专利名称：日本脑炎病毒sa14-14-2株基于dna的感染性克隆、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及反向遗传学技术和RNA病毒拯救技术，具体地说，涉及日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆、其构建方法及应用。
背景技术：
黄热病毒属病毒属于正链RNA病毒,该属包含80多个成员，其中过半数以上的病毒能够诱发人和动物产生疾病，患病率高而治愈率差，容易留下一些严重的后遗症，给人类健康带来很大威胁(Monath TP, 1996),如JEV、登革热病病毒(DEN)、黄热病毒(YFV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)等。长期以来，其相关疫苗的研制、药物的开发进展都非常缓慢，到目前为止，仅YFV、JEV、TBEV有疫苗问世，而其他大部分的成员尚无有效的预防和治疗手段。流行性乙型脑炎(JE)是亚洲最常见的一种病毒性脑炎，我国是乙脑发病人数最多的国家，占世界总发病数的80%以上，除新疆、西藏、青海外，其他各地区均有发病病例，至今每年仍有几千例病人，对居民健康造成极大的危害，被卫生部列为乙类传染病。尽管大部分人在JEV感染后没有明显的症状发生，但是也有一部分患者能够出现永久的神经性疾病，甚至是致死性疾病，同时超过一半的幸存者会有持久的神经性后遗症。(Vaughn andHoke, 1992;Halstead andjacobson，2003)。目前，针对该病尚无特殊的治疗方法，对蚊虫的传播控制和对易感人群的免疫接种是目前主要的控制手段。SA14-14-2株是目前在中国广泛使用的乙脑减毒活疫苗，由中国食品药品检定研究院疫苗一室开发研制，1989年在我国开始接种，截止到2005年，在我国累计接种人数超过2亿人次，该疫苗有效的接种使得我国乙脑患病率从1990年的2.5X 10_3%降低到2004年、2005年间的0.5 X 10 以下，经过20多年的实践，其安全性和免疫效果已经得到充分的证实，疫苗株遗传稳定 性很好，对神经系统毒力减弱，可以对异源性乙脑病毒提供广谱免疫力。利用已有的安全有效的疫苗株，制备和其他病原体的嵌合病毒是一种构建新型疫苗的方法(Chamber TJ, 1999;Pletnev AG，1992)，其主要原理是利用稳定的减毒株作为受体株，嵌合进供体株相应的编码抗原基因，这样得到的嵌合病毒株既保留有一定的减毒特性，还具有供体株的免疫原性。嵌合病毒疫苗株属于减毒活疫苗，与亚单位疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗等相比更为有效，因为活疫苗能够在宿主体内有效的复制，和自然感染一样，产生一系列不同形式的抗原，诱导细胞因子和免疫反应的产生，细胞内复制能够产生长效记忆功能的T细胞以及很强的CTLs反应，免疫力持久而有效。已知通过反向遗传学技术，黄热病毒属中许多病毒的感染性克隆已经获得构建，传统的RNA病毒感染性克隆一般是指细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，该cDNA经过体外转录后所得的RNA具有感染性。该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子(RiceCM，1989)，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RNA转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒，由于这种拯救病毒是来自全长cDNA分子，因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造，使得在基因水平上对黄热病毒基因组进行操作，改造病毒基因组成为现实。如上所述，传统的黄热病毒感染性克隆在获得重组病毒前，必须经历体外转录这一个步骤，以RNA形式转染细胞或者是体内接种敏感动物，由于体外转录过程中RNA产物的均质性得不到保障，加上RNA本身的不稳定性，严重影响着通过人工构建的感染性克隆获得均一的重组病毒颗粒的成功率，传统的RNA病毒感染性克隆在操作中不可避免遇见的这些问题也成为这些克隆实际应用中的障碍。近年来，传统感染性克隆技术得到进一步改进，基于RNA的病毒感染性克隆质粒载体上传统的噬菌体启动子，如SP6，T7启动子，由聚合酶II依赖的启动子所替代，如真核表达CMV启动子(Mishin VP, 2001; Pierson TC，2005)。将这种质粒克隆直接转染真核细胞后，利用细胞内本身合成的内源蛋白RNA聚合酶II，可以实现病毒基因组的体内转录，生成高产量的感染性RNA，进而完成重组病毒的包装，获得重组恢复病毒。通过这种途径构建的病毒cDNA克隆被称为基于DNA的感染性克隆(DNA-based infectious clone)，或感染性DNA(infectiousDNA)，与传统的基于RNA的感染性克隆比，具有更多的优势:⑴体内转录获得的RNA相对稳定。⑵避免体外转录的步骤，操作简便，节约实验成本。⑶病毒基因组RNA的均质性得到保障。目前，尚未见到国内外有关构建日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基于DNA的感染性克隆的报道。
发明内容
本发明的目的是提供日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基于DNA的感染性克隆及其构建方法本发明的另一目的是提供所述感染性克隆在作为新型病毒载体中的应用。为了实现本发明目的，本发明的日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆，所述感染性克隆以PBR 322质粒为骨架载体，通过插入日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的全长cDNA获得，所述SA14-14-2疫苗株全长cDNA的5'端连接CMV启动子，3'端添加BGH多聚腺苷酸化序列，且在JEV基因组cDNA的第356位点和第2217位点上分别添加一段用于起稳定作用的嵌合内含子序列。所述SA14-14-2疫苗株为武汉生物制品研究所生产的乙型脑炎减毒活疫苗(国药准字:S20053005，批号:200710049-2)。前述日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆，其质粒结构如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。本发明还提供一种构建上述感染性克隆的方法:通过分段RT-PCR法获得日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的全长基因组cDNA序列，然后在基因组cDNA序列5 ^端连接CMV启动子，3'端添加BGH多聚腺苷酸化序列，并在基因组cDNA的第356位点和第2217位点上分别添加一段用于起稳定作用的嵌合内含子序列，最终克隆到质粒PBR322中。构建得到的质粒载体pQSINGZ包括以下元件:CMV启动子序列，SA14-14-2株5’端非编码区，衣壳蛋白、前膜蛋白、包膜蛋白和非结构蛋白的核苷酸序列，起稳定作用的内含子序列，3’端非编码区以及BGH多聚腺苷酸化序列。本发明还提供上述感染性克隆在作为新型病毒载体，如复制子疫苗载体、减毒活疫苗载体、基因治疗等载体中的应用。将日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组cDNA序列中编码前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列直接删除，从而构建一种结构蛋白缺失的复制子载体。该载体可作为复制子疫苗、基因治疗等DNA质粒载体。将日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组cDNA序列中编码前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列替代成编码另一种病毒前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列，或直接将外源基因插入到SA14-14-2株基因组序列的3' -UTR区，从而构建一种嵌合型的感染性克隆载体。另一种病毒任选西尼罗脑炎病毒、登革1-4病毒、黄热病毒、圣路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒或丙型肝炎病毒等病毒中的一种。本发明还提供一种嵌合型的感染性克隆载体，以所述日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆为出发载体，将日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组cDNA序列中编码前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列替代成编码另一种病毒前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列，或直接将外源基因插入到SA14-14-2株cDNA序列的3' -UTR区，即得。本发明还提供制备日本脑炎病毒SA14-14-2株的拯救病毒的方法，用上述构建的日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆转染病毒易感细胞(如BHK-21、VERO细胞)或直接接种易感动物(如直接脑内接种乳鼠)，获得拯救病毒。本发明还提供上述嵌合型的感染性克隆载体在制备嵌合型病毒及其衍生物中的应用。用所述嵌合型的感染性克隆载体转染易感细胞或直接接种易感动物，拯救获得嵌合型病毒及其衍生物。 本发明进一步提供上述日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆以及上述嵌合型的感染性克隆载体在制备抗病毒和预防肿瘤的药物及疫苗中的应用。SA14-14-2基因组为 单股正义RNA链，基因组中包括一个大的阅读框，两侧为5’和3’非编码区域，中间的ORF会翻译成一个大的前体蛋白，在翻译时以及翻译后加工为3个结构蛋白和7个非结构蛋白，C-prM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5，通过分片段RT-PCR获得该疫苗株的基因组序列，并克隆到质粒载体pBR322中，在基因组5’端前连接CMV启动子，3’端末添加BGH多聚腺苷酸化序列。构建的质粒pQSINGZ转染BHK-21细胞或者直接脑内接种乳鼠，可以获得滴度至少为7.351ogPFU/ml的重组病毒rQSINGZ。另外，以质粒pQSINGZ为基础，建立QSINGZVax技术，用WNV减毒株WN1415的prM-E基因替代SA14-14-2基因组中的prM-E基因，构建了 JEV/WNV嵌合型cDNA克隆pQSINGZ-WJ以及pQSINGZ-JW，直接脑内接种乳鼠后，可以分别获得滴度为7.12和5.311ogPFU/ml的重组嵌合型病毒。SA14-14-2疫苗株基于DNA的感染性克隆pQSINGZ的成功构建和QSINGZVax技术的建立，为进一步进行疫苗候选株的筛检打下基础。在本发明的第一个方面，根据武汉生物制品研究所生产的乙型脑炎减毒活疫苗(国药准字:S20053005，批号:200710049-2)，通过反转录-PCR和测序，提供了该疫苗株的真实的JEV基因组序列。在本发明的第二个方面，将SA14-14-2疫苗株从一种基于RNA的感染性克隆改造成为基于DNA的感染性克隆，最终提供了一个含有SA14-14-2基因组的质粒载体pQSINGZ以及其衍生物。P QSINGZ质粒中的JEV基因组序列除了在保证同义突变的基础上，在9392-9403位设置了一个KpnI酶切位点作为遗传标志外，其他序列和本发明第一个方面中公开的序列保持一致。感染性克隆质粒pQSINGZ可以在E.coli中大规模扩增，多次传代依然保持稳定性，能够用于大规模生产。另外，在构建得到质粒载体PQSINGZ及其衍生物的构建过程中还获得更多的中间产物，在本发明的第二个方面中包含:⑴在构建pQSINGZ质粒载体过程中，所涉及的所有含SA14_14_2疫苗株基因组部分序列的非感染性克隆，比如，SA14-14-2疫苗株基因组3’半分子克隆，SA14-14-2疫苗株基因组5’半分子克隆等。⑵在构建pQSINGZ质粒载体过程中，所涉及的所有添加外源序列的含有SA14-14-2疫苗株基因组部分序列的非感染性克隆，比如，添加有CMV启动子的SA14-14-2疫苗株基因组5’半分子克隆，添加BGH多聚腺苷酸化序列的SA14-14-2疫苗株基因组3’半分子克隆等。⑶所提供的SA14-14-2疫苗株基于DNA的感染性克隆pQSINGZ，以及构建过程中获得的其个别核苷酸有位点突变的全长感染性克隆。在本发明的第三个方面，获得了多种以SA14-14-2疫苗为基础的重组拯救颗粒，它由上述第二个方面所描述的感染性克隆pQSINGZ以及其衍生质粒，经过转染JEV易感细胞，如BHK-21，VER0细胞等；或者直接脑内注射易感动物，比如2_3日龄的Kunming乳鼠，获得具有感染性的重组病毒颗粒。在本发明的第四个方面，提供了 SA14-14-2疫苗株感染性克隆pQSINGZ的用途，并且建立了一种制备嵌合病毒颗粒的方法QSINGZVax，该技术包括以下步骤；⑴选定并合成异源靶基因，如WNV病毒的prM-E基因，报告基因EGFP等，外源基因的获得可以通过RT-PCR从异源病毒基因组中钓取，也可以从其他质粒中获得，或人工合成。⑵选择合适的嵌合/插入位点，通过融合PCR技术，定向克隆技术将外源基因定向插入到感染性克隆pQSINGZ中，替代原质粒pQSINGZ中JEV基因组相应位置的基因，或者是将外源基因直接插入到JEV基因组的3’ -UTR区域。⑶将重组的嵌合型感染性克隆经过转染JEV易感细胞，如BHK-21，VERO细胞等；或者直接脑内注射易感动物，比如2-3日龄的Kunming乳鼠，获得具有感染性的重组病毒颗粒。本发明涉及一个全新的关于日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)SA14-14-2疫苗株的核酸载体pQSINGZ，该质粒载体为基于DNA的SA14-14-2株全长感染性克隆，可以直接以DNA形式体外转染细胞/体内注射乳鼠后，得到具有感染性的重组恢复病毒颗粒。进一步地，可以利用该载体pQSINGZ作为骨架，重组获得JEV和黄热病毒属其他病毒成员之间的嵌合病毒，如构建JEV和西尼罗脑炎病毒(WNV)的嵌合型质粒载体，以DNA形式体外转染细胞/体内注射乳鼠后，得到JEV和WNV重组嵌合型病毒颗粒。利用该载体系统以及其衍生产物可用于异源蛋白的表达，获得人工重组的嵌合病毒等，从而应用到基因治疗，基因预防，诊断应用，基础研究等领域中。
本发明提供了一种基于DNA的JEV疫苗株SA14-14-2全长基因组感染性克隆系统，本发明中的基于DNA的JEV全长感染性克隆pQSINGZ，避开常规感染性克隆技术中的DNA-RNA步骤，无需进行体外转录，直接转染宿主细胞，既能获得高滴度和感染性好的重组拯救病毒。JEV全长感染性克隆pQSINGZ还可以用于嵌合病毒载体的构建，并以西尼罗脑炎病毒为例，构建并获得了 JEV疫苗株和WNV的重组嵌合病毒，建立了 QSINGZVax嵌合技术，从而应用于新型疫苗的开发研制中。本发明提供的以JEV疫苗株SA14-14-2的感染性DNA为核心的感染性克隆载体系统pQSINGZ，用其转染VERO细胞、BHK-21细胞或者直接脑内接种乳鼠，可获得滴度至少为
7.351ogPFU/ml的重组病毒rQSINGZ。并以质粒pQSINGZ为基础，建立了 QSINGZVax技术，用WNV减毒株WN1415的prM-E基因替代SA14-14-2基因组中的prM_E基因，构建了 JEV/WNV嵌合型cDNA克隆pQSINGZ-WJ以及pQSINGZ-JW，直接脑内接种乳鼠后，可获得滴度分别至少为7.12和5.311gPFU/ml的重组嵌合型病毒。SA14-14-2疫苗株基于DNA的感染性克隆pQSINGZ的成功构建和QSINGVax技术的建立，为今后开发多种用于预防和治疗肿瘤及病毒性疾病的新型疫苗奠定了坚实的基础。
图1为本发明实施例2中构建的质粒pQSINGZ的结构示意图；其中灰色区域为骨架载体PBR322，其余为JEV基因组区，在基因组第356和第2217处分别添加一段嵌合内含子序列用以稳定JEV感染性DNA克隆。图2为本发明实施例1中RT-PCR扩增乙型脑炎病毒SA14-14-2株基因组分段产物的电泳图；提取SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板，分段扩增全长基因组，1.以P1L/P1R为引物的RT-PCR产物，长度理论值为2247bp; 2.以P2L/P2R为引物的RT-PCR产物，长度理论值为339 Ibp; 3.以P3L/P3R为引物的RT-PCR产物，长度理论值为2599bp; 4.以P4L/P4D为引物的RT-PCR产物，长度理论值为2829bp;M.D15000Marker (天根)。图3为本发明实施例2中采用SacI酶切鉴定乙型脑炎病毒SA14_14_2株全长克隆质粒pQSINGZ电泳图，其中1-5为SacI酶切鉴定乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长克隆质粒pQSINGZ①-⑤号，酶切后产物为四条带，其长度理论值分别为1630、2633、4708、6997bp ；C为SacI酶切鉴定3’半分子克隆PBR-TB36，酶切后产物为三条带，其长度理论值分别为1630、2633、5129bp。图4为本发明实施例2中SacI酶切鉴定含EGFP的乙型脑炎病毒SA14_14_2株全长克隆质粒PQSINGZ-EG电泳图，其中1-4为SacI酶切鉴定含有报告基因EGFP的乙型脑炎病毒SA14-14-2株全长克隆质粒pQSINGZ-EG①-④号，酶切后产物为四条带，其长度理论值分别为2633、2945、4708、6997bp ；C为SacI酶切鉴定含有报告基因EGFP的3’半分子克隆pBR-TB36-EG，酶切后产物为三条带，其长度理论值分别为2633、2945、5129bp。图5为本发明实施例2中SacI酶切鉴定不同代次乙型脑炎病毒SA14_14_2株全长克隆质粒电泳图，1-5，6-10分别为pQSINGZ①号质粒经过在E.coli中经过十余次转化传代，不同代次提取的质粒用SacI酶切鉴定的电泳图，酶切后产物为四条带，其长度理论值分别为1630、2633、4708、6997bp ；C为SacI酶切鉴定3’半分子克隆pBR_TB36，质粒的酶切图谱保持不变，说明质粒具有良好的稳定性。图6为本发明实施例3中为含报告基因EGFP乙型脑炎病毒SA14_14_2株全长克隆质粒pQSINGZ-EG转染BHK-21细胞后，第24hrs、48hrs、72hrs、5days荧光镜下观察EGFP的表达，可以观察到，24hrs后，能检测的报告基因的表达，阳性信号呈零星分布状；48hrs，表达EGFP的阳性信号有聚集现象，并呈现出局部增强，增多的趋势，说明带有报告基因的重组病毒能够进行包装，复制并感染周边的细胞；72hrs后，阳性信号持续增强，聚集现象明显。说明重组病毒在进一步增殖，并扩散至周边细胞。图7为本发明实施例4中为鉴定恢复病毒遗传标志存在的酶切电泳图；其中，I为KpnI酶切野生株病毒基因组RT-PCR产物(CXI3/CX17B为引物的扩增产物)，长度理论值为1839bp ；2:以CX13/CX17B为引物，PCR扩增pQSINGZ质粒获得的DNA片段经KpnI酶切后产生两个片段，长度理论值分别为1289bp和550bp ；3,4:恢复病毒rQSINGZ基因组的RT-PCR产物，经KpnI酶切后产生两个片段，长度理论值分别为1289bp和550bp ;表明恢复病毒基因组中存在人为添加的遗传标志序列GGUACC。图8为本发明实施例5中为QSINGZVax技术示意图，主要显示了对嵌合位点的选择采取两个方案，其一是保留SA14-14-2病毒C基因的亲脂区；另一种是采纳异源病毒C基因的亲脂区。另一端异源病毒的E基因完全替换掉SA14-14-2相应的E基因。图9为本发明实施例5中为噬斑实验检测SA14-14-2疫苗毒株和恢复病毒，Al-3:pQSINGZ质粒脑内注射乳鼠后获得的rQSINGZ恢复病毒，检测脑内恢复病毒滴度为7.351ogPFU/ml ；Bl-3:pQSINGZ-ffJ质粒脑内注射乳鼠后获得的rQSINGZ_WJ恢复病毒，检测脑内病毒滴度为7.121ogPFU/ml ;C1_3:pQSINGZ_JW质粒脑内注射乳鼠后获得的rQSINGZ-JW恢复病毒，检测脑内病毒滴度为5.311ogPFU/ml ;D1_3:SA14_14_2脑内注射乳鼠后发病死亡，检测脑内病毒滴度为8.581ogPFU/ml。图10为本发明实施例5中rQSINGZ, rQSINGZ-ffJ, rQSINGZ-JW重组病毒以及对照SA14-14-2疫苗株在感染BHK-21/VER0细胞后，根据每日记录病毒的生长情况，绘制的病毒增殖曲线。
具体实施例方式
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以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1日本脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组序列鉴定1.减毒活疫苗SA14-14-2株病毒基因组RNA的获得⑴取一支乙型脑炎减毒活疫苗冻干制剂(批号200710049-2，SA14-14-2病毒含量:5.41gPFU)，加0.5mL病毒稀释液进行复溶。⑵病毒基因组RNA的提取:在0.5ml疫苗稀释液中，加入0.8mlTrizol试剂，混匀，室温静止5min ;加0.2ml氯仿,混勻，室温静止5min ;4°C离心，12000gX 20min。⑶取上层水相，移入一无RNase污染的新离心管，加等体积异丙醇进行抽提，室温下静止 lOmin。4°C离心，12000gX20min。⑷弃上清，加0.5ml75%酒精冲洗，混匀后静止5min。4°C离心，12000gX 15min。(5)弃上清，吹干，加20 μ L DEPC水溶解。2.提取的RNA产物获得JEV基因组相应的cDNA链⑴取10 μ L RNA 产物，加 I μ L6mer 随机引物(Promega)，65°C加热处理 5min。⑵冰上放置，依此加入I μ L RNase抑制剂，4 μ L5 X第一链缓冲液，2 μ L0.1DTT，I μ LlOmM dNTP, I μ L 反转录酶 SuperScript III (Invitrogen)。(3) 42°C加热 50min, 70°C灭活 15min。
3.以反转录产物作为模板进行JEV基因组4片段的扩增然后取5 μ L 反转录产物为模板，以 PTlL (SEQ ID NO:2) /PlR (SEQ ID NO:3)，P2L (SEQ ID NO:4) /P2R (SEQ ID NO:5), P3L (SEQ ID NO:6) /P3R (SEQ ID NO:7), P4L(SEQ ID NO:8)/P4D (SEQ ID NO:9)为引物，用 Prime Star 酶进行 PCR 扩增，反应体系为-MV 30s，58。。30s，72。。3min，30个循环。PCR结果和预期一致(图2)，从1%琼脂糖凝胶回收特异的扩增片段，通过rTaq将纯化后片段尾部加“A”，利用T/A克隆法将各片段连接到 pGEM-T、pMD-T 载体中。4.JEV疫苗株SA14-14-2基因组全长测序根据乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2株的核苷酸序列(Genbank号，D90195),设计覆盖整个基因组的17条测序引物(SEQ ID NO:10_26)，由北京六合华大基因科技股份有限公司合成,对连接到T载体中的4个RT-PCR产物进行测序。经过多次重复实验，将测序结果和基因库中录入序列(D90195，AF315119)进行比对，结果表明该市售获得的活疫苗株SA14-14-2在几个位点上和已公布序列有如下的改变(表I)。表I SA14-14-2疫苗株(批号=200710049-2)和基因库录入序列(D90195,AF315119)的基因组比对
权利要求
1.本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆，其特征在于，所述感染性克隆以PBR322质粒为骨架载体，通过插入日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的全长cDNA获得，所述SA14-14-2疫苗株全长cDNA的5'端连接CMV启动子，3'端添加BGH多聚腺苷酸化序列，且在基因组cDNA的第356位点和第2217位点上分别添加一段用于起稳定作用的嵌合内含子序列。
2.根据权利要求1所述的感染性克隆，其核苷酸序列如SEQID No:1所示。
3.一种构建权利要求1或2所述感染性克隆的方法，其特征在于，通过分段RT-PCR法获得日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的全长基因组cDNA序列，然后在基因组cDNA序列5丨端连接CMV启动子，3'端添加BGH多聚腺苷酸化序列，并在基因组cDNA的第356位点和第2217位点上分别添加一段用于起稳定作用的嵌合内含子序列，最终克隆到质粒PBR322中。
4.权利要求1或2所述感染性克隆在作为新型病毒载体中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组cDNA序列中编 码前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列替代成编码另一种病毒前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列，或直接将外源基因插入到SA14-14-2株cDNA序列的3' -UTR区，从而构建一种嵌合型的感染性克隆载体。
6.一种嵌合型的感染性克隆载体，其特征在于，以权利要求1或2所述感染性克隆为出发载体，将日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株全长基因组cDNA序列中编码前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列替代成编码另一种病毒前膜蛋白和包膜蛋白的核苷酸序列，或直接将外源基因插入到SA14-14-2株cDNA序列的3' -UTR区，即得。
7.根据权利要求6所述嵌合型的感染性克隆载体，其特征在于，另一种病毒任选西尼罗脑炎病毒、登革1-4病毒、黄热病毒、圣路易脑炎病毒、蜱传脑炎病毒或丙型肝炎病毒中的一种。
8.备日本脑炎病毒SA14-14-2株的拯救病毒的方法，其特征在于，用权利要求1或2所述的感染性克隆转染日本脑炎病毒易感细胞或直接接种易感动物，获得拯救病毒。
9.权利要求6或7所述嵌合型的感染性克隆载体在制备嵌合型病毒及其衍生物中的应用，其特征在于，用所述嵌合型的感染性克隆载体转染易感细胞或直接接种易感动物，拯救获得嵌合型病毒及其衍生物。
10.权利要求1或2所述日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆以及权利要求6或7所述嵌合型的感染性克隆载体在制备抗病毒和预防肿瘤的药物及疫苗中的应用。
全文摘要
本发明涉及日本脑炎病毒SA14-14-2株基于DNA的感染性克隆及其构建方法，所述感染性克隆以pBR322质粒为骨架载体，通过插入日本脑炎病毒SA14-14-2疫苗株的全长cDNA获得，所述SA14-14-2疫苗株全长cDNA的5′端连接CMV启动子，3′端添加BGH多聚腺苷酸化序列，且在基因组cDNA的第356位点和第2217位点上分别添加一段用于起稳定作用的嵌合内含子序列。本发明还提供了所述感染性克隆在作为新型病毒载体中的应用，为今后开发多种用于预防和治疗肿瘤及病毒性疾病的新型疫苗奠定了坚实的基础。
文档编号C12N15/70GK103088049SQ20121057687
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者黄莺, 贾丽丽, 孙志伟, 徐宏山, 俞炜源, 俞永新 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所, 中国食品药品检定研究院