病毒性脑炎相关rna病毒多重rt-pcr检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒。上述检测试剂盒包括盒盖、盒体、衬垫、装有RT-PCR缓冲液的容器、装有引物的容器、装有酶的容器、装有电泳溶液的试剂瓶。其中，装有引物的容器分别装有扩增肠道病毒5’-UTR基因的引物、扩增乙型脑炎病毒E基因的引物、扩增麻疹病毒M基因的引物、扩增风疹病毒E基因的引物、扩增腮腺炎病毒M基因的引物。本实用新型结构简单、设计合理，方便携带、保存，不易受污染，检测灵敏度高，检测步骤简单、快捷。
【专利说明】病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本实用新型属于生物【技术领域】，涉及病毒性脑炎相关RNA病毒的检测试剂盒，主 要针对5种病毒性脑炎相关RNA病毒：肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺 炎病毒的同时检测。
【背景技术】
[0002] 病毒性脑炎（viral encephalitis)是由多种病毒引起的中枢神经系统感染性疾 病，因一年四季均可发生，故又称为散发性脑炎，其发病率约为（3. 5-7. 4)/10万，近年来呈 逐年上升趋势。病毒性脑炎多好发于儿童，该病往往缺乏特异性临床表现，病情严重者脑实 质严重受损，可导致神经系统后遗症，甚至死亡。目前，尚无治疗病毒性脑炎的特异性抗病 毒药物。只能通过加强预防、改善护理、对症治疗及服用广谱抗病毒和提高机体免疫力的药 物。病毒性脑炎的早期诊断能有效减轻免疫引起的脑组织损伤，降低后遗症发生率及死亡 率。
[0003] 传统病毒性脑炎病原体检测技术包括脑脊液病毒分离、ELISA、脑电图和影像学检 查等，上述检测方法在临床应用中均存在一定局限性，如病毒分离较难、特异性抗体相对较 少、无法定性定位等缺陷。PCR因具有较高的敏感性和特异性，操作简便、快速，已逐渐应用 于多种病毒性疾病的临床诊断。由于常规PCR技术一次只能扩增一个模板，如果反应体系 中含有两种以上的病原物，则需进行多次PCR，不但操作复杂，而且费用高，耽误时间。多重 PCR法使用多对引物，可在一个反应中扩增多种靶序列，其优点是可以在一种样品中同时鉴 别多种病毒，并将PCR的敏感性和快速性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原 的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低检测费用。
[0004] 本实用新型旨在建立检测肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎 病毒的多重RT-PCR检测方法，据此开发同时检测上述5种病毒的检测试剂盒，为病毒性脑 炎的早期诊断及流行病学调查奠定基础。
【发明内容】
[0005] 本实用新型的目的在于提供一种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂 盒，该试剂盒可同时检测肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒存在 与否，该检测试剂盒能够克服现有技术中存在的缺陷，具有较高的敏感性和特异性，操作简 便、快速，为病毒性脑炎的早期诊断及流行病学调查奠定基础。
[0006] 为实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：一种病毒性脑炎相关RNA病毒 多重RT-PCR检测试剂盒包括盒盖1、盒体2、衬垫3、挡板4、装有5XRT-PCR缓冲液的容器 5、装有AMV反转录酶的容器6、装有DNA聚合酶的容器7、装有扩增肠道病毒5'-UTR基因的 上游引物的容器8和下游引物的容器9、装有扩增乙型脑炎病毒E基因的上游引物的容器 10和下游引物的容器11、装有扩增麻疹病毒Μ基因的上游引物的容器12和下游引物的容 器13、装有扩增风疹病毒Ε基因的上游引物的容器14和下游引物的容器15、装有扩增腮腺 炎病毒Μ基因的上游引物的容器16和下游引物的容器17、装有RNasin的容器18、装有去 离子水的容器19、装有dNTP的容器20、装有氯化镁的容器21、装有电泳分离溶液母液的试 剂瓶22、装有SYBR染料的容器23 ;所述衬垫3放置于盒体2内，且在衬垫3上设有容器孔 31和凹槽32,容器孔31的大小与各容器的大小相匹配、凹槽32的大小与试剂瓶22的大小 相匹配；挡板4位于两个衬垫3的中间并固定于盒体2上，挡板4 一侧只设有容器孔31，挡 板4的另一侧设有凹槽32和一个容器孔31 ;装有电泳分离溶液50 X母液的试剂瓶22和 装有SYBR染料的容器23放置于挡板4的一侧，其他容器放置于挡板4的另一侧。
[0007] 优选地，装有5父1^〇?缓冲液的容器5中含有溶液100-25(^1;装有41^反转录 酶的容器6中含有浓度为5U/ μ 1的酶液10-25 μ 1 ;装有DNA聚合酶的容器7中含有浓度为 5U/μ 1的酶液10-25 μ 1 ;装有扩增肠道病毒5' -UTR基因的上游引物的容器8和下游引物 的容器9、装有扩增乙型脑炎病毒Ε基因的上游引物的容器10和下游引物的容器11、装有 扩增麻疹病毒Μ基因的上游引物的容器12和下游引物的容器13、装有扩增风疹病毒Ε基因 的上游引物的容器14和下游引物的容器15、装有扩增腮腺炎病毒Μ基因的上游引物的容器 16和下游引物的容器17中各含有浓度为10 μ mol/L的引物10-25 μ 1 ;装有RNasin的容器 18中含有液体10-25 μ 1 ;装有去离子水的容器19中含有去离子水lml、装有dNTP的容器 20中含有dNTP30-75 μ 1 ;装有氯化镁的容器21中含有浓度为2mmol/L的氯化镁20-50 μ 1 ; 装有电泳分离溶液50 X母液的试剂瓶22中的溶液体积为50ml ;装有SYBR染料的容器23 中染料的体积为100-250 μ 1。
[0008] 优选地，所述容器是1. 5ml的ΕΡ管。
[0009] 优选地，所述容器孔31是贯穿衬垫3的。更优选地，所述容器孔31是上端开口、 下端封闭的。
[0010] 优选地，所述容器孔31在衬垫上平行排列。
[0011] 优选地，扩增肠道病毒5' -UTR基因的引物序列为：
[0012] 上游引物：GGTGCGAAGAGTCTATTGAGC ;
[0013] 下游引物：GGAAACACGGACACCCAAAGT ;
[0014] 扩增乙型脑炎病毒E基因引物序列为：
[0015] 上游引物：CAAGCACGGCATGGAGAAACA ;
[0016] 下游引物：CCAGCACCTTTGAGTTGGAGC ;
[0017] 扩增麻疹病毒Μ基因的引物序列为：
[0018] 上游引物：ACAGGGAGTGTCTTCAACGCA ;
[0019] 下游引物：ATCCGAAAGACGGGTGATGCT ;
[0020] 扩增风疹病毒Ε基因的引物序列为：
[0021] 上游引物：GCGTCCTATTTCAATCCCGGC ;
[0022] 下游引物：ACTGTTGGTTGCCGGTGTAGT ;
[0023] 扩增腮腺炎病毒Μ基因引物序列为：
[0024] 上游引物：CAAGAAGGCAAAGGGCGACTC ;
[0025] 下游引物：TTGCTGTCTTCCGAACCCTGA。
[0026] DNA聚合酶可以选用Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的生产厂商较佳地为： TAKARA, New England biolabs, Invitrogen 或 Promega。
[0027] 所述5 X RT-PCR缓冲液为本领域常规的5 X RT-PCR缓冲液。所述5 X RT-PCR缓冲 液的生产厂商较佳地为：Invitrogen或Promega。
[0028] 本实用新型的优点和有益效果：
[0029] (1)本实用新型可以在一种样品中冋时鉴别五种病毒，并将PCR的敏感性和快速 性结合起来，避免了逐一扩增待测样品中每种病原的麻烦，可提高诊断的敏感性，同时降低 检测费用。
[0030] (2)本实用新型结构简单、设计合理、方便携带、保存、不易受污染、检测灵敏度高、 检测步骤简单、快捷。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本实用新型的构造图；
[0032] 其中：1.盒盖；2.盒体；3.衬垫；31.容器孔；32.凹槽；4.挡板；5.装有 5 X RT-PCR缓冲液的容器；6.装有AMV反转录酶的容器；7.装有DNA聚合酶的容器；8.装 有扩增肠道病毒5' -UTR基因的上游引物的容器；9.装有扩增肠道病毒5' -UTR基因的下 游引物的容器；10.装有扩增乙型脑炎病毒E基因的上游引物的容器；11.装有扩增乙型脑 炎病毒E基因的下游引物的容器；12.装有扩增麻疹病毒Μ基因的上游引物的容器；13.装 有扩增麻疹病毒Μ基因的下游引物的容器；14.装有扩增风疹病毒Ε基因的上游引物的容 器；15.装有扩增风疹病毒Ε基因的下游引物的容器；16.装有扩增腮腺炎病毒Μ基因的上 游引物的容器；17.装有扩增腮腺炎病毒Μ基因的下游引物的容器；18.装有RNasin的容 器；19.装有去离子水的容器；20.装有dNTP的容器；21.装有氯化镁的容器；22.装有电泳 分离溶液母液的试剂瓶；23.装有SYBR染料的容器。
[0033] 具体的实施方式
[0034] 下面结合实施例对本实用新型的【具体实施方式】作进一步描述，本实用新型的优点 和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本实用新型的范围 构成任何限制。
[0035] 实施例1病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒
[0036] 一种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒，包括装有5 X RT-PCR缓冲 液的容器5,其中含有溶液100 μ 1 ;装有AMV反转录酶的容器6,其中含有浓度为5U/ μ 1的 酶液10 μ 1 ;装有DNA聚合酶的容器7,其中含有浓度为5U/ μ 1的酶液10 μ 1 ;装有扩增肠 道病毒5'-UTR基因的上游引物的容器8和下游引物的容器9、装有扩增乙型脑炎病毒Ε基 因的上游引物的容器10和下游引物的容器11、装有扩增麻疹病毒Μ基因的上游引物的容 器12和下游引物的容器13、装有扩增风疹病毒Ε基因的上游引物的容器14和下游引物的 容器15、装有扩增腮腺炎病毒Μ基因的上游引物的容器16和下游引物的容器17,其中引物 浓度均为10 μ mol/L、每个容器中引物溶液体积为10 μ 1 ;装有RNasin的容器18,其中含有 液体10 μ 1 ;装有去离子水的容器19,其中含有去离子水lml ;装有dNTP的容器20,其中含 有(1ΝΤΡ30μ 1、装有氯化镁的容器21，其中含有氯化镁20μ 1、浓度为2mmol/L ;装有电泳分 离溶液50 X母液的试剂瓶22,其中溶液体积为50ml ;装有SYBR染料的容器23,其中染料 的体积为100 μ 1 ;所述衬垫3放置于盒体内，且在衬垫3上设有容器孔31和凹槽32,容器 孔31的大小与各容器的大小相匹配、凹槽32的大小与试剂瓶22的大小相匹配；挡板4位 于两个衬垫3的中间并固定于盒体2上，挡板4 一侧只设有容器孔31，挡板4的另一侧设有 凹槽32和一个容器孔31 ;装有电泳分离溶液母液的试剂瓶22和装有SYBR染料的容器23 放置于挡板4的一侧，其他容器放置于挡板4的另一侧。
[0037] 实施例2病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒
[0038] 一种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒，包括装有5 X RT-PCR缓冲 液的容器5,其中含有溶液250 μ 1 ;装有AMV反转录酶的容器6,其中含有浓度为5U/ μ 1的 酶液25 μ 1 ;装有扩增肠道病毒5' -UTR基因的上游引物的容器8和下游引物的容器9、装 有扩增乙型脑炎病毒Ε基因的上游引物的容器10和下游引物的容器11、装有扩增麻疹病 毒Μ基因的上游引物的容器12和下游引物的容器13、装有扩增风疹病毒Ε基因的上游引 物的容器14和下游引物的容器15、装有扩增腮腺炎病毒Μ基因的上游引物的容器16和下 游引物的容器17,其中引物浓度均为10 μ mol/L、每个容器中引物溶液体积为25 μ 1 ;装有 RNasin的容器18,其中含有液体25 μ 1 ;装有去离子水的容器19,其中含有去离子水lml ; 装有dNTP的容器20,其中含有dNTP75 μ 1、装有氯化镁的容器21，其中含有氯化镁50 μ 1、 浓度为2mmol/L ;装有电泳分离溶液50Χ母液的试剂瓶22,其中溶液体积为50ml ;装有 SYBR染料的容器23,其中染料的体积为250 μ 1 ;所述衬垫3放置于盒体内，且在衬垫3上 设有容器孔31和凹槽32,容器孔31的大小与各容器的大小相匹配、凹槽32的大小与试剂 瓶22的大小相匹配；挡板4位于两个衬垫3的中间并固定于盒体2上，挡板4 一侧只设有 容器孔31，挡板4的另一侧设有凹槽32和一个容器孔31 ;装有电泳分离溶液母液的试剂瓶 22和装有SYBR染料的容器23放置于挡板4的一侧，其他容器放置于挡板4的另一侧。
[0039] 实施例3病毒性脑炎相关RNA病毒多重PCR检测
[0040] 一、检测方法：
[0041] 使用实施例1或实施例2中的病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒 检测病毒性脑炎相关RNA病毒的方法如下所示 ：
[0042] 1.使用RNeasy mini kit提取肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疫病毒、风疫病毒和腿 腺炎病毒的RNA，操作按照说明书进行。
[0043] 2. RT-PCR ：
[0044] 2. 1反应体系：
[0045] 试剂 体积 5XRT-PCR 缓冲液 10 μ? dNTP 3 μ? 五种病毒的上下游引物 各Ιμ? 氯化镁 2μ1 AMV反转录酶 Ιμ? DNA聚合酶 Ιμ? RNasin 1 μ? RNA 模板 10 μ? 补充去离子水至50 μ?
[0046] 其中，扩增肠道病毒5' -UTR基因的引物序列为：
[0047] 上游引物：GGTGCGAAGAGTCTATTGAGC ;
[0048] 下游引物：GGAAACACGGACACCCAAAGT ;
[0049] 扩增乙型脑炎病毒E基因引物序列为：
[0050] 上游引物：CAAGCACGGCATGGAGAAACA ;
[0051] 下游引物：CCAGCACCTTTGAGTTGGAGC ;
[0052] 扩增麻疹病毒Μ基因的引物序列为：
[0053] 上游引物：ACAGGGAGTGTCTTCAACGCA ;
[0054] 下游引物：ATCCGAAAGACGGGTGATGCT ;
[0055] 扩增风疹病毒Ε基因的引物序列为：
[0056] 上游引物：GCGTCCTATTTCAATCCCGGC ;
[0057] 下游引物：ACTGTTGGTTGCCGGTGTAGT ;
[0058] 扩增腮腺炎病毒Μ基因引物序列为：
[0059] 上游引物：CAAGAAGGCAAAGGGCGACTC ;
[0060] 下游引物：TTGCTGTCTTCCGAACCCTGA。
[0061] 2.2反应条件：
[0062] 42°C反转录 40min ;94°C预变性 4min ;94°C变性 30s、57°C退火 30s、72°C延伸 45s， 共30个循环；72°C再延伸7min。
[0063] 3.琼脂糖凝胶电泳
[0064] 用TAE电泳缓冲液制备1 %琼脂糖凝胶，在室温下进行水平电泳。加10 μ 1PCR扩 增产物，以不加 RNA模板的反应液为阴性对照，以DLlOOOMarker为标准分子量；100V/80mA 下电泳30min，用SYBR染色，用凝胶成像系统观察并拍照。肠道病毒扩增产物为一条152bp 的条带、乙型脑炎病毒产物为一条429bp的条带、麻疹病毒产物为一条lllbp的条带、风疹 病毒产物为一条352bp的条带、腿腺炎病毒产物方一条274bp的条带。
[0065] 二、检测方法的敏感性验证
[0066] 分别提取肠道病毒、乙型脑炎病毒、麻疫病毒、风疫病毒和腿腺炎病毒的RNA，并 进行2倍倍比稀释，其中肠道病毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒的稀释度均分别为 1000、500、250、125、62· 5、31· 2、15· 6、7. 8CCID5(l/ml ;乙型脑炎病毒的稀释度为 1000、500、 250、125、62. 5、31. 2、15. 6、7. 8PFU/ml。每个稀释度分别取4μ 1作为模板，按上述检测方法 进行RT-PCR反应。同时，同一分析人员重复操作3次，验证该方法的敏感性。
[0067] 结果：3次重复PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，肠道病毒、乙型脑炎病 毒、麻疹病毒、风疹病毒和腮腺炎病毒在病毒稀释度分别为62. 5CCID5(l/ml、250 PFU/ml、125 CCID5Q/ml、125 CCID5Q/ml、125 CCID5Q/ml仍可分别扩增出特异性基因条带。
[0068] 综上所述，本实用新型的实施方式仅提供最佳的实施方式，本实用新型的技术内 容及技术特点已揭示如上，然而熟悉本项技术的人士仍可能基于本实用新型所揭示的内容 而作各种不背离本发明创作精神的替换及修饰；因此，本实用新型的保护范围不限于实施 例所揭示的技术内容，故凡依本实用新型的形状、构造及原理所做的等效变化，均涵盖在本 实用新型的保护范围内。
【权利要求】
1. 一种病毒性脑炎相关RNA病毒多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂 盒包括盒盖（1)、盒体（2)、衬垫（3)、挡板（4)、装有5XRT-PCR缓冲液的容器（5)、装有AMV 反转录酶的容器（6)、装有DNA聚合酶的容器（7)、装有扩增肠道病毒5'-UTR基因的上游引 物的容器（8)和下游引物的容器（9)、装有扩增乙型脑炎病毒E基因的上游引物的容器（10) 和下游引物的容器（11)、装有扩增麻疹病毒Μ基因的上游引物的容器（12)和下游引物的容 器（13 )、装有扩增风疹病毒Ε基因的上游引物的容器（14 )和下游引物的容器（15 )、装有扩 增腮腺炎病毒Μ基因的上游引物的容器（16 )和下游引物的容器（17 )、装有RNasin的容器 (18)、装有去离子水的容器（19)、装有dNTP的容器（20)、装有氯化镁的容器（21)、装有电泳 分离溶液母液的试剂瓶（22)、装有SYBR染料的容器（23);所述衬垫（3)放置于所述盒体（2) 内，所述衬垫（3)上设有容器孔（31)和凹槽（32);所述挡板（4)位于两个所述衬垫（3)的 中间并固定于所述盒体（2)上，所述挡板（4) 一侧只设有所述容器孔（31)，所述挡板（4)的 另一侧设有所述凹槽（32)和一个所述容器孔（31);所述容器孔（31)的大小与各容器的大 小相匹配；所述凹槽（32)的大小与所述试剂瓶（22)的大小相匹配；所述装有电泳分离溶液 50X母液的试剂瓶（22)和所述装有SYBR染料的容器（23)放置于所述挡板（4)的一侧，其 他容器放置于所述挡板（4)的另一侧。
2. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述容器孔（31)贯穿所述衬垫 (3)。
3. 根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述容器孔（31)上端开口，下端封 闭。
4. 根据权利要求根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述容器孔（31)平 行排列于所述衬垫（3)上。
【文档编号】C12Q1/70GK204058465SQ201420374867
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】孔祥军 申请人:沧州市中心医院