专利名称：表达TNF受体:IgG1 Fc嵌合蛋白的DNA型Semliki森林脑炎病毒载体的制作方法
人肿瘤坏死因子α(hTNFα)是巨噬细胞/单核细胞活化产生的一种的多功能细胞因子，具有广泛的生物学活性，在炎症反应、免疫调节、抗肿瘤、微生物与寄生虫感染方面起重要作用，在人细胞因子免疫调节网络中起中枢调节作用。TNF的生物学活性是通过细胞表面相应的受体来实现的，TNF有两个受体P55和P75受体，广泛分布于体内大多数细胞的表面。TNFα与膜表面受体(mTNFR)结合以后，经过复杂的信号传递，诱导一系列细胞内变化，引起相应的生理与病理反应。目前己知与TNFα有关的疾病包括自身免疫疾病，恶液质，脓毒性休克综合症，类风湿性关节炎，慢性心衰，脑性疟疾，弥漫性血管内凝血，糖尿病，移植排斥反应，甲状腺肥大等。因此抑制TNF的生物学活性在临床上具有重要的意义。TNF的生物学功能是通过细胞表面相应的受体(mTNFR)来实现的，mTNFR的胞外区在特定情况下可以脱落下来，形成可溶性受体(sTNFR)。sTNFR不再介导受体传递，但仍能与TNF结合，从而阻断TNFα与mTNFR的结合，封闭TNF的生物学活性。利用可溶性TNF受体与膜上受体竞争结合，是阻断TNF信号传递的一条有效途径。大量研究表明TNF与TNFR是以三聚体-三聚体的形式结合的，膜上受体的聚合化是介导TNF活性的基础。
本发明将sTNFR与IgG Fc片段融合，形成的“Y”形嵌合分子，保证sTNFR分子的聚合化。研究表明sTNFR与IgG Fc片段融合后，sTNFR在体内的半衰期延长，从而提高了sTNFR的中和活性，因此sTNFR聚合体对TNF的中和活性明显比sTNFR单体好。在本发明中，我们设计的连接肽具有灵活的柔韧性，Swiss Model软件三维结构分析表明，该连接肽能够确保嵌合蛋白的两个功能性亚基保持各自独立的三维空间结构，从而使表达后的嵌合蛋白能够形成正确的空间构象，保持sTNFR的生物学活性。
Semliki森林脑炎病毒(SFV)表达载体是近年来新发展的一种真核细胞表达系统，具有以下特点(1)高感染率Semliki SFV对BHK，CHO等细胞的感染率可达100％。(2)高复制率，Semliki SFV是目前己知的具有高复制率的病毒之一，染毒后几小时内，病毒的RNA拷贝数可达2×105，该RNA可以直接作为mRNA参加病毒和外源蛋白的合成，单个细胞可以合成108个病毒基因组编码的蛋白分子。(3)细胞质内复制，Semliki SFV感染细胞后在细胞质内复制，因此在基因加帽，mRNA剪切与转运方面具有高效率。(4)细胞病变滞后，SemlikiSFV感染细胞后4-24小时，结构蛋白得到充分的表达，但细胞未出现明显病变。(5)高安全性，Semliki SFV表达载体结构蛋白与调节基因和复制酶基因不在同一个载体上，避免了病毒重组。同时结构蛋白发生突变，须蛋白酶裂解后才具有包装能力，避免了野生病毒产生的可能。同传统的SFV表达载体相比，DNA型Semliki SFV表达载体在SFV26s启动子前加有CMV启动子/增强子，避免了RNA操作，提高了质粒的转染效率，易于操作。本发明达到的技术指标1.(1)表达sTNFRIIgG1Fc的DNA型Semliki森林脑炎病毒表达载体全长12837bp，核苷酸序列见图3。(2)表达sTNFRIIIgG1Fc的DNA型Semliki森林脑炎病毒表达载体全长12855bp，核苷酸序列见图4。2.(1)编码嵌合蛋白sTNFRIIgG1Fc的基因全长为1335bp，核苷酸序列见图5。(2)编码嵌合蛋白sTNFRIIIgG1Fc的基因全长为1353bp，核苷酸序列见图6。3.(1)嵌合蛋白sTNFRIIgG1Fc全长445个氨基酸，氨基酸序列见图5。(1)嵌合蛋白sTNFRIIIIgG1Fc全长453个氨基酸，氨基酸序列见图6。本发明优点1.表达sTNFRIgG1Fc的DNA型Semliki森林脑炎病毒表达载体在哺乳动物细胞中具有高表达性，重组病毒感染细胞后嵌合蛋白以分泌的形式大量表达，每升培养液可分泌产生具有中和活性的嵌合蛋白10-30mg。2.利用该重组表达载体在真核细胞中生产sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白周期短，易于纯化。重组病毒感染细胞后24小时，嵌合蛋白就达到最大分泌量，同时采用无血清培养，分泌在培养液中的嵌合蛋白易于纯化。3.嵌合蛋白天然状态下以二聚体的形式存在，同单体的sTNFR相比，对TNF的中和能力提高，同时体内半衰期延长。4.本发明中设计的连接短肽具有良好的柔韧性，能使两端的sTNFR和IgG Fc结构域保持各自独立的空间结构，从而确保了sTNFR对TNF的中和活性以及IgGFc分子的二聚化。
图1表达sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白的DNA型SFV重组载体结构示意2sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白结构示意3表达sTNFRIIgG1Fc嵌合蛋白的DNA型SFV重组载体核苷酸序列图4表达sTNFRIIIgG1Fc嵌合蛋白的DNA型SFV重组载体核苷酸序列图5sTNFRIIgG1Fc基因及其编码的氨基酸序图6sTNFRIIIgG1Fc基因及其编码的氨基酸序实施例1sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白基因的构建与序列测定合成以下六条引物primer sTNFR N15’-ATG AAT TCC AAT ATG GCG CCC GTC GCC GTC TG-3’primer sTNFR N25’-AAG AAT TCC AAT ATG GGC CTC TCC AC-3’primer sTNFR C15’-AC GAA TCC ACC GCC ACC GGG TAA GTG TAC TGprimer sTNFR C25’-AA GGA TCC ACC GCC ACC TGT GGT GCC TGA GTC-3’primer IgG Fc N5’-TA GGA TCC GGA GGT GGA GGT AGC GTT GAG CCC AAATCT-3’primer IgG Fc C5’-ATC TCG AGT TAC TAC TGC GTG TAG TGG TTG-3’引物primer sTNFR N1和primer sTNFR N2引入EcoR I酶切位点，引物primer sTNFRC1、primer sTNFR C2和primer IgG Fc N引入BamH I酶切位点，引物primer IgG Fc C引入Xhol I酶切位点。
从新鲜外周血中分离单核巨噬细胞，利用TRIZOL一步法抽提RNA，六随机引物反转录cDNA，然后(1)以逆转录cDNA为模版，primer sTNFR N1和primer sTNFR C1为引物PCR扩增出TNFR I胞外区四个富含Cys的功能性结构域(包括信号肽)，并在羧基端引入短肽GlyGlyGlyGlySer；(2)以逆转录cDNA为模版，primer sTNFR N2和primer sTNFR C2为引物PCR扩增出TNFR II胞外区四个富含Cys的功能性结构域(包括信号肽)，并在羧基端引入短肽GlyGlyGlyGlySer.(3)以IgG Fc/TA为模板，primer IgG Fc N和primer IgG Fc C为引物，PCR扩增出IgG1Fc基因，并在氨基端引入GlySerGlyGlyGlyGlySer，羧基端引入翻译终止信号TAG TAA。
将sTNFR插入质粒pBLUE SK的EcoR I和BamHI酶切位点，构建成重组克隆载体pBLUESK/sTNFR。进一步将IgG Fc基因插入pBLUE SK/sTNFR的BamH I和EcoR I位点，构建成重组克隆载体pBLUE SK/sTNFRIgG Fc，从而将编码sTNFR和IgG Fc的基因相连，构成编码嵌合蛋白huTNFRIgG1Fc重组基因，并在两者中间引入一个编码连接短肽(-GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer-)的基因(嵌合蛋白huTNFRIgG1Fc结构示意图见图2)。
以pBLUE SK/sTNFRIgG Fc为模板，ABI377自动测序仪测序，测序结果表明sTNFRII和IgGFc的基因完全正确，插入位点和中间连接短肽也与设计相符。实施例2pSFV/sTNFRIgG1Fc重组表达载体的构建合成以下引物pSFV N15’-A TTG ATC AAT ATG GCG CCC GTC-3’pSFV N25’-A TTG ATC AAT ATG GGC CTC TCC A-3’pSFV C5’-GGC TGA TCA TTA CTA CTG CGT GTA-3’引物两端引入Bcl I酶切位点(BamH I同尾酶)，同时N段引入Kozak序列。以pBLUESK/sTNFRIIgG Fc为模板，pSFV N1和pSFV C为引物，pfu扩增出sTNFRIIgG1Fc基因，Bcl I酶切消化后，插入pSFV的BamH I位点，构建成pSFV/sTNFRIIgG1Fc重组表达载体；以pBLUE SK/sTNFRIIIgG1Fc为模板，pSFVN1和pSFVC为引物，pfu扩增出sTNFRIIIgG1Fc基因，Bel I酶切消化后，插入pSFV的BamH I位点，构建成pSFV/sTNFRIIIgG1Fc重组表达载体。酶切及PCR鉴定重组载体和插入的基因正确。(pSFV/sTNFRIgG1Fc重组表达载体的结构见图1)实施例3pSFV/sTNFRIgG1Fc重组表达载体在BHK细胞中表达与鉴定利用Qiagen Large Scale Plasmid Purification Kit纯化pSFV/sTNFRIgG1Fc重组载体和pSFV-h辅助载体，Gibco公司的LF plus转染试剂将pSFV/sTNFRIgG1Fc和pSFV-h按摩尔数1∶1的比例转入BHK细胞，24小时后收获培养上清，获得含sTNFRIgG1Fc结构基因的重组病毒。重组病毒用1/10体积的胰凝乳蛋白酶A4(Chymotrypsin A4，2mg/ml inPBS)室温裂解4小时，激活病毒；然后用1/4体积的抑肽酶(Aprotintin，5-10TIU/ml)室温灭活蛋白酶5分钟。用此病毒感染BHK细胞，4小时后换成无血清培养基，24小时后收获上清。
表达上清SDS-PAGE后，80V2hr转膜，脱脂奶封闭过夜，分别以抗sTNFR抗体和抗人IgG1Fc抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western-Blot，结果证实上清中存在大量的嵌合蛋白。
表达上清能抑制TNF对L929细胞的杀伤，具有明显的TNF中和活性。实施例4sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白的纯化与鉴定病毒感染BHK细胞24小时后的培养上清，经盐析处理后，直接上亲和层析柱，洗脱下的靶蛋白即为纯化的sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白。
纯化蛋白经还原和非还原SDS-PAGE后，80V2hr转膜，脱脂奶封闭过夜，分别以抗sTNFR抗体和抗人IgG1Fc抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗进行Western-Blot，结果表明纯化出的蛋白是我们的目的蛋白，同时表明嵌合蛋白在天然状态下以单聚体和二聚体的形式共存。
包被TNF纯品蛋白，以嵌合蛋白为抗原，以抗sTNFR抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行“双抗夹心法”检测，结果证实纯化的嵌合蛋白能识别TNF蛋白并与之结合。
在BIACORE蛋白芯片上包被hTNFα蛋白，通过自动加样系统上样sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白，利用BIACORE系统检测hTNFα与嵌合蛋白间的相互作用，结果证实天然状态下嵌合蛋白能够识别并结合TNF蛋白。
SDS-PAGE表明，嵌合蛋白sTNFRIIgG1Fc和sTNFRIIIgG1Fc的分子量均约为50kD；紫外光谱扫描表明，最大之外吸收波长均为280nm；等电聚焦分析表明，嵌合蛋白sTNFRIIgG1Fc的等电点约为6.5，嵌合蛋白sTNFRIIIgG1Fc的等电点约为7.0。实施例5sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白的生物学活性分析用鼠L929细胞检测hTNF生物学活性，纯化后的嵌合蛋白用1640稀释，与0.2ng的hTNF蛋白37℃保温2h，然后与L929细胞培养24小时，弃去上清，MTT显色，570nm测OD值。结果表明，sTNFRIgG1Fc嵌合蛋白对TNF蛋白具有明显的抑制活性，能有效抑制TNF蛋白对L929细胞的杀伤。
权利要求
1.本发明涉及一种能高效表达人肿瘤坏死因子可溶性受体免疫球蛋白G1重链恒定区(含绞链区)嵌合蛋白(sTNFRIgG1Fc)的DNA型Semliki森林脑炎病毒重组表达载体(pSFV/sTNFRIgG1Fc)。其基本特征为(1)pSFV/sTNFRIIgG1Fc表达载体基因全长为12837bp，含有编码sTNFRIIgG1Fc嵌合蛋白的结构基因(7407-8741位碱基，基因长度为1335bp)，载体上含有CMV启动子/增强子，SFV26s启动子和SFV的非结构蛋白基因nsp1、nsp2、nsp3和nsp4以及编码SFV结构蛋白的辅助病毒质粒pSFV-h。(2)pSFV/sTNFRIIIgG1Fc表达载体基因全长为12855bp，含有编码sTNFRIIIgG1Fc嵌合蛋白的结构基因(7407-8759位碱基，基因长度为1353bp)，载体上含有CMV启动子/增强子，SFV26s启动子和SFV的非结构蛋白基因nsp1、nsp2 nsp3和nsp4以及编码SFV结构蛋白的辅助病毒质粒pSFV-h。
2.根据权利要求1所述，编码嵌合蛋白sTNFRIgG1Fc的基因，其基本特征为(1)sTNFRIIgG1Fc基因全长为1335bp，编码445个氨基酸，分子量约为50kD，有可溶性肿瘤坏死因子受体I(sTNFRI)编码基因(1-633位碱基)、人免疫球蛋白G1重链恒定区(含绞链区)(IgGFc)编码基因(664-1335位碱基)和连接短肽编码基因三部分组成(634-663位碱基，核苷酸序列为5’-ggt ggc ggt gga tcc gga ggt gga ggt agc-3’)。(2)sTNFRIIIgG1Fc基因全长为1353bp，编码453个氨基酸，分子量约为50kD，有可溶性肿瘤坏死因子受体II(sTNFRI)编码基因(1-651位碱基)、人免疫球蛋白G1重链恒定区(含绞链区)(IgG Fc)编码基因(681-1353位碱基)和连接短肽编码基因(652-681位碱基，核苷酸序列为5’-ggt ggc ggt gga tcc gga ggt gga ggt agc-3’)三部分组成。
3.根据权利要求1所述，嵌合蛋白sTNFRIgG1Fc的氨基酸序列，其基本特征为(1)嵌合蛋白sTNFRIIgG1Fc全长445个氨基酸，分子量约为50kD，由三部分组成可溶性肿瘤坏死因子受体I(sTNFRI)(1-211位氨基酸残基)，连接短肽(212-221位氨基酸残基，氨基酸序列为-GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer-)，人免疫球蛋白G1重链恒定区(含绞链区)(IgG Fc)(222-445位氨基酸残基)。(2)嵌合蛋白huTNFRIIIgG1Fc全长453个氨基酸，分子量约为50kD，由三部分组成可溶性肿瘤坏死因子受体II(sTNFRII)(1-217位氨基酸残基)，连接短肽(218-226位氨基酸残基，氨基酸序列为-GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGly Ser-)，人免疫球蛋白G1重链恒定区(含绞链区)(IgGFc)(218-451位氨基酸残基)。
4.根据权利要求1所述，利用该重组表达载体生产的药用盐，其特征为可用于成人类风湿性关节炎(RA)、儿童多发性风湿性关节炎(JRA)、脓毒症、慢性心衰和系统性红斑狼疮(SLE)等自身免疫性疾病的治疗。
全文摘要
本发明包括编码人肿瘤坏死因子可溶性受体免疫球蛋白G1重链恒定区嵌合蛋白(husTNFRIgG
文档编号C12N15/62GK1408875SQ0113603
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月29日 优先权日2001年9月29日
发明者徐春晓, 张智清 申请人:中国预防医学科学院病毒所