1-5所示的引物。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括步骤 (b)对步骤I获得的扩增产物用脑炎相关病毒的特异性探针进行检测。
4.如权利要求3所示的方法，其特征在于，所述的探针的5’端或3’端具有NH2-间隔臂；或者所述的探针通过“-NH-间隔臂”结合于微球或固相载体。
5.一种引物集，其特征在于，所述的引物集可特异性扩增至少2种脑炎相关病毒的扩增产物，其中所述的脑炎相关病毒选自东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
6.如权利要求5所述的引物集，其特征在于，所述的引物集包括由含SEQIDNO. :1、2和3所示序列的引物所构成的引物集；和/或由含SEQ ID NO. :4和5所示序列的引物所构成的引物对。
7.如权利要求5所述的引物集，其特征在于，所述的扩增脑炎相关病毒的特异性引物集包括SEQ ID NO. :1-5所示的引物。
8.—种检测试剂盒，其特征在于，它包括第一容器以及位于所述容器内权利要求5所述的引物集。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括第二容器以及位于所述容器内的核酸探针。
10.如权利要求5所述的引物集的用途，其特征在于，用于制备检测脑炎相关病毒的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种检测多种脑炎相关病毒的方法和试剂盒。具体地，本发明公开了一种同时检测多种脑炎相关病毒的方法，包括在聚合酶反应体系中，用特异性的针对脑炎相关病毒的引物集进行PCR反应，从而获得扩增产物；以及用特异性探针或探针微球进行检测。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可灵敏、简便地检测和鉴定多种脑炎相关病毒，其中包括东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、森林脑炎病毒和日本脑炎病毒。
文档编号C12Q1/70GK102796827SQ20111013618
公开日2012年11月28日 申请日期2011年5月24日 优先权日2011年5月24日
发明者谭畅, 王勤熙, 张秀斐, 姚见儿 申请人:上海透景生命科技有限公司