专利名称：一种检测虫媒脑炎病毒的新技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒分子生物学领域，具体而言涉及脑炎病毒的检测方法。本发明还涉及用于检测脑炎病毒的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。
背景技术：
虫媒病毒性脑炎是由嗜神经性虫媒病毒引起中枢神经系统疾病。嗜神经性虫媒病毒是一组以吸血昆虫为传播媒介的病毒，其中多种病毒可以造成急性脑炎，该疾病非常危险，病死率高，会造成严重的公共卫生问题。嗜神经性虫媒病毒主要包括黄病毒属 (Flavivirus)的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)和圣路易脑炎病毒(St. Louts encephalitis virus, StLEV)、蝶传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus, TBEV)和西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)；甲病毒属(Alphavirus)的东方马脑炎病毒(eastern equine encephalomyelitis virus ;EEEV)、西方马脑炎病毒 (western equine encephalomyelitis virus, WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine Encepha-Iomyelitis virus, VEEV)禾口弹状病毒禾斗(Rhabdoviriade)狂犬病毒属 (Lyssavirus)的狂犬病毒(Rabi es virus, RabV)等。虫媒脑炎病毒致病力强、病情严重、病死率高。目前实验室诊断方法主要有以下几种(一)特异性IgM检测病毒感染发病早期即产生特异性IgM，病后2 3周达到高峰，故单份血清可做出早期诊断。( 二)常规血清学试验1.血凝抑制试验虽然敏感性较高，但特异性较低。2.补体结合试验补体结合抗体仅存在于IgG中，病后出现迟，容易延误诊断。3.中和试验中和试验特异性和敏感性都高，但操作繁杂，需用大量动物或组织培养管，需时较久，不适于临床诊断常规使用。(三)病毒分离与鉴定体外病毒培养一般较难，且需要周期较长。敏感性低。(四)病毒RNA检测目前较常使用RT-PCR的方法对病毒RNA进行检测，但是较难达到多重检测。目前也有一些研究通过质谱原理进行多重的病毒检测。原理通过在PCR扩增引物上加入不同质量的特异序列标签，通过紫外照射使质量标签从产物上释放，最后利用质量光谱法进行分析。从而通过检测到的不同质量标签来进行鉴定病毒。但是在自动化和高通量方面仍然存在阻碍，且操作较复杂。由于在临床上虫媒病毒脑炎的症状较相似，因此对一份样本进行多种病毒的同时检测是很必要的。针对目前的虫媒病毒脑炎的诊断现状，我们希望开发一种敏感性高，特异性好，可以同时完成多重检测的自动化检测技术。
发明内容
本发明涉及一种能够检测常见虫媒脑炎病毒的方法，所述病毒可选自以下8种虫媒脑炎病毒日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒。所述方法包括如步骤1)使用扩增引物对对样品cDNA进行PCR扩增，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病毒基因组序列的保守区；2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应，例如单碱基延伸反应，获得延伸产物，优选延伸产物与所述延伸引物之间分子量差异不小于9道尔顿， 且各类型的延伸产物间的分子量差异不小于30道尔顿，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域；3)用质谱系统对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对(例如，使用由Sequenom公司提供的 Typer4. 0分析软件进行比对)确定待检测的脑炎病毒的具体类型，优选用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或纯化的延伸产物进行质谱检测，所述谱峰和所述扩增引物对和延伸引物信息优选被导入Typerf. 0分析软件(由Sequenom公司提供)中以进行检测结果的分析。在一个实施方案中，还优选在步骤1和步骤2)之间包括除dNTP步骤除去所述扩增产物中的dNTP ；并且/或者还优选在步骤2和步骤3)之间包括纯化步骤纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物。本领域技术人员可以理解，不除去扩增产物中的 dNTP可以实现本发明的目的，但除去扩增产物中的dNTP在优选单碱基延伸方案中可以排除未消耗dNTP对延伸反应的影响。并且纯化延伸产物也不是实现本发明所必须，但纯化延伸产物可以有利于质谱系统对延伸产物分析，从而得到更加高质量的谱峰。在一个实施方案中，本发明的方法所使用的扩增引物对的核苷酸序列包含SEQ ID NO :1 禾口 2、SEQ ID NO 3 禾口 4、SEQ ID NO 5 禾口 6、SEQ ID NO 7 禾口 8、SEQ ID NO 9 禾口 10、 SEQ ID N0:11 和 12、SEQ ID N0:13 禾口 14 以及 SEQ ID N0:15 禾口 16 中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5'端还包含标签序列，例如SEQ ID N0:25。在一些实施方案中，本发明的方法所使用的延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:17-24中的一个或多个。在一个优选实施方案中，样品选自脑脊液、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒媒介生物。在一个优选实施方案中，待检测的虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。采用本方法解决了目前的检测方法灵敏度低，特异性差，很难做到多重检测，成本高，周期长，自动化程度低的缺陷。与目前的检测方法相比，本发明的方法具有如下优点1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要使用荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；
2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即， 不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多种虫媒脑炎病毒，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。同时，本发明的技术方案采用了质谱技术，特别是基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统(MALDI-T0F-MS)，通过设计一套全新的扩增引物对和延伸引物，实现了对上述8种虫媒脑炎病毒的检测。其与其它现有方法相比，能够同时准确检测出8种虫媒脑炎病毒(WNV、JEV、StLEV, TBEV, VEEV, EEEV, Rabv和TOEV)，具有高通量、自动化、低成本的特点，有显著的优点。本发明还涉及用于检测8种常见虫媒脑炎病毒中一种或多种的扩增引物对和/或延伸引物。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID N0:1和2、SEQ ID NO 3 和 4、SEQ ID NO 5 和 6、SEQ ID NO 7 和 8、SEQ ID NO 9 和 10、SEQ ID NO :11 禾口 12、 SEQ ID NO 13和14以及SEQ ID NO 15禾口 16中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5'端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO :17-24中的一个或多个。本发明还涉及包含用于检测8种常见虫媒脑炎病毒中一种或多种的扩增引物对和/或延伸引物的试剂盒。在一些实施方案中，所述扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 1 禾口 2、SEQ ID N0:3 禾口 4、SEQ ID N0:5 禾口 6、SEQ ID N0:7 禾口 8、SEQ ID NO :9 禾口 10、SEQ ID NO : 11禾口 12、SEQ ID NO: 13禾口 14以及SEQ ID NO: 15禾口 16中的一对或多对。在一些实施方案中，在所述扩增引物的5'端还包含标签序列。在一些实施方案中，所述延伸引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO 17-24中的一个或多个。本发明中使用标签序列的目的仅是为了增加与标签序列相连的引物序列的分子量，以排除这些引物在后续试验的影响，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签序列，而实现本发明的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的标签序列。在一些实施方案中，上述的试剂盒中的其他试剂为用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及/或者用于纯化延伸产物的树脂。所述延伸反应优选是单碱基延伸反应。在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和/或延伸引物用于对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的用途；或者上述试剂盒用于对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的用途。在一些实施方案中，本发明涉及上述的扩增引物对和/或延伸引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的虫媒脑炎病毒。以下表1和表2中分别示例性显示了针对所述8种常见的虫媒脑炎病毒的PCR扩增引物，以及针对所述8种虫媒脑炎病毒的延伸引物。表1 针对所述8种常见的虫媒脑炎病毒的PCR扩增引物
权利要求
1.对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的方法，其包括以下步骤1)使用扩增引物对PCR扩增样品的CDNA，从而获得扩增产物，所述扩增引物对针对的是每种待检测病毒基因组序列的保守区；2)以步骤1)中获得的扩增产物为模板，使用延伸引物通过延伸反应获得延伸产物，所述延伸引物针对的是扩增引物所扩增序列中相对保守的区域，所述延伸反应优选是单碱基延伸反应；3)对所述延伸产物进行质谱检测确定样品的谱峰，通过将所述谱峰与延伸引物分子量及对应延伸产物分子量信息比对确定待检测的脑炎病毒的具体类型。
2.权利要求1的方法，其中在所述步骤1)之后和步骤2)之前还包括除去所述扩增产物中的dNTP的步骤，优选通过使用虾碱性磷酸酶(SAP酶)处理所述扩增产物来除去dNTP ；
3.权利要求1或2的方法，其中在所述步骤2)之后和步骤3)之前还包括纯化步骤 纯化所述延伸反应的延伸产物以获得纯化的延伸产物，优选使用离子交换树脂进行纯化。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中在所述步骤3)中用基质辅助激光解吸附/电离飞行时间质谱系统对所述延伸产物或所述纯化的延伸产物进行质谱检测。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述虫媒脑炎病毒选自日本脑炎病毒、西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西尼罗病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、狂犬病毒、圣路易脑炎病毒和蜱传脑炎病毒中的一种或多种。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述扩增引物对包含SEQID NO 1和2、SEQ ID NO 3 和 4、SEQ ID NO 5 和 6、SEQ ID NO 7 和 8、SEQ ID NO 9 和 10、SEQ ID NO 11 和 12、 SEQ ID NO 13和14以及SEQ ID NO 15和16中的一对或多对，或者5，端包含标签序列的 SEQ ID NO 1 禾口 2、SEQ ID NO 3 禾口 4、SEQ ID NO 5 禾口 6、SEQ ID NO 7 禾口 8、SEQ ID NO 9 和 10、SEQ ID NO :11 禾口 12、SEQ ID NO 13 禾口 14 以及 SEQ ID NO :15 和 16 中的一对或多对， 其中所述标签序列优选是SEQ ID NO :25 ；并且/或者所述延伸引物包含SEQID NO 17-24 中的一个或多个。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述样品选自脑脊液、血清、全血、纯病毒培养物和携带此类病毒媒介生物。
8.一种试剂盒，其包含权利要求6中定义的扩增引物对和/或延伸引物，或者还包含其他试剂，其中所述其他试剂优选是用于PCR扩增反应的酶和试剂，用于延伸反应的酶和试剂，以及/或者用于纯化延伸产物的树脂。
9.权利要求6中定义的扩增引物对和/或延伸引物用于对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的用途；或者用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测样品中的虫媒脑炎病毒； 或者权利要求8的试剂盒用于对样品中的虫媒脑炎病毒进行检测的用途。
10.SEQ ID NO 1-16任选一项或SEQ ID NO 17-24任一项的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种能够检测常见虫媒脑炎病毒的方法。本发明还涉及用于检测常见虫媒脑炎病毒的扩增引物和延伸引物，以及包含这些引物的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102199672SQ20101059201
公开日2011年9月28日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者刘利成, 吴伟立, 姜永强, 康小平, 杨银辉, 王鹏志, 管彦芳, 陈唯军 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 深圳华大基因科技有限公司