专利名称：Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种Vero细胞森林脑炎灭活疫苗及其制备方法，特别是工业化制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的方法及由此方法制备的疫苗。
背景技术：
森林脑炎是由森林脑炎病毒引起的，以蜱类为主要传染源，以侵犯中枢神经系统为主的自然疫源性急性传染病，病死率在20-30％，是一种严重危害人民健康的病毒性传染病。
用于预防森林脑炎的疫苗。先后经历了用鼠脑、鸡胚、地鼠肾等基质制备森林脑炎灭活疫苗，目前我国使用的是地鼠肾细胞森林脑炎灭活疫苗；国外使用的是鸡胚细胞森林脑炎灭活疫苗；重组基因工程疫苗正处于研究之中，但至今尚无重大突破。
中国当前生产使用的地鼠肾森林脑炎灭活疫苗，对于降低森林脑炎的发病率确实起到了重要的作用，使森林脑炎的发病率得以下降，但是其免疫效果并不理想，二针免疫后人体的抗体阳转率33％左右，加强免疫一针后人体的抗体阳转率50％左右，且30％发病者有疫苗接种史，加之接种后有严重的副反应，可见现用疫苗的应用效果并非理想。
现用技术中生产森林脑炎疫苗存在的主要问题是，疫苗生产中因使用动物原代细胞培养，所使用动物的饲养、繁殖、无菌条件的控制及解剖均存在诸多不便，从而限制了生产规模，且无法保证这些来自普通动物级的细胞基质不携带外源因子，更不适合大规模工业化生产。
因此，急需一种更安全、更有效的森林脑炎疫苗用于人们预防接种。使用一种既对森林脑炎病毒敏感又可用于旋转培养的传代细胞基质是解决问题的重要途径之一。
Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiopsmonkey)肾建立的猴肾细胞系。其93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCCNO.CCL-81。经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，已被WHO证明可作为疫苗生产的基质(WHO Tech.Rep.Ser.，1987，1)。Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国培养研制出来并获批准生产，并且有关应用Vero细胞制备疫苗的研究时有报道，但关于应用Vero细胞制备森林脑炎疫苗的研究还未见报道。
我们通过试验证明Vero细胞也是森林脑炎病毒的敏感细胞，用其制备森林脑炎疫苗，一方面可避免动物原代细胞培养可能带来的外源因子的污染，可事先控制细胞的质量；另一方面可通过利用病毒在细胞系中繁殖和增殖来实现高度工业化的方法，大量生产疫苗，简化工艺。这不仅由于可避免必须处理相当大数量的动物，而且用于感染的细胞基质容易控制在均一的水平，可控制并获得满意的产率。
综上所述，本发明克服现有技术的缺点，提供了Vero细胞森林脑炎灭活疫苗及其生产的方法，该方法可在安全、迅速和经济的条件下应用于大规模生产，并且可获得高纯度、理想工业产率的有效疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的方法，该方法的核心是利用Vero细胞工业化大规模生产森林脑炎灭活疫苗。
本发明的另一目的在于提供一种安全有效的人Vero细胞森林脑炎灭活疫苗。通过细胞系的Vero细胞培养而获得的疫苗，包含森林脑炎病毒，并且细胞DNA含量小于100pg/剂。该疫苗既具有功效又具有对可能与病毒接触的任何人进行全身性给药时所必需的安全性。
本发明的其他目的，在下面对本发明的具体描述中体现出来。
附图1是本发明优选的制备Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的工业化生产流程示意图。
本申请人经过长期研究发现，Vero细胞也是森林脑炎病毒的敏感细胞，适合于森林脑炎病毒灭活疫苗的生产，特别是选择森“张”病毒株作为森林脑炎病毒，采用Vero细胞生产森林脑炎病毒灭活疫苗。
Vero细胞最早来源于ATCC，本发明采用的Vero细胞来源于中国药品生物制品检定所，代次为126代。
将126代Vero细胞经过传代扩增后液氮冻存，作为细胞主代种子库；由细胞主代种子库细胞传代扩增后，液氮冻存作为生产细胞工作种子库(MWCB)；由生产细胞工作种子库细胞制备生产用细胞。
细胞传至170代，进行细胞致肿瘤原性试验Vero细胞致肿瘤原性试验阴性，证实Vero细胞安全可靠、未发生致瘤性变异；细胞传代稳定性试验细胞形态特征观察用显微镜观察，发现细胞贴壁及生长良好，与生产细胞工作种子库细胞无变异，证实细胞传代是稳定的；细胞外源因子检查试验传代细胞的无菌试验、支原体检查及外源因子检查均为阴性；核型的染色体数目分布高峰(56-58条)分析表明，与美国ATCC报告的(47-60条)基本一致。按鉴定代次前推10代即160代，作为疫苗生产用细胞最高代次，在此限定代次内，可提供大批量的培养基质，满足生产需要，并能保证其用于疫苗生产是安全可行的。结果见表1。
根据本发明，一种Vero细胞森林脑炎灭活疫苗，其特征在于该疫苗包含有效量的在Vero细胞上增殖的灭活森林脑炎病毒及其疫苗佐剂，其中该灭活森林脑炎病毒优选来自森“张”病毒株P9-3。
森“张”株病毒在病毒学属于黄病毒属黄病毒科(Flaviviridae-Flavivirus)。该病毒株的鼠脑株，森“张”株P9-3，由本申请人保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉的武汉大学，其保藏号为CCTCC V202004，保藏日期为2002年9月9日。
该Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的疫苗病毒株的病毒感染滴度，可达到并稳定在8.001gLD50/ml，经全面检定，证明病毒生物学活性稳定，抗原性广谱和免疫原性良好，无污染外源因子。检定结果见表2。
本发明的Vero细胞森林脑炎灭活疫苗，还含有常用病毒稳定剂，优选为人血清白蛋白。
根据本发明，该佐剂为常用疫苗佐剂，如Al(OH)3等等。
根据本发明，一种Vero细胞森林脑炎病毒灭活疫苗的制备方法，包括通过Vero细胞用森林脑炎病毒株制备病毒液，以及用诸如佐剂、稳定剂等把纯化的病毒液配制成疫苗。
(1)细胞培养细胞培养采用Vero细胞。Vero细胞可在适宜的细胞培养瓶中静止或旋转瓶旋转进行培养。Vero细胞的培养，可使用适宜的动物细胞培养液，PH为7.0-8.0，培养温度36-38℃，细胞的接种浓度为1.0×104-106/ml。待细胞长成单层时接种病毒。
根据本发明，所用的适宜动物细胞培养液，可以是常用的细胞培养液，例如，4-10％(优选6-8％)的小牛血清的MEM液或199液等等。PH为7.0-8.0，培养温度36-38℃。
(2)病毒接种在Vero细胞长成单层时接种森林脑炎病毒，如森“张”病毒株。病毒的感染剂量(M.O.I)为0.01-1.0，优选为0.01-0.05，更优选为0.01。
(3)病毒液收获病毒在感染细胞中繁殖和增殖，产生病毒悬液形式的病毒液，将森林脑炎疫苗株病毒接种到上述的细胞基质中，收获培养3-5天后的细胞培养病毒液。
收获病毒液后，可添加新鲜的培养液继续培养，待病毒增殖后再次收获病毒液；可连续多次添加培养液和收获病毒液。多次收获病毒液可为1-9次。
(4)病毒灭活病毒液用化学试剂，如福尔马林，灭活病毒。如果是多次收获病毒液，可合并各次的病毒液，然后用化学试剂灭活病毒。灭活前后均需取样进行无菌试验，测定病毒滴度以及灭活后需进行病毒灭活试验。
根据细胞培养液的不同，按照本发明收获的病毒液，可为含有动物血清或不含动物血清的病毒培养液。
采用适当浓度的灭活剂，在合适的温度和时间下，使病毒失去感染力，但保持病毒的抗原性和免疫原性。例如，灭活时，甲醛的浓度为1/2000～1/6000；灭活条件在37℃，2～3天；20～25℃，7～14天；4～8℃，14～21天，均可灭活病毒，本发明优选甲醛的浓度为1/4000，灭活温度和时间为20～25℃，16～24小时；4～8℃，14天。
(5)疫苗原液纯化离心或澄清膜处理上述收获的病毒液，去除细胞碎片的杂质，取上清液，待进一步纯化。按照本发明，此步骤中连续离心的条件为8000-10000转/分，4-8℃。澄清膜优选0.4um澄清膜。
以传代细胞制备生物制品安全性的关键是细胞残余DNA的含量。按WHO规程的要求，疫苗的细胞基质DNA必须小于100pg/剂量。
有关疫苗的进一步纯化方法，经反复试验和研究，本发明提出了优选的疫苗原液的进一步纯化方法离心后的疫苗原液浓缩后，通过柱层析来实现。
柱层析优选凝胶过滤层析。凝胶过滤层析技术简单，条件最温和，对保持生物大分子的活性是最有力的方法，适合分离分子量悬殊的物质。森林脑炎病毒的分子量在3×106以上，与疫苗中的杂蛋白分子量相差较大，故使用凝胶过滤层析可以非常方便有效地去除疫苗中残留的小分子杂质。凝胶过滤的洗脱速度为10～200ml/分钟，温度为4～25℃。
(6)疫苗配制将纯化的病毒悬液用佐剂配制成药物形式，如疫苗，以便于保存和使用。如果需要，疫苗中可以加入病毒稳定剂，如人白蛋白等等，或添加其他辅剂。
本发明的纯化疫苗还含有常用防腐剂，例如硫柳汞。
根据本发明，病毒灭活，可以在疫苗原液纯化之后进行，优选在疫苗原液纯化之前进行。
根据本发明的具体特征，细胞的病毒感染是在病毒培养液的存在下进行。所用的病毒培养液，可以是常用的病毒培养液，如含0.1-0.2％人白蛋白的MEM液；0.5-2.0％小牛血清的MEM液；含0.1-0.2％人白蛋白或0.5-2.0％小牛血清的199液。根据具体情况，选择合适的细胞维持时间。例如，多次换含1-2％小牛血清的MEM液可维持30天，最多可达50天。PH为7.0-8.0，培养温度32-35℃。
根据本发明的具体特征，Vero细胞感染病毒后可以多次收集病毒液的方法，特别有利于工业化生产本发明的Vero细胞森林脑炎灭活疫苗。
根据实施本发明的另一具体优选方案，该方法中纯化病毒悬液的步骤，是用连续流离心机离心灭活的病毒液后，经超滤浓缩，再经过Sepharose 4FF柱层析，来得到本发明的纯化疫苗。超滤优选100Kd的超滤膜。
本发明与目前使用的来自动物原代细胞培养的疫苗相比，最主要的优点如下(1)Vero细胞已被证明不含任何污染外源因子和致瘤性，作为生产疫苗的基质，明显优与于现行疫苗的动物原代细胞培养；(2)Vero细胞疫苗的毒种是细胞培养毒种，从根本上避免使用动物脑组织；(3)用传代细胞-Vero细胞生产疫苗的工艺，适合于工业化生产批量的均质疫苗，这是现行动物原代细胞培养疫苗办不到的；(4)本发明的Vero细胞森林脑炎灭活疫苗经纯化后疫苗中的抗原含量、免疫原性明显提高，杂蛋白减少，疫苗的质量大大提高。
本发明的森林脑炎病毒灭活疫苗，可用于预防森林脑炎病毒的感染。本发明的森林脑炎病毒灭活疫苗，可以采用肌肉注射的方式给药，也可以采用其他合适的方式给药。
下面参照附图1，对本发明的工业化生产Vero细胞森林脑炎灭活疫苗的一种优选实施方案，作进一步的描述。本文中所涉及的原材料和设备，如无特别说明，均可从市场上购得。
1.细胞系细胞(Vero细胞)的制备取细胞主代种子库细胞制备生产细胞种子库细胞；再用生产细胞种子库细胞制备生产用细胞；方法为取已长成单层的种子批Vero细胞，弃去细胞生长液后加入pH7.6-8.0的0.1-0.5％的胰酶，置37℃消化15-40分钟，弃去胰酶液，用新鲜细胞生长液轻轻分散细胞，使之悬于含有6-8％的小牛血清MEM液的细胞生长液内，制备成细胞悬液，摇均后分装于3立升培养瓶，200ml-600ml/瓶。将细胞培养瓶置于37℃恒温室旋转培养2-3日后，在细胞瓶的瓶壁上可形成均匀、致密的细胞单层。
2.病毒感染、病毒液收获、灭活方法一选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶，弃去细胞生长液，用Earle′s液或生理盐水冲洗2-3分钟后感染，毒种接种剂量为感染复数为0.02-0.5，毒种稀释液为含0.1-0.5％人白蛋白MEM液，将感染病毒后的细胞瓶置32-34℃恒温室内旋转培养16-20小时，弃去病毒液，加入含0.1-0.2％人白蛋白MEM液，继续置32-34℃恒温室内旋转培养至60-72小时，视细胞病变情况收获病毒液，抽样作无菌试验和病毒滴定，将收获的病毒液合并后加入1/2000-1/6000福尔马林液(灭活剂)和1/20000硫柳汞，置37℃，16-24小时后再于4-8℃灭活14日；或于4-8℃灭活21日方法二选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶弃去生长液后感染疫苗株病毒毒种，毒种接种剂量为感染复数为0.02-0.5，毒种稀释液为含0.5-1.5％小牛血清MEM液，将已感染病毒的细胞瓶置32-34℃恒温室内旋转培养60-72小时，视细胞病变情况收获病毒液，收获的同时再加入含0.5-1.5％小牛血清MEM液，置32-34℃恒温室内旋转培养24-48小时，视病变情况再次收获病毒液，如此连续收获病毒培养液，各次收获液均抽样作无菌试验和病毒滴定，并按方法一的方法灭活。灭活后得到的病毒液即为疫苗原液。
3.疫苗原液的离心(粗提)将经无菌试验、灭活试验检定合格后的疫苗原液，经连续流离心或澄清膜除去细胞碎片等杂质后待进一步纯化。
4.疫苗的纯化(精提)此方法适合于Vero细胞森林脑炎疫苗的纯化。将经连续流离心已除去细胞碎片等杂质的疫苗原液，用截留分子量100kd的超滤膜超滤浓缩，并用pH7.6-7.8的0.01MPBS缓冲液平衡，浓缩30-80倍，收集浓缩液。然后选择Sepharose 4FF介质，用pH7.6-7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析，用紫外监测仪(A280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，抽样检测蛋白或抗原含量，根据蛋白或抗原含量稀释到一定浓度后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1-0.2％人白蛋白和0.45-0.55mg/ml的AL(OH)3佐剂。然后作无菌试验、热原质试验，检定合格后进行分装，即为成品。成品检定包括外观检查、无菌试验、效力试验、毒性试验、细胞DNA含量测定、甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、AL(OH)3含量测定、pH值测定等。
本发明制备的Vero细胞森林脑炎灭活疫苗，适合于森林脑炎疫区易感人群及进入该地区的易感人员使用。
下面通过实施例，对本发明的内容作更进一步的描述。
实施例1取已长成单层的生产用Vero细胞瓶，弃去细胞生长液后加入pH7.6-8.0的0.1-0.5％的胰酶，置37℃消化15-40分钟，弃去胰酶液，用新鲜细胞生长液轻轻分散细胞，使之悬于含有6-8％的小牛血清MEM液的细胞生长液内，制备成细胞悬液，摇均后分装于3立升培养瓶，200ml-600ml/瓶。将细胞培养瓶置于37℃恒温室旋转培养至细胞长成均匀、致密的单层。
选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶，弃去细胞生长液，用Earle′s液冲洗2-3分钟后感染疫苗病毒株毒种(毒种感染剂量为感染复数为0.02-0.5，毒种稀释液为0.1-0.2％人白蛋白MEM液)，将毒种液加入待感染的细胞瓶内，400-1000ml/瓶，置32-34℃恒温室内旋转培养18小时，弃去病毒液，加入含0.1-0.2％人白蛋白MEM液，继续置32-34℃恒温室内旋转培养至68小时，收获病毒液，抽样作无菌试验和病毒滴定，将收获的病毒液加入1/4000福尔马林液(灭活剂)及1/20000硫柳汞，置37℃，16-24小时后再于4-8℃灭活14日；或于4-8℃灭活21日，灭活后得到的病毒液即为疫苗原液。
经无菌试验、灭活试验检定合格后的疫苗原液，经连续流离心或澄清膜处理除去细胞碎片等杂质后，用截留分子量100kd的超滤膜超滤浓缩，并用pH7.6-7.8的0.01MPBS缓冲液平衡，浓缩50倍，收集浓缩液。然后用Sepharose 4FF介质，经pH7.6-7.8的0.01MPBS缓冲液平衡后，进行柱层析，用紫外监测仪(A280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，抽样检测抗原含量，稀释后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1-0.2％人白蛋白和0.45-0.55mg/ml AL(OH)3佐剂。然后作无菌试验、热原试验、细胞DNA含量测定，检定合格后分装，即为本发明的纯化疫苗成品。成品检定包括外观检查、无菌试验、效力试验、毒性试验、细胞DNA含量测定、甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、AL(OH)3含量测定、pH值测定等。检定结果见表3。
实施例2取已长成单层的生产用Vero细胞瓶，弃去细胞生长液后加入pH7.6-8.0的0.1-0.5％的胰酶，置37℃消化15-40分钟，弃去胰酶液，用新鲜细胞生长液轻轻分散细胞，使之悬于含有6-8％的小牛血清MEM液的细胞生长液内，制备成细胞悬液，摇均后分装于3立升培养瓶，200ml-600ml/瓶。将细胞培养瓶置于37℃恒温室旋转培养至细胞长成均匀、致密的单层。
选择细胞生长均匀、致密的单层细胞瓶，弃去细胞生长液后感染疫苗株病毒毒种(毒种感染剂量为感染复数为0.02-0.5，毒种稀释液为0.5-2.0％小牛血清的MEM液)，将毒种液加入待感染的细胞瓶内，400-1000ml/瓶，置32-34℃恒温室内旋转培养18小时，弃去病毒液，加入含0.5-2.0％小牛血清MEM液，继续置32-34℃恒温室内旋转培养至68小时，收获病毒液，收获的同时再加入含0.5-2.0％小牛血清的MEM液，400-1000ml/瓶，置32-34℃恒温室内旋转培养至24-48小时，再次收获病毒液，如此连续收获病毒培养液，各次收获的病毒液均抽样作无菌试验和病毒滴定，并按方法一的方法灭活。灭活后的病毒液即为疫苗原液。
经无菌试验、灭活试验检定合格后的疫苗原液，经连续流离心除去细胞碎片等杂质后，然后用截留分子量100kd的超滤膜超滤浓缩，并用pH7.6-7.8的0.01MPBS平衡浓缩液，浓缩50倍，收集浓缩液。然后用Sepharose 4FF介质，经pH7.6-7.8的0.01MPBS平衡后，进行柱层析，用紫外监测仪(A280nm)检测洗脱液，收集洗脱的第一峰为森林脑炎病毒抗原，抽样检测蛋白或抗原含量，稀释后进行除菌过滤，并加入终浓度为0.1-0.2％的人白蛋白和0.45-.55mg/ml的AL(OH)3佐剂。然后作无菌试验、热原试验，检定合格后进行分装，即为本发明的纯化疫苗成品。成品检定包括外观检查、无菌试验、效力试验、毒性试验、细胞DNA含量测定、甲醛含量测定、硫柳汞含量测定、AL(OH)3含量测定、pH值测定等。检定结果见表3。
附表表1 Vero细胞主代细胞库、工作细胞库建立及检定结果
表2 Vero细胞森林脑炎毒种检定结果
表3 Vero细胞森林脑炎疫苗检定结果
权利要求
1.一种Vero细胞灭活森林脑炎疫苗，其特征在于该疫苗包含有效量的在Vero细胞上增殖的灭活森林脑炎病毒和疫苗佐剂，该灭活森林脑炎病毒来自森“张”病毒株，优选森“张”病毒株P9-3。
2.权利要求1的Vero细胞灭活森林脑炎病毒疫苗，其特征在于该佐剂为Al(OH)3。
3.权利要求1的Vero细胞灭活森林脑炎病毒疫苗，还包含病毒稳定剂，优选为人血清白蛋白。
4.一种Vero细胞灭活森林脑炎疫苗的制备方法，特征在于包含下述步骤(1)培养来自细胞系细胞的Vero细胞；(2)在培养液中，用森林脑炎病毒感染Vero细胞，在感染的Vero细胞中增殖以病毒悬液形式的病毒液，该病毒优选森“张”病毒株P9-3；(3)收获(2)步骤中得到的病毒液，(4)通过粗提、浓缩及柱层析步骤去除该病毒液中的剩余培养物和/或杂蛋白，纯化病毒悬液；(5)在(4)步骤之前或之后灭活得到的病毒液；(6)将(5)步骤中得到的纯化灭活病毒液，用佐剂配制成疫苗。
5.权利要求4的方法，特征在于感染细胞时的病毒接种剂量，相当于感染复数(M.O.I.)0.01-1.0，优选小于0.5。
6.权利要求4的方法，特征在于该粗提为离心或澄清膜处理，优选连续流离心分离。
7.权利要求4的方法，特征在于该(3)步骤收获病毒液后，还可以再加入培养液，以进一步收集病毒液，重复次数可为1至9之间。
8.权利要求4的方法，特征在于将收集的各次病毒液合并后，用化学试剂进行灭活。
9.权利要求4的方法，特征在于该浓缩为超滤浓缩。
10.权利要求4-9的方法，特征在于该柱层析为Sepharose 4FF柱层析。
全文摘要
本发明涉及一种Vero细胞灭活森林脑炎病毒疫苗以及其制备方法，特别是工业化制备方法。该疫苗包含有效量的灭活森林脑炎病毒和疫苗佐剂。本发明的制备方法是将森林脑炎病毒株如森“张”病毒接种Vero细胞，该细胞感染病毒后继续培养收获病毒培养液，可补充培养液连续培养，得到的病毒培养液经纯化后，可配制成本发明的Vero细胞森林脑炎病毒疫苗。由于使用Vero细胞培养及Vero细胞毒种，不合有污染因子和致瘤性，具有纯度高、免疫效果好的优点，特别适合大规模工业化生产。
文档编号A61K39/12GK1513553SQ0314095
公开日2004年7月21日 申请日期2003年6月2日 优先权日2003年6月2日
发明者宋宗明, 韩亮, 赵红丽, 洪成龙, 岳立广, 刘双军, 赵丽红, 钱依群, 惠连, 王晓宏, 赵建, 郝富勇, 王伟 申请人:长春生物制品研究所