专利名称：抑制cd36以控制肥胖和胰岛素敏感性的制作方法
抑制CD36以控制肥胖和胰岛素敏感性优先权信肩、本申请要求2010年6月I日递交的美国临时申请61/350，274的优先权，其全部内容并入本申请。政府咨助本发明在由美国国立卫生研究院提供的政府资助下完成，基金号为NHLBIR01HL082511、NHLBI3R01HL082511-04S1、和 NCRR UL1RR024996-03。美国政府对本发明享
有一定权利。`
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背景技术：
⑶36是一种在多种类型的细胞和组织中表达的多功能受体，包括脑小胶质细胞和星形胶质细胞以及单核细胞/巨噬细胞和脂肪细胞。CD36识别多种配体，包括氧化的或修饰的低密度脂蛋白(oxLDL、mLDL)、长链脂肪酸(LCFA)、细菌细胞壁的脂质和脂蛋白组分、血小板反应素(TSP)-1和-2、纤维样β-淀粉样蛋白( β )、和濒死细胞(详细的综述，参见 Febbraio, Μ.，et al. , J Clin Invest108:785-791(2001) ；Febbraio, Μ. , et al. , Int JBiochem Cell Biol39:2012-2030 (2007))。通过CD36的配体识别启动吞噬细胞如巨噬细胞的信号级联，导致配体(如脂质和脂肪酸)以及与配体连接的任何其他材料如细胞组分、细菌等的吞噬。通过表达CD36的巨噬细胞使oxLDL内化，这能够形成富含脂质的“泡沫细胞”和动脉粥样硬化斑块、促炎性反应、细胞因子释放、和/或产生活性氧物质，而通过表达⑶36的小胶质细胞使β-淀粉样肽内化，这可能与阿尔茨海默氏症有关(Silverstein RLet al，Sci Signal2:re3(2010))。CD36还在味蕾细胞和肠细胞中表达，已发现其与对高脂饮食的偏好有关(Laugerette F et al. , J Clin Investll5:3177_3184(2005))。因其表达广泛并且具有识别多种配体的能力，⑶36参与了多种调控过程，包括炎症、血管生成、天然免疫、机体对外源性和天然底物的清除和脂质代谢。CD36表达/功能的增加与动脉粥样硬化、中风、和神经退行性疾病的病理学有关(Febbraio, M.，et al.，JClin Investl08:785-791(2001))。尽管已知CD36在动脉粥样硬化损伤发展中的作用，但是其对体重和胰岛素敏感性的影响尚不清楚，部分原因是在代谢研究中使用的遗传模型不同，并且通过多种方法除去或降低这些模型中的CD36。常见的动脉粥样硬化和脂质疾病模型有机体是载脂蛋白E敲除(“ApoE K0”)小鼠,其缺乏从机体内清除极低密度脂蛋白颗粒的能力(Zhanget al.，Science258:468-471，1992)。饲喂正常饮食的ApoE KO小鼠就会出现高胆固醇血症和动脉粥样硬化斑块，虽然其在非高脂饮食下不会出现肥胖。在一项研究中，与饲喂高脂饮食的ApoE KO小鼠相比，饲喂高脂饮食的ApoE/CD36双敲除小鼠体重略有增加(Febbraio, M. , et al. , J Clin Investl05:1049-1056 (2000));而另一项研究发现，ApoEKO小鼠和用CD36拮抗剂EP80317处理的ApoE KO小鼠的体重没有差异(Marleau, S.，etal. , Faseb J19:1869-1871 (2005)) 某些证据表明，⑶36的表达和/或功能可能与糖尿病状况有关。但是，⑶36在胰岛素抵抗中的作用存在较大争议。在受损的胰岛素敏感性与CD36介导的炎性应答调节之间存在潜在的相互作用。在糖尿病ob/ob小鼠中，作为对受损的胰岛素信号的应答，巨噬细胞⑶36的表达增加，给予罗格列酮(一种胰岛素敏化剂)使得⑶36在这些小鼠中的表达降低(Liang CP, et al. , J Clin Investll3:764-773 (2004))。此外，已确定葡萄糖与 CD36 表达之间存在关联(Sampson, M. J. , et al. , Atherosclerosis 167:129-134(2003)
;Greenwalt, D. E. , et al. , J Clin Invest9:1382-1388(1995);Susztak, K. , et al. , PLoSMed2，e45(2005))。这些发现表明，⑶36与胰岛素信号的受损有关。另一方面，表达突变CD36 的 SHR 大鼠患有糖尿病(Aitman, T. J.，et al.，Nat Genet21:76-83 (1999))。表现出更多致动脉粥样硬化特性的CD36K0小鼠不患有糖尿病(Febbraio，M.，et al.，J BiolChem274:19055-19062 (1999))。这些发现提示，CD36在调控碳水化合物/脂质代谢中具有显著的潜在复杂性，需要对其进行进一步的研究。发明概沭本申请提出的前提是发现抑制CD36的治疗用途，以减轻体重，抑制脂肪堆积(特别是内脏脂肪堆积)，改善胰岛素敏感性，降低血糖水平，治疗和预防代谢综合征、糖尿病前期和糖尿病，以及降低血浆胆固醇和脂质水平和减少肝脏脂肪沉积。CD36拮抗剂，包括SAB或其代谢产物，如RA和DSS，用于这些目的。附图简要说明
图1A-1I。SAB长期治疗对生理应答的体内作用。(A)，在溶剂(Veh)-和丹酚酸(SAB)治疗的小鼠中，饲喂高脂饮食8周后ApoE KO小鼠的体重变化。(B)，在饲喂高脂饮食8周结束时的图。图中可见，SAB治疗的小鼠脂肪堆积显著降低。(C)，空腹血液葡萄糖水平。(D)，葡萄糖耐量检测。(E)，曲线下面积(AUC)。(F)，在溶剂和SAB治疗的小鼠中，腹腔巨噬细胞和脾脏中的⑶36mRNA水平。(G)，血管内的脂质含量检测结果。使用已公开的方法(Kim et al.，2008)对脂质进行提取和测定。(H)，在高脂饮食4和8周后，血浆胆固醇水平的增加倍数。(I)，溶剂和SAB治疗的小鼠肝脏的油红O染色。值得注意的是，在溶剂治疗的小鼠肝脏中观察到的大量的和较大的脂滴(深灰/黑色区域)在SAB治疗的小鼠的肝脏中显著减少。括号中的数字表示检测的动物数。图2A-2B。SAB (IOOmgAg)治疗8周的饲喂高脂饮食的ApoE KO小鼠的内脏脂肪重量。隔日皮下注射给予100mg/kg SAB或溶剂(veh)。n=8_10/组。(A),体格检查证实腹部脂肪减少。(B)，SAB使内脏脂肪的重量从平均=Slmg/动物减少至平均=32mg/动物。***,ρ〈0· 001。图3。CD36缺陷减轻ApoE KO小鼠的体重。向六周龄的ApoE KO和ApoE/CD36双KO (DKO)小鼠饲喂8周高脂饮食，每周测定一次其体重增量。与带有野生型⑶36的ApoEKO小鼠的体重增量(体重增量=41%)相比，⑶36缺陷ApoE KO小鼠的体重增量(体重增量=34%)显著降低。图4。CD36siRNA的效能。将20nM siRNA单独或组合转染至C8-D1A细胞中。24h后测定⑶36mRNA的水平。N=4。将阴性对照调整至siRNA的量。与相应对照比较，**p〈0. 01，***ρ〈0· 001。图5。SAB对ApoE KO小鼠的巨噬细胞中脂质堆积的作用。将原代巨噬细胞接种在4室玻片中，然后使用20 μ g/ml oxLDL和/或不同浓度的SAB孵育48h。(A-D)使用油红O对脂质染色并用显微镜检查；给出代表图。(A)，仅溶剂；(B)，25 μ M SAB治疗；(C)，20 μ g/ml oxLDL ； CD), 20 μ g/ml oxLDL+25 μ M SAB。比例尺50 μ m ;油红0染色更高放大倍数的显微图列于各图的右上角。(E-F)，在原代巨噬细胞中对泡沫细胞进行定量检测。白色柱，仅使用溶剂(无oxLDL或SAB)孵育的巨噬细胞；黑色柱，使用20 μ g/ml oxLDL孵育的巨噬细胞；灰色柱，使用20 μ g/ml oxLDL加10、25或100 μ M SAB孵育(SAB的浓度列于各柱的下方)的巨噬细胞；(E)脂质堆积程度，以归一化的光密度强度计；(F)，与使用溶剂孵育的对照巨噬细胞的平均面积比较的泡沫细胞的平均面积。将对照(溶剂治疗)平均单个巨噬细胞尺寸/面积归一化为I ;脂质内化的结果使得经oxLDL处理的巨噬细胞显示出个体相对细胞面积增加(黑色柱);SAB治疗(灰色柱)减少脂质内化和相对细胞尺寸/面积。n=3-6个细胞 / 组。与无 oxLDL (0)比较，**，***ρ〈0· 01，0· 001。发明详沭在下述说明书中，引用附图作为其中的一部分，附图显示了利用能够实施的特定实施方式进行的说明。对这些实施方式进行了详细描述以使得本领域技术人员能够实施本发明，应理解在不脱离本发明主旨的前提下，还可以利用其他实施方式以及对其进行合乎逻辑的变换。因此，下述说明书中的示例性实施方式不具有限定作用，本发明的保护范围由所附的权利要求限定。依据37C. F. R. §1. 72 (b)提供摘要，以使读者能够迅速明确技术公开的性质和要点。应理解提交的摘要不能用于解释或限定权利要求的范围或含义。本发明意外地发现⑶36拮抗剂能够减轻体重和改善胰岛素敏感性。下述实施例中描述的结果表明，给予SAB和高脂饮食的ApoE KO小鼠的体重明显减轻。除了对体重的影响以外，还观察到连续8周SAB治疗改善高脂血症ApoE KO的胰岛素敏感性。这些发现与在所需对象中抑制CD36以减轻体重、抑制脂肪堆积、降低血液葡萄糖水平、改善胰岛素敏感性、治疗或预防糖尿病前期和糖尿病，特别是II型糖尿病、降低血浆胆固醇水平和减少肝脏中脂肪沉积的治疗用途一致。SAB或其代谢产物，包括RA和DSS，以及其他⑶36拮抗剂用于这些目的。⑶36拮抗剂。本申请中使用的“⑶36拮抗剂”指能够抑制⑶36活性或功能的分离的化合物。例如，能够作为CD36拮抗剂的化合物，其通过抑制、减少或消除CD36，或阻止CD36与其配体结合，或阻止CD36与其他蛋白发生相互作用而发挥作用，导致CD36介导的功能或信号抑制。已知⑶36识别并结合配体，包括氧化的或修饰的低密度脂蛋白(oxLDL，mLDL);长链脂肪酸(LCFA);细菌细胞壁的脂质和脂蛋白组分；血栓反应素(TSP) -1和-2以及带有含I型血栓反应素重复序列(TSR)肽结构域的分子；纤维状的β -淀粉样蛋白( ·Αβ );濒死/凋亡细胞；糖化蛋白；以及磷脂。还已知CD36与其他细胞蛋白发生相互作用，如其他膜蛋白和信号蛋白，例如调控下游信号事件的Src家族激酶和MAPK激酶；以及诱导细胞应答如细胞信号、配体和配体结合物质的内化或吞噬作用，如内源性底物(例如，oxLDL或感染/凋亡细胞)和外源性底物(例如，细菌或其他寄生虫)。⑶36通过配体结合和细胞相互作用介导一系列细胞和生理事件，包括炎症应答(例如，诱导细胞因子释放、抑制巨噬细胞迁移、活化NF-K B)、血管生成(例如，抑制促血管生成信号)、组织梗死、泡沫细胞形成(例如，促进泡沫细胞形成)、动脉粥样硬化(例如，促进动脉粥样硬化斑块形成)、肠脂肪酸吸收(例如，使表达CD36的肠细胞与脂肪酸结合并启动脂肪酸内化)、以及味觉偏好(例如，使味蕾细胞的CD36与脂质/脂肪酸结合并启动导致偏好高脂饮食的信号级联)。还认为CD36活化促进了葡萄糖耐受不良；胰岛素抵抗；脂肪沉积形成，特别是内脏/腹部脂肪沉积；体重超重和体重增加；血浆胆固醇升高；以及巨噬细胞、主动脉和扩展血管的脂质含量增加。如本申请所公开的，⑶36拮抗剂包括，但不限于，小分子、适体、小干扰RNA分子、反义分子、或抗体。在本发明的一个方面，CD36活性的拮抗剂是适体，其是与特定靶分子结合的寡聚核酸或肽(或多肽)分子。适体能够特别地合成，或使用本领域公知的多种筛选方法从库中选择，例如酵母双杂交系统。在本发明的另一个方面，拮抗剂是抗体。例如，可以从Immunotech (BeckmanCoulter, Fullerton, CA)获得 ·CD36 拮抗剂抗体克隆 FA6 - 152。在本发明的又一个方面，⑶36拮抗剂是小干扰RNA (siRNA)分子。适宜的siRNA分子的例子包括在下述实施例中描述的那些。在一个方面，CD36活性的拮抗剂是小分子。在本申请中，术语“小分子”指小有机化合物，如杂环、肽、糖类、类固醇等。小分子调节剂的分子量优选地低于约1500道尔顿、1000道尔顿、800道尔顿、或甚至低于约500道尔顿。可以对化合物进行修饰以增强其效能、稳定性、药物相容性等。可以采用本领域公知的方法对来自合成或天然化合物文库的候选调节剂化合物进行筛选(参见中国专利号ZL200510072269. 1，公开号CN1868546，和中国专利申请号200910147634. 9，其全部内容通过引用并入本文)。合成化合物文库能够从很多公司购买得至丨J，包括 Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)> Comgenex (Princeton, N.J. )>Brandon Associates (Merrimack, N. H.)、和 Microsource (New Milford, Conn. X 组合文库可以获得或能够利用公知的合成技术制备。或者，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库来自例如 Pan Laboratories (Bothell, Wash.)或 MycoSearch (NC),或能够容易地通过本领域公知的方法生产。此外，可以通过常规的化学和生物化学技术对天然和合成的文库和化合物进行进一步修饰。可以使用高通量筛选在体外鉴定能够高效拮抗⑶36的化合物。通过体外检测分离CD36拮抗剂之后，可以进行实验以检测其在体内的效能。例如，已在高通量筛选中鉴定了先导化合物丹酚酸B (SAB ；CAS登记号115939-25-8)是一种⑶36拮抗剂。SAB的结构为
SAB能够代谢为迷迭香酸(RA ；CAS登记号20283_92_5)和丹参素钠(DSS ；CAS登记号 67920-52-9)。RA的结构为
权利要求
1.一种降低所需对象体重的方法，包括给予所述对象有效量的CD36拮抗剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是选自下组的分离的化合物小分子、适体、小干扰RNA、反义分子和抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是小分子拮抗剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、DSS、3-肉桂酰吲哚、13-戊基小檗碱、或海沙瑞林。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、或DSS。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象是肥胖的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述对象是超重的。
8.一种在所需对象中抑制脂肪堆积的方法，包括给予所述对象有效量的CD36拮抗剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述脂肪是内脏脂肪。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是选自下组的分离的化合物小分子、适体、小干扰RNA、反义分子和抗体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是小分子拮抗剂。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、DSS、3-肉桂酰吲哚、13-戊基小檗碱、或海沙瑞林。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、或DSS。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述脂肪是内脏脂肪。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述对象是肥胖的。
16.根据权利要求8所述的方法，其中所述对象是超重的。
17.一种在所需对象中增强胰岛素敏感性或葡萄糖耐量的方法，包括给予所述对象有效量的⑶36拮抗剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是选自下组的分离的化合物小分子、适体、小干扰RNA、反义分子和抗体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是小分子拮抗剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、DSS、3-肉桂酰吲哚、13-戊基小檗碱、或海沙瑞林。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、或DSS。
22.根据权利要求17所述的方法，其中所述对象患有糖尿病。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述对象患有II型糖尿病。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述对象患有妊娠糖尿病。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述对象患有糖尿病前期。
26.一种在所需对象中治疗或预防糖尿病或糖尿病前期的方法，包括给予所需对象有效量的⑶36拮抗剂。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是选自下组的分离的化合物小分子、适体、小干扰RNA、反义分子和抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述CD36拮抗剂是小分子拮抗剂。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、DSS、3-肉桂酰吲哚、13-戊基小檗碱、或海沙瑞林。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述小分子拮抗剂是SAB、RA、或DSS。
31.根据权利要求26或28所述的方法，其中所述糖尿病是II型糖尿病。
32.根据权利要求26或28所述的方法，其中所述糖尿病是妊娠糖尿病。
全文摘要
本申请涉及CD36拮抗剂的治疗用途，以减轻体重，抑制脂肪堆积和特别地抑制内脏脂肪堆积，改善胰岛素敏感性，降低血糖水平，治疗和预防代谢综合征、糖尿病前期和糖尿病，以及降低血浆胆固醇水平和减少肝脏脂肪沉积。CD36拮抗剂，包括SAB或其代谢产物，如RA和DSS，可用于这些目的。
文档编号A61K39/395GK103037901SQ201180037754
公开日2013年4月10日 申请日期2011年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者S·赵, 鲍羿, E·金 申请人:康奈尔大学