专利名称：人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸及其抗SARS病毒作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及系列的人工合成的具有抗病毒作用的含CpG单链脱氧寡核苷酸，特别是涉及对SARS病毒引起的人呼吸道感染和其它感染性疾病有治疗和预防作用的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，以及用人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸治疗和预防由SARS病毒引起的人呼吸道感染和其它感染性疾病的技术方法和技术设想。
背景技术：
CpG是由胞嘧啶和鸟嘌呤通过磷酸连接成的二核苷酸。C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，p代表磷酸，胞嘧啶位于5’端。多种具有CpG结构的细菌和病毒DNA对脊椎动物的免疫系统均为危险的信号，可激活多种免疫细胞启动对细菌和病毒的抵抗机制。近年来的研究表明，人工合成的含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA(CpG ODN)也可表现强效的免疫增强和免疫调节作用，表现出明显的临床应用前景(Weiner GJ，The immunobiology andclinical potential of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotides.J Leukoc Biol2000 Oct；68(4)455-63)。
由于序列，尤其是CpG两侧的序列的不同，CpG ODN可有多种多样的形式，表现不同性质、不同强度的免疫增强和免疫调节作用。有些CpG ODN可表现出种属依赖性，即对一种动物表现免疫增强功CpG ODN，在另一种动物或人则未必表现出同样的或等效的免疫增强功能(Kamstrup S，et al.Response of porcine peripheral blood mononuclear cells toCpG-containing oligodeoxynucleotides，Vet Microbiol 2001 Feb 26；78(4)352-62；Gunther Hartmann，et al.Delineation of a CpG Phosphorothioate Oligodeoxynucleotidefor Activating Primate Immune Responses In Vitro and In Vivol The Journal ofImmunology，2000，1641617-1624)。
传染性非典型肺炎是由SARS病毒引起的人呼吸道的传染性疾病，可引发呼吸窘迫综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，感染者的死亡率为4-12％。传染性非典型肺炎的病原体是一种变异了的冠状病毒-SARS病毒。SARS病毒和已知的冠状病毒在核酸水平有50-60％的同源性。在感染者的1毫升痰液中可含有100万个SARS病毒的RNA分子，在急性期病人的血浆中和康复后期病人的粪便中也可检出SARS病毒RNA分子(ChristianDrosten，Identification of a Novel Coronavirus in Patients with Severe AcuteRespiratory Syndrome The New England Journal Of Medicine，2003，348；19)。
对由SARSB病毒引起的人呼吸道的传染性疾病和呼吸窘迫综合征(severe acuterespiratory syndrome，SARS)尚无有效的疗法。
发明内容
发明概述本发明的目的之一是提供系列人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸特别是对可刺激人外周血细胞产生抗病毒尤其是抗SARS病毒物质的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成，其磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。优选地，本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有SEQ ID NO1-8所示的序列。
本发明的目的之二是提供本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗病毒作用、特别是抗SARS病毒的作用。
本发明的目的之三是提供本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸对SARS病毒感染引起的人呼吸道的传染性疾病和呼吸窘迫综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)的治疗和预防的作用。
本发明的目的之四是提供用人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸治疗和预防由SARS病毒感染引起的人呼吸道的传染性疾病和呼吸窘迫综合征(severe acute respiratorysyndrome，SARS)的技术方法和技术设想技术和思路。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以直接推知的。
具体实施例方式
在本发明的上下文中，所使用的术语除非另外说明，一般具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。特别地，下列术语具有如下的含义优选地，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有如下所示的序列DVAX-15’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’DVAX-25’-gggggACgATCgTCgggggg-3DVAX-35’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’DVAX-45’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’DVAX-55′-TCggggACgATCgTCgggggg-3′DVAX-65′-ggATCgATCgATCgATgggggg-3′DVAX-75’-TgACTgTgAACgTTCgAgATgA-3’DVAX-85’-TCgTCgAACgTTCgAgATgAT-3’其中的磷酸二酯键可以是部分硫化的，全部硫化的，也可以是未硫化的。
本发明的CpG单链脱氧核苷酸可通过已知的方法生产，例如采用固相亚磷酰胺三酯法进行生产。以下的实施例详细地例举了一种生产本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的方法。
在预防和治疗由SARS病毒感染引起的人呼吸道的传染性疾病和呼吸窘迫综合征时，这些人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的一次用药剂量为1-5000微克。
本发明的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的使用方式包括单独应用、两种或两种以上联合应用、与治疗病毒(尤其是SARS病毒)感染性疾病的药物或疫苗混合使用、与治疗和预防病毒(尤其是SARS病毒)感染性疾病的药物或疫苗通过交联剂共价偶联使用。
应用方式包括粘膜(呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜)表面应用，皮下、肌肉注射应用，胃肠应用，腹腔应用，静脉注射应用等常用的方式。
在小鼠试验中，人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸CpG单链脱氧寡核苷酸的使用量为0-500微克/小鼠，如进行人体试验则按标准的换算方法进行换算。
下面结合具体的制备实施例和生物学效果实施例，并参照附图
进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，例如合成采用固相亚磷酰胺三酯法。
在如下实施例中，所用试剂的来源、商品名和/或有必要列出其组成成分者，均只标明一次。在其后所用相同试剂如无特殊说明，不在赘述上述内容。
实施例1人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的制备采用固相亚磷酰胺三酯法合成人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸。
1、试剂和材料
三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)、可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)、DMT(二甲氧基三苯甲基)、四氮唑活化剂、乙酸酐、N-甲基咪唑、A、T、C、G四种核苷酸单体、ABI DNA合成仪、高效液相色谱层析仪等2、方法脱保护基用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在可控多孔玻璃(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团二甲氧基三苯甲基(DMT)，获得游离的5′-羟基端，以供下一步缩合反应。
活化将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3′-端已被活化，但5′-端仍受DMT保护)，此中间体将与可控多孔玻璃上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。
连接亚磷酰胺四唑活性中间体遇到可控多孔玻璃上已脱保护基的核苷酸时，将与其5′-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。
封闭缩合反应后为了防止连在可控多孔玻璃上的未参与反应的5′-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。
氧化缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在可控多孔玻璃上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。
经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到可控多孔玻璃的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5′-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。
未硫化的CpG单链脱氧寡核苷酸在ABI 3900 DNA合成仪上合成；全硫化及部分硫化CpG单链脱氧寡核苷酸的合成采用置换法，在ABI 394 DNA合成仪上合成。
实施例2、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗病毒作用1、滤泡口炎病毒(VSV)的扩增仪器设备和材料低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
RPMI1640培养基含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，2.0克碳酸氢钠，10万单位庆大霉素，加三蒸水至体积1000毫升。0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。
方法用含10％小牛血清(Invitrogen，经56℃30分钟处理)的RPMI1640培养基培养人羊膜上皮细胞(FL)。在100ml培养瓶中长成单层后，更换培养液。加入含滤泡口炎病毒(VSV)的培养液，其含量为400TCID50/ml。设无病毒对照。约24-48小时后，感染VSV的人羊膜上皮细胞几乎全部发生病变，收集病变细胞和上清，将其置-20℃过夜。次晨，将其融解，用吸管猛烈吹打，离心收取上清。在测定TCID50后，将上清贮存于-20℃备用。
2、滤泡口炎病毒(VSV)TCID50的测定仪器设备和材料低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
RPMI1640培养基含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，2.0克碳酸氢钠，10万单位庆大霉素，加三蒸水至体积1000毫升。用0.22微米的滤膜滤过除菌、分装。
含10％小牛血清的RPMI1640培养基10毫升小牛血清(Invitrogen，经56℃ 30分钟处理)，90毫升RPMI1640培养基。
0.5％结晶紫染液结晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50毫升无水乙醚。加3毫升甲醛，47毫升蒸馏水。结晶紫脱色液50毫升乙二醇单甲醚与50毫升蒸馏水混合。0.25％胰蛋白酶(Trypsin)方法用0.25％胰蛋白酶消化生长良好的人羊膜细胞，5分钟。离心(1000rpm，5分钟)洗涤细胞。用10％小牛血清的RPMI1640培养基调细胞浓度为4×105个/毫升。加细胞悬液于96孔平底培养板(Costar)，每孔100微升，设三个复孔。37℃ CO2孵箱培养24小时后，细胞形成单层。更换培养液，其中含倍比稀释的待滴定VSV。设无VSV对照。24小时后，用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液，每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。每孔加入200μl结晶紫脱色液，振荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出，用分光光度计在540nM波长处比色。以出现50％细胞病变的病毒稀释度的倒数×10为此病毒液的TCID50/毫升数值。
3、人外周血单个核细胞的分离仪器设备和器材低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、滤菌器、滤过瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管、血球计数板、水平式离心机等。
试剂和材料肝素抗凝的人全血长春市中心血站。
聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，北京鼎国生物技术有限公司。
RPMI1640培养液L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，碳酸氢钠2.0克，庆大霉素10万单位，加三蒸水至1000毫升。0.22微米的滤膜抽滤除菌、分装。
方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液分离人外周血的单个核细胞。分层液与肝素抗凝外周血的体积比约为2∶1。水平离心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含单个核细胞的液带，置入另离心管中。加入等体积的无血清培养基。1,000g离心15min，弃上清。重复洗涤两次。弃上清，用2ml培养基重悬细胞。计细胞数。
4、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸抗病毒作用的测定用含10％小牛血清的RPMI1640培养基调人外周血单个核细胞的终浓度为3×106个/毫升。加细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸(6μg/ml)。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清。
将生长状态良好的人羊膜上皮细胞接种于96孔培养板，每孔3×104/100μl。按照表-1，表-2加入CpG刺激上清及IFN-α2b(赛诺金)标准品，37℃5％CO2培养24小时后，加入250TCID 50/ml的VSV病毒，培养48小时。用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液。每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。每孔加入200微升结晶紫脱色液，振荡器振荡，使染料完全从细胞内脱出，用分光光度计在540nM波长测定分光光度值。结果见表-1a，表1-b和表-2a，表2-b。
表-1a96孔板各孔待测定的样品
注释DVAX-1对照是人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，其序列为5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’Medium代表未加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的培养上清DVAX1，2，7，8代表加代号为DVAX1，2，7，8人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的培养上清表1-b人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗病毒作用
注释表中的数值为用分光光度计在540nM波长测定分光光度值。分光光度值的大小和细胞受保护的程度成正比。
表-2a96孔板各孔待测定的样品
注释DVAX-3对照是人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，其序列为5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’DVAX-4对照是人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，其序列为5’-TgCAgCTTgCTgCTTgCTgCTTC-3’Medium；代表未加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的培养上清DVAX3，4，5，6分别代表加代号为DVAX3，4，5，6人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的培养上清表1-2人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗病毒作用
注释表中的数值为用分光光度计在540nM波长测定分光光度值。分光光度值的大小和细胞受保护的程度成正比。
实施例2的实验证明，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有明显的抗病毒作用。
实施例3、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸抗SARS病毒的作用测定仪器设备和材料低温冰箱、二氧化碳孵箱、超净工作台、倒置显微镜、液氮罐、蒸馏水器、真空泵、细胞培养瓶、各种规格的吸管、加样器、滴管等。
RPMI1640培养基含L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，2.0克碳酸氢钠，10万单位庆大霉素，加三蒸水至体积1000毫升。0.22微米的滤膜真空泵抽滤除菌、分装。0.5％结晶紫染液结晶紫0.5克，NaCl 0.85克，溶于50毫升无水乙醚。加3毫升甲醛，47毫升蒸馏水。
方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴细胞分层液分离人外周血的单个核细胞。分层液与肝素抗凝外周血的体积比约为2∶1。水平离心(1,000xg，20min)。用吸管吸取含单个核细胞的液带，置入另离心管中。加入等体积的无血清培养基。1,000g离心15min，弃上清。重复洗涤两次。弃上清，用2ml培养基重悬细胞。计细胞数。
用含10％小牛血清的RPMI1640培养基调人外周血单个核细胞的终浓度为3×106个/毫升。加细胞悬液于12孔培养板，每孔2ml。加人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸(6μg/ml)。37℃，5％二氧化碳孵箱培养48小时，收集上清。
将生长状态良好的Vero细胞接种于96孔培养板，每孔3×104/100μl。按照表-1a，表-2a加入人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸刺激上清及IFN-α2b(赛诺金)标准品，37℃5％CO2培养24小时后。加入250TCID 50/ml的SARS病毒，培养72小时。用结晶紫染色的方法判定细胞病变的程度。吸弃培养液。每孔加200μl 0.5％结晶紫染液，37℃，15分钟。流水冲掉结晶紫染液。室温干燥后照相记录结果。
图-1、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗病毒作用注释96孔板各孔待测定的样品如同表-1a各孔颜色的深度和细胞受保护的程度成正比。颜色越深，存活的细胞越多。
图-2、人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗病毒作用注释96孔板各孔待测定的样品如同表-2a各孔颜色的深度和细胞受保护的程度成正比。颜色越深，存活的细胞越多。
实施例3的实验证明，本发明的含CpG单链脱氧寡核苷酸具有明显的抗SARS病毒的作用。应用本发明提供的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸可治疗和预防由SARS病毒感染引起的人呼吸道的传染性疾病和呼吸窘迫综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)。此外，应用本发明提供的技术设想，可用人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸来治疗和预防由SARS病毒感染引起的人呼吸道的传染性疾病和呼吸窘迫综合征(severe acuterespiratory syndrome，SARS)。
SEQUENCE LISTING<110>长春华普生物技术有限公司<120>具有抗病毒尤其是抗SARS病毒作用的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸及人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸抗SARS病毒的作用<160>8<210>1<211>26<212>DNA<213>artificial<400>1tcgtcgggtg cgacgtcgca gggggg 26<210>2<211>20<212>DNA<213>artificial<400>2gggggacgat cgtcg ggggg 20<210>3<211>20
<212>DNA<213>artificial<400>3tcgtcgtttc gtcgttgggg 20<210>4<211>23<212>DNA<213>artificial<400>4tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23<210>5<211>21<212>DNA<213>artificial<400>5tcggggacga tcgtcggggg g21<210>6<211>22<212>DNA<213>artificial<400>6ggatcgatcg atcgatgggg gg 22
<210>7<211>22<212>DNA<213>artificial<400>7tgactgtgaa cgttcgagat ga 22<210>8<211>21<212>DNA<213>artificial<400>8tcgtcgaacg ttcgagatga t2权利要求
1.人工合成的含CpG单链脱氧核苷酸，它们由含一个或多个CpG的寡核苷酸单链DNA分子构成。
2.按照权利要求1所述的单链脱氧核苷酸，它们的磷酸二酯键可以是非硫化的，部分硫化的，也可以是完全硫化的。
3.按照权利要求1所述的含CpG单链脱氧核苷酸，它们具有SEQ ID NO1-8任一所示的序列。
4.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于诱生细胞产生抗病毒尤其是抗SARS病毒的物质的用途。
5.按照权利要求1-3中任一项所述的含CpG单链脱氧核苷酸用于抗SARS病毒和治疗和预防由SARS病毒引起的人呼吸道感染和其它感染性疾病的用途。
6.用人工合成的含CpG单链脱氧核苷酸治疗和预防由SARS病毒感染引起的人呼吸道感染和其它感染性疾病的技术方法和技术设想。
全文摘要
本发明提供了系列的人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸，它们由含一个或多个CpG的脱氧寡核苷酸单链DNA分子构成，能够刺激人外周血单个核细胞(PBMC)产生抗病毒物质，这些物质可作用于细胞使其抵抗病毒尤其是SARS病毒的攻击；提供了人工合成的含CpG单链脱氧寡核苷酸的抗SARS病毒作用和对SARS病毒引起的人呼吸道感染和其它感染性疾病的治疗和预防作用。
文档编号A61K31/7084GK1498895SQ0314082
公开日2004年5月26日 申请日期2003年5月28日 优先权日2003年5月28日
发明者王丽颖, 包木胜, 于永利 申请人:长春华普生物技术有限公司