miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途的制作方法

专利名称：miRNAs作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和药学领域；更具体地，本发明涉及若干个microRNAs,特别是miR-181a作为 调节胰岛素敏感性的靶标的新用途。
背景技术：
糖尿病是一种常见的危害人类健康的慢性代谢疾病。根据糖尿病的发病机制，可将糖尿病分为I型糖尿病和2型糖尿病。I型糖尿病主要由于自身免疫性失常而导致胰腺中胰岛β细胞受损,进而引起胰岛分泌不足。2型糖尿病是糖尿病的主要形式，发病率占糖尿病的90%以上，其特点是胰岛素刺激的靶组织出现胰岛素抵抗症状。胰岛素的主要功能为降低血糖水平，促进骨骼肌和脂肪对葡萄糖的吸收，同时抑制肝脏中的糖异生。当机体不能够对正常浓度的胰岛素产生适当的响应时即产生所谓的胰岛素抵抗。胰岛素抵抗会导致胰岛素分泌代偿性增加，长此以往会逐渐导致胰岛β细胞功能的衰竭。肝脏作为胰岛素作用的主要靶器官，在维持空腹状态下内源性葡萄糖的生成、输出以及进食后葡萄糖的吸收、利用和储存等方面发挥着重要作用。肝脏胰岛素抵抗主要指胰岛素抑制肝细胞葡萄糖生成、肝糖异生和糖原降解的能力下降，这在很大程度上可导致空腹血糖的升高并持续刺激胰岛细胞分泌胰岛素。肝脏特异性敲除胰岛素受体底物Irsl或lrs2的小鼠分别在进食后或在禁食阶段表现出显著的胰岛素抵抗，证明肝脏胰岛素抵抗在高血糖、糖耐量异常和糖尿病中发挥着重要作用。胰岛素抵抗的发生成因复杂，受环境、遗传等多种因素影响，目前改善胰岛素抵抗依然是当前治疗2型糖尿病的主要方法之
OSIRTl是一种保守的NAD+依赖性去乙酰化酶，属于哺乳动物Sirtuin家族成员之一，可使多种底物去乙酰化，行使广泛的生物学作用。目前对SIRTl的功能研究发现，它具有延长酵母、线虫和果蝇等多种生物寿命的功能。SIRTl在哺乳动物的肝脏、脂肪、肌肉、肾脏等多种器官和组织中广泛表达，并参与调节血糖平衡和胰岛素分泌等重要的生理过程。目前越来越多研究表明SIRTl对胰岛素敏感性和2型糖尿病的具有改善作用，很可能成为治疗2型糖尿病的潜在分子靶标。在骨骼肌细胞、脂肪细胞和肝脏细胞中，SIRTl均显示出对胰岛素信号通路的正向调节作用。转基因过表达SIRTl的2型糖尿病模型db/db小鼠和高脂诱导的肥胖小鼠均表现出糖耐量和胰岛素敏感性的改善。口服给予高脂饮食诱导的老年小鼠，剂量为22. 4mg/kg/天的SIRTl激动剂白藜芦醇，能够改善其胰岛素敏感性，并使其体重发生略微的下降。白藜芦醇和其他的一些SIRTl的小分子激动剂，例如SRT1720等，同样显示出可预防饮食诱导的肥胖和减轻胰岛素抵抗的特性。因此，SIRTI在胰岛素抵抗相关疾病如2型糖尿病、肥胖症等代谢疾病的发生、发展过程中有重要的作用，日后对于SIRTl调控因子的研究将为改善胰岛素抵抗和治疗2型糖尿病提供新的思路。在肝脏中，SIRTl被认为参与调控葡萄糖体内平衡。SIRTl可以去乙酰化过氧化物酶增殖体受体Y辅活化因子I α (peroxisome proliferator-activatedreceptor y coactivator-lalpha, PGC-1 a )。PGC-1 a是核受体过氧化物酶增殖体受体Y (peroxisome proliferator-activated receptor y , PPAR γ )的一种转录辅活化因子，可在基因转录水平上调控肝脏中葡萄糖代谢。SIRTl通过去乙酰化PGC-Ia使糖异生基因表达增加，同时抑制糖酵解基因的表达，从而诱导肝糖输出，调控肝脏的葡萄糖代谢。在胰岛素抵抗的肝细胞H 印G2中，SIRTl蛋白水平降低，并且下调或抑制SIRTl可降低HepG2细胞中胰岛素受体磷酸化水平及糖原合成能力对胰岛素的响应，诱导产生胰岛素抵抗。在发生胰岛素抵抗的小鼠肝脏中用腺病毒过表达SIRTl可以缓解脂肪肝和胰岛素抵抗(Li，Y.，et al. ,Hepatic overexpression of SIRT Iin mice attenuates endoplasmic reticulumstress and insulin resistance in the liver. FASEB J,2011)o目前，一类参与基因转录后调控的非编码小RNA-microRNAs引起了越来越多生物学家的兴趣，成为现今生命科学领域的研究热点。从microRNAs的表达和生物学产生两个方面可以从如下几个标准对其进行定义①成熟的miRNA是约有22个核苷酸长度，通过RNA印迹(Northern blot)可检测到的内源非编码RNA 成熟的microRNAs来源于具有特定二级莖环结构的前体(pre-miRNA) 成熟的microRNAs由Dicer酶不对称加工形成,在Dicer酶缺陷型个体中，会检测到pre-miRNA的累积；④成熟microRNAs的序列和pre-miRNA的莖环结构在不同物种间存在保守性。已经被鉴定的microRNAs可以通过一些网站进行检索，例如 Sanger 研究所的 microRNA 网站http://microrna. sanger. ac.uk/。MicroRNAs广泛存在于真核生物中，在转录后水平调控基因的表达，参与细胞增殖、分化、代谢和凋亡等一系列生理进程，调节生物体的生长、发育和代谢，并与多种疾病相关。MicroRNAs进入RISC形成miRNP，在动物细胞中microRNAs通常与靶基因3’ UTR以完全或不完全配对的形式相结合，从而引导miRNP到达目标mRNA。MiRNP与目标mRNA的相互作用可以直接抑制靶基因翻译的起始，也可以加速目标mRNA的去腺苷化，从而抑制翻译的起始或导致目标mRNA稳定性降低发生降解，从而调节基因表达。目前的研究表明microRNAs在代谢相关组织，如脑，肝脏，肌肉，脂肪和胰岛等组织中具有重要的生物学功能。但是，现有已经发现的microRNAs种类繁多，可能发挥着各种各样不同的功能，正面的或者负面的功能都有。因此，很有必要深入研究这些microRNAs，对其功能进行深入了解，以期找到新的、有用的药物靶点，为疾病的临床治疗寻找新的突破□。

发明内容
本发明的目的在于提供若干个microRNAs，特别是miR_181a作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途。在本发明的第一方面，提供一种miR-181a抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。在一个优选例中，所述的组合物还用于抑制胰岛素抵抗，改善糖代谢，预防或治疗糖代谢失调相关疾病(如2型糖尿病)。在另一优选例中，所述的组合物还用于上调SIRTl蛋白的表达；上调胰岛素刺激的InsR，Akt或Gsk3 β磷酸化水平；和/或
上调胰岛素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。在另一优选例中，所述的mi R-181 a抑制剂是抑制或阻止mi R-181 a (更特别地，为miR-181a的序列(SEQ ID NO 1)中第1-8位)与其靶向基因位点(较佳地，为SIRTl的3’ UTR的UGAAUGUU序列位点)结合的物质。在另一优选例中，所述的miR_181a抑制剂包括(但不限于)miR_181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA (沉默miR_181a前体)；或携带或表达miR-181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸，肽核酸；siRNA的构建物。在另一优选例中，所述的miR_181a抑制剂是SEQ ID NO :5所示的反义核苷酸，或2' -O-甲基化修饰的SEQ ID NO :5所示的反义核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种miR_181a抑制剂，其是SEQ ID NO :5所示的反义 核苷酸，或2' -O-甲基化修饰的SEQ ID NO :5所示的反义核苷酸。在本发明的另一方面，提供miR-181a的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标。在一个优选例中，所述的miR_181a用于筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质。在本发明的另一方面，提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括(I)用候选物质处理表达miR_181a的体系；和(2)检测所述体系中miR_181a的表达情况；其中，若所述候选物质可降低miR-181a的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。在一个优选例中，步骤(I)包括在测试组中，将候选物质加入到表达miR_181a的体系中；和/或步骤⑵包括检测测试组的体系中miR-181a的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-181a的体系；如果测试组中miR-181a的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)针对miR-181a设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。在另一优选例中，步骤(I)中，所述的体系还表达SIRTl蛋白；步骤(2)中，还包括检测所述体系中SIRTl基因的转录或蛋白的表达(优选蛋白表达)情况，若转录或表达发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；或者，检测所述体系中miR-181a与SIRTl基因的相互作用(结合或互补)，若相互作用减弱(优选显著减弱，如弱20%以上，较佳的弱50%以上；更佳的弱80%以上)，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。在另一优选例中，步骤(I)中，所述的体系还表达胰岛素通路中的InsR，Akt或Gsk3 β ；步骤(2)中，还包括检测所述体系中InsR，Akt或Gsk3 β的磷酸化情况，若磷酸化发生上调(优选显著上调，如上调20%以上，较佳的上调50%以上；更佳的上调80%以上)，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。在另一优 选例中，步骤(I)中，所述的体系还表达糖原合成酶；步骤⑵中，还包括检测所述体系中糖原合成酶的表达或活性，若表达或活性发生上调(优选显著上调，如上调20%以上，较佳的上调50%以上；更佳的上调80%以上)，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系(如表达miR_181a的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如线虫)。在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于提闻膜岛素敏感性有用的物质。在本发明的另一方面，提供一种测定miR-181a表达量的试剂的用途，用于制备诊断或检测动物胰岛素敏感性情况或胰岛素抵抗的试剂或试剂盒。在本发明的另一方面，提供一种提高胰岛素敏感性的方法，包括下调动物中miR-181a的表达。在另一优选例中，所述的方法包括给予动物有效量的miR_181a抑制剂。由于MicroRNA的一个家族(如miR-181家族)中各个成员间序列相似，因此具有相似的靶基因，可能发挥相似的生物功能，比如miR-181a，miR-181b都具有调节肌肉细胞分化的功能(Naguibneva,I. et al.,The microRNA miR-181 targets the homeobox protein Hox-Allduring mammalian myoblast differentiation),而miR—181a,miR—181c 都能够下调 SIRTl的表达(Saunders et al. ,miRNAs regulate SIRTl expression during mouse embryonicstem cell differentiation and in adult mouse tissues),提不除了 miR-181a 夕卜，miR-181家族的其他成员miR-181b，c，d也可能与胰岛素敏感性有关，抑制miR-181家族的表达可能提高胰岛素敏感性。在本发明的另一方面，提供一种miR_27a和miR-146或其促进剂，以及miR_181b，miR-181c和miR-181d的抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。在本发明的另一方面，提供一种miRNA的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标(或用于筛选提高提高胰岛素敏感性的物质)，所述的miRNA选自miR-27a、miR_146b、miR_181b，miR_181c 或 miR_181d。在本发明的另一方面，一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括(al)用候选物质处理表达miRNA的体系；和(a2)检测所述体系中miRNA的表达情况；其中，若所述候选物质可提高miRNA的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；其中，所述的miRNA 选自miR_27a 或 miR_146b。在一个优选例中，上述步骤(al)包括在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或步骤(a2)包括检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系；如果测试组中miRNA的表达在统计学上高于(优选显著高于，如低20%以上，较佳的高50%以上；更佳的高80%以上)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
在本发明的另一方面，一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括(bl)用候选物质处理表达miRNA的体系；和(b2)检测所述体系中miRNA的表达情况；其中，若所述候选物质可抑制miRNA的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；其中，所述的miRNA 选自miR_181b、miR_181c, miR_181d。在一个优选例中，上述步骤(bl)包括在测 试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或步骤(b2)包括检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系；如果测试组中miRNA的表达在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上,较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系(如表达所述miRNA(选自miR-27a、miR_146b、miR_181b、miR_181c，或 miR_181d)的细胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如线虫)。在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于提闻膜岛素敏感性有用的物质。在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)针对所述miRNA(选自miR-27a、miR-146b、miR-181b、miR-181c，或 miR-181d)设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图l、MiR_181a 作用于 SIRTl 3，UTR。A :在18个潜在的microRNAs中，miR_181a可显著抑制SIRTl 3’UTR的转录活性。在转染pRL-SIRTl-3’ UTR及含相应microRNA前体的质粒72小时后，收集HEK293T细胞做荧光素酶基因检测。与pSIF-GFP(pSIF)相比*p < O. 05，**p < O. 01。除非另行说明，本图及其它图中误差值的坐标采用标准差。B :人miR_181a序列与人、大鼠及小鼠中SIRTl 3’UTRs的序列比对。miR_181a的核心区域为加黑体5’ ACAUUCA 3’。C =SIRTl 3’ UTR突变体不具有抑制SIRTl 3’ UTR的转录活性的作用。与其它各组相比广P <0.01。D:miR-181a核心区域突变体不具有抑制SIRTl 3’ UTR的转录活性的作用。与其它各组相比**p < O. 01。图2、MiR_181a在转录水平抑制SIRTl蛋白表达。A :miR_181a可显著抑制SIRTl蛋白表达，而miR_181a突变体对SIRTl蛋白表达没有影响。与 pSIF-GFP (pSIF)或 pSIF-181a_m 相比，**p < O. 01。B :过表达miR_181a剂量依赖性抑制SIRTl蛋白表达。转染不同剂量的miR_181a类似物(图中简写为“miR-181a类”)72小时后，收集HEK293T细胞做免疫印迹试验检测。与未转染miR-181a类似物的细胞相比、< O. 01。C :用反义核酸(anti_181a)抑制miR_181a可剂量依赖性上调SIRTl蛋白水平。转染不同剂量 的anti-181a 72小时后，收集HEK293T细胞做免疫印迹试验检测。与未转染反义核酸的细胞相比、< O. 01。D :过表达miR-181a不影响SIRTl mRNA水平。在转染相应质粒(表达miR_181a质粒)72小时后，收集HEK293T细胞做实时定量PCR检测。E :上调或下调miR-181a不影响SIRTl mRNA水平。在转染相应核苷酸(miR_181a类似物)72小时后，收集HEK293T细胞做实时定量PCR检测。图3、MiR_181a在产生胰岛素抵抗的!fepG2细胞和db/db小鼠肝脏中上调。A :葡萄糖胺成功诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗。用葡萄糖胺处理HepG2细胞18小时，IOOnM胰岛素刺激细胞15分钟后收集细胞做免疫印迹试验检测，未用胰岛素刺激细胞作为对照。磷酸化InsR(p-InsR)与不用葡萄糖胺但仅用胰岛素处理的相比减少，表示胰岛素抵抗发生。B MiR-181a在产生胰岛素抵抗的IfepG2细胞中上调。葡萄糖胺处理IfepG2细胞18小时后收集细胞做实时定量PCR检测。、< O. 01。C =SIRTl蛋白水平在db/db小鼠肝脏中下调。蛋白水平通过免疫印迹试验检测。D MiR-181a在db/db小鼠肝脏中上调。肝脏样品取自经基因型检测的10周龄小鼠，MiR-181a表达水平用实时定量PCR检测。不同基因型小鼠各14只。图4、过表达miR_181a抑制SIRTl表达并诱导肝脏胰岛素抵抗。A :在H印G2细胞中miR_181a下调SIRTl蛋白水平及胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk30的磷酸化。转染不同剂量的miR-181a类似物72小时后，用IOOnM胰岛素刺激细胞15分钟收集细胞做免疫印迹试验检测。B :对(A)图中SIRTl蛋白水平及胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化水平的量化统计。与同组中未转染miR-181a类似物的细胞相比，*p < O. 05，**p < O. 01。C和D :在!fepG2细胞中miR_181a抑制胰岛素诱导的糖原合成酶活性(C)及糖原合成(D)的上调。与未转染miR-181a类似物胰岛素刺激的细胞相比，#P < 0.01。E和F :在原代培养的肝脏(E)和C2C12肌肉细胞(F)中miR_181a类似物抑制SIRTl蛋白水平及胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。蛋白水平通过免疫印迹试验检测。图5、抑制miR_181a能够增加SIRTl的蛋白表达并提高胰岛素敏感性。(A，B)在正常(A)和诱导胰岛素抵抗⑶状态下，用反义核酸抑制IfepG2细胞中的miR-181a能够显著增加SIRTl的蛋白表达并提高胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。指定浓度的反义核酸转染HepG2细胞72小时后，用IOOnM的胰岛素刺激细胞15分钟，提蛋白进行免疫印迹检测。(C，D)对于(A和B)中正常(C)及诱导胰岛素抵抗状态⑶时SIRTl蛋白和InsR(IR)，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析定量。*ρ < O. 05，**ρ < O. 01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。(E，F)在正常(E)和诱导胰岛素抵抗(F)状态下，用反义核酸抑制小鼠肝脏原代细胞中的miR-181a能够显著增加SIRTl的蛋白表达并提高胰岛素诱导的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化。(G, H)抑制miR_181a能够增加胰岛素诱导的糖原合成酶活性(G)以及糖原合成(H)的上调。*p < O. 05，**p < O. 01，与每组中未转染anti-181a的作差异分析。图6、miR_181a对于胰岛素信号通路的调控依赖于SIRTl。(A)正常状态下，在H印G2细胞中用腺病毒过表达SIRTl (Ad-SIRTl)能够回复miR-181a对于胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的抑制作用，腺病毒过表达的GFP (Ad-GFP)作为负对照，免疫印迹法用来检测蛋白及其磷酸化水平。(B,C)对于(A)中感染了 Ad-GFP(B)和 Ad-SIRTl (C)的 H印G2 细胞中 SIRTl 蛋白和胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，**p < O. 01，与每组中未转染miR-181a类似物的作差异分析。(D)在HepG2细胞中，诱导胰岛素抵抗的情况下，利用尼克酰胺(NAM)来抑制SIRTl的活性后，反义核酸anti-181a对于胰岛素刺激的InsR和Akt的磷酸化的上调作用消失。免疫印迹法用来检测蛋白及其磷酸化水平。(E)对于(D)中尼克酰胺处理的HepG2细胞中SIRTl蛋白和胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，**p < O. 01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。(F)在SIRTl敲除小鼠(KO)的肝脏原代细胞中，反义核酸anti_181a对于胰岛素敏感性的改善作用消失。(G-H)对于(F)中野生型小鼠(WT) (G)以及SIRTl敲除小鼠⑶的肝脏原代细胞中SIRTl蛋白和胰岛素刺激的InsR，Akt的磷酸化的灰度分析定量。< O. 05，、< O. 01与每组中未转染anti-181a的作差异分析。*p < O. 05,**p < O. 01与每组中未转染anti_181a的作差异分析。图7、小鼠体内实验证明miR_181a能够调节SIRTl的蛋白水平以及肝脏胰岛素敏感性。(A和B)在小鼠肝脏中利用腺病毒载体过表达miR-181a(Ad-miR_181a)导致胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β的磷酸化的减弱。对八周龄的雄性C57BL/6小鼠尾静脉注射表达miR-181a和GFP (Ad-GFP)的腺病毒载体，注射12天后杀小鼠检测肝脏中miR_181a的表达(A)和胰岛素信号通路一些蛋白的磷酸化(B)。< O. 05，每组9只小鼠。 (C)对于⑶中SIRTl蛋白以及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析统计。与Ad-GFP组相比，*ρ < O. 05,**ρ < O. Ol0(D)高脂饮食诱导肥胖(DIO)的小鼠腹腔注射LNA-anti_181a增加了肝脏SIRTl蛋白的表达以及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平。(E)对于⑶中SIRTl蛋白以及胰岛素刺激的InsR，Akt和Gsk3 β磷酸化水平的灰度分析统计。与LNA-control组相比，*p < O. 05, **p < O. 01。(F)注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠肝脏中 miR_181a 以及 G6Pase，PEPCK 的 mRNA水平下降。与LNA-control组相比，*p < O. 05，**p < O. 01，每组11只小鼠。(G)注射LNA-anti_181a的DIO小鼠饥饿血糖低于注射LNA-control对照组。与LNA-control组相比，*p < 0. 05,每组11只小鼠。
(H) Pearson correlation coefficient test 显不注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠个体miR-181a的表达与饥饿血糖相关(η = 11)。(I)最后一次注射LNA9天后，葡萄糖耐受性实验显示LNA_anti_181a改善了 DIO小鼠的葡萄糖耐受性。与LNA-control组相比，*p < 0. 05，每组11只小鼠。(J)LNA-anti_181a减少了(I)图中葡萄糖耐受性实验所作图的曲线下面积。与LNA-control组相比，*p < 0. 05,每组11只小鼠。(K) Pearson correlation coefficient test 显不注射 LNA-anti_181a 的 DIO 小鼠个体miR-181a的表达与葡萄糖耐受性实验所作图的曲线下面积相关(η = 11)。图8、Western检测miR_27a和miR_146b对于细胞的胰岛素敏感性的影响情况。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究，意外地发现了一些microRNA (miRNA)在调节胰岛素敏感性中发挥作用，这些miRNA包括miR-181a、miR-27a、miR-146b。其中，miR_181a通过抑制SIRTl表达而影响胰岛素敏感性。基于本发明的揭示，所述的miR-181a的抑制剂以及所述的miR-27a、miR-146b本身可用于提高胰岛素敏感性，从而预防、缓解或治疗胰岛素敏感性下降、胰岛素抵抗、糖代谢失调相关的疾病，如2型糖尿病。miR_181a 及其用途本发明中，所述的miR_181a是具有SEQ ID NO 1所示核酸序列的小核糖核酸AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(SEQ ID NO 1)miR-181a是为一种本领域已知的microRNA (miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。其在哺乳动物中非常保守，在动物的眼睛，胸腺，免疫细胞表达量较高。然而，对于miR-181a结合的靶点和其与胰岛素敏感性或糖代谢之间的关系目前并不清楚。miR_181a可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了miR-181a或其前体的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-181a或其前体。本发明人发现，miR-181a是一个新的、与胰岛素敏感性密切相关的药物靶点，其藉由抑制SIRTl蛋白表达，抑制胰岛素信号通路，进一步下调胰岛素敏感性。针对miR-181a的各种治疗手段可以作为提高动物胰岛素敏感性的新颖和有效的手段。miR_181a为靶点的药物筛选在得知了 miR-lSla与胰岛素敏感性的密切相关性后，可以基于该特征来筛选抑制miR-181a的物质。之后，可从所述的物质中找到对于提高胰岛素敏感性真正有用的药物。因此，本发明提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括用候选物质处理表达miR-181a的体系；和检测所述体系中miR_181a的表达或活性；若所述候选物质可抑制miR-181a的表达或活性，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。所述的表达miR-181a的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-lSla的细胞；或可以是重组表达miR_181a的细胞。所述的表达miR-181a的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-181a的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-181a的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于提高胰岛素敏感性真正有用的物质。基于miR-lSla的作用机理为通过抑制SIRTl蛋白表达，进而发挥提高胰岛素敏感性的作用。因此还可以在筛选体系中表达SIRTl蛋白(较佳地包括其编码基因以及3’UTR区作为表达盒)。从而，可通过进一步观察所述体系中SIRTl蛋白·的表达情况来分析候选药物的有效性。若SIRTl蛋白表达发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；或者，检测所述体系中miR-181a与SIRTl基因的相互作用(结合或互补)，若相互作用减弱，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。此外，还可以在筛选体系中表达胰岛素通路中的关键因子，如InsR，Akt或Gsk3i3，从而通过观察所述体系中这些因子的磷酸化情况来分析候选物质的有效性。若磷酸化水平发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。此外，还可以在筛选体系中表达糖原合成酶，从而通过观察所述体系中糖原合成酶的表达或活性来分析候选物质的有效性。若磷酸化水平发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。本发明对于SIRT1、InsR, Akt, Gsk3 β或糖原合成酶的基因转录、蛋白表达、蛋白活性、蛋白存在量、分泌情况或磷酸化情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的PCR技术，或蛋白定量或半定量检测技术进行，例如(但不限于)=RT-PCR法，SDS-PAGE法，Western-Blot 法等。另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的提高胰岛素敏感性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制miR_181a的表达和活性，进而提闻膜岛素敏感性有用的物质。miR-27a、miR_146b 及其用途本发明人还找到了若干miRNA，它们对于提高胰岛素敏感性是有用的，所述的miRNA 选自 miR-27a 或 miR_146b。因此，所述的miR_27a或miR_146b或它们的促进剂可用于制备提高胰岛素敏感性的组合物，并且也可以用于作为药物筛选的靶点，筛选通过提高miR-27a或miR-146b的表达或活性而提高胰岛素敏感性的组合物。所述的miRNA (选自miR_27a或miR_146b)的促进剂是指任何可提高miRNA或其前体的活性、提高miRNA或其前体的稳定性、上调miRNA或其前体的表达、增加miRNA或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调miRNA有用的物质，从而可用于提高胰岛素的敏感性。此外，一些miRNA的模拟物(mimic)或其它修饰形式也可以作为miRNA的促进剂，只要它们具有与所述miRNA相同的效果，或者能够提高miRNA的表达或活性。因此，本发明提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括用候选物质处理表达miR-27a或miR-146b的体系；和检测所述体系中miR_27a或miR-146b的表达或活性；若所述候选物质可提闻(显者提闻，如提闻20% ;更佳地提闻40% ;更佳地提高60% )miR-27a或miR-146b的表达或活性，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。所述的表达miR-27a或miR-146b的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-27a或miR-146b的细胞；或可以是重组表达miR_27a或miR_146b的细胞。所述的表达miR_27a或miR_146b的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR_27a或miR_146b的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-27a 或 miR_146b 的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于提高胰岛素敏感性真正有用的物质。miR-181b，c，d 及其用途 本发明人还推测若干个miRNA，它们对于提高胰岛素敏感性是有用的，所述的miRNA 选自 miR_181b, c, d。因此，所述的miR-181b，c, d的抑制剂可用于制备提高胰岛素敏感性(通过下调这些miRNA的表达或活性)的组合物，并且也可以用于作为药物筛选的靶点，筛选通过提高miR-181b, c，d的表达或活性而提高胰岛素敏感性的组合物。因此，本发明提供一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括用候选物质处理表达miR-181b, c, d的体系；和检测所述体系中miR_181b, c, d的表达或活性；若所述候选物质可降低(显著降低，如降低20% ;更佳地降低40% ;更佳地降低60% )miR-181b, c, d的表达或活性，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。所述的表达miR-181b，c，d的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达miR-181b, c, d的细胞；或可以是重组表达miR_181b, c, d的细胞。所述的表达miR-181b，c，d的体系还可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-181b，c, d的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-181b, c, d 的体系。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于提高胰岛素敏感性真正有用的物质。miRNA调节剂及其用途基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miRNA抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物，所述的miRNA选自miR-181a, b, c, d。进一步地,所述的miR-181a抑制剂还可用于促进SIRTl基因的转录或蛋白的表达；抑制血管内皮生长因子的转录或表达；或抑制软骨细胞的凋亡。如本文所用，所述的“miRNA抑制剂”包括了核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调miRNA或其前体的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。所述的miRNA抑制剂是指任何可阻止miRNA (特别是其中的结合关键位点)或其前体与其靶向序列结合、降低miRNA或其前体的活性、降低miRNA或其前体的稳定性、下调miRNA或其前体的表达、减少miRNA或其前体有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调miRNA有用的物质，从而可用于提高胰岛素的敏感性。例如，所述的抑制剂是核酸抑制物，蛋白抑制剂，抗体，配体，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调miRNA的表达。作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是核酸抑制物。较佳地，所述的核酸抑制物通过阻止miRNA与其祀向序列结合,从而发挥作用。所述的核酸抑制物例如选自(但不限于)miRNA的反义核酸，miRNA的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA (沉默miRNA前体)。作为本发明的优选方式，所述的miRNA的抑制剂是miRNA的反义核酸。如本文所用，“反义核酸”又称为“反义核酸”或“反义寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides) ”或“反义药物”,是指长度约为15-30个碱基的DNA分子、RNA分子它们的经修饰的形式或它们的类似物，可与mRNA互补。本领域人员均了解，根据本发明提供的反义核酸，可以进行适当的变化并保留其活性，这些变化形式均可用于本发明。任何可起到抑制或沉默miRNA的作用的反义核酸都 是可用于本发明的，其类型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miRNA的反义核酸是与miRNA的序列基本上(较佳地为完全)互补的序列。例如，当所述的miRNA为miR-181a时，所述的miR-181a的反义核酸与SEQ ID NO :5所示的序列具有80%以上的相同性，较佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90%以上的相同性，最佳地具有95%以上的相同性，如具有96%、97%、98%或99%以上的相同性；或者所述的miR-181a的反义核酸是SEQ ID NO:5所示序列的片段；它们均具有SEQ ID NO :5所示序列的反义核酸相同的功能。现有技术中已经指出了一些反义核酸的变化形式是可取的，它们也可以针对相应的祀序列发挥抑制作用。如Improved targeting of miRNA with antisenseoligonucleotides (2294-2304 Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 8)文献中提至Li，在反义核酸的两个末端截短I个碱基是可以保留其活性的。又如Design and deliveryof antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophilaand human cells (NATURE PROTOCOLS ；V0L. 3N0. 10 ；2008 ； 1537-1549)文献综述了多个研究，认为一般而言，在反义核酸的两边延长一些碱基是可以的。而在反义核酸和miRNA间亲和性很高(如锁核酸修饰)时，反义核酸可以被截短到约2/3长度。如本文所用，所述的“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1% SDS,60°C ;或(2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。在本发明中，所述的“反义核酸”还包括经修饰的反义核酸，所述的修饰基本不改变反义核酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核酸的修饰包括但不限于锁核酸修饰、甲氧基化修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替，这些修饰均是本领域技术人员易于实现的。优选地，所述的修饰为锁核酸修饰。组合物本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ;较佳的
0.00001-2(^七％;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的 miRNA(选自 miR_27a 或 miR_146b)或其促进剂；或含有有效量的miRNA(选自miR-181a，b，c，d)抑制剂，以及药学上可接受的载体。所述的组合物可用于提高胰岛素敏感性。任何前述的miRNA或其促进剂或抑制剂均可用于组合物的制备。如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充齐U、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。在得知了所述miRNA或其促进剂或抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的miRNA或其促进剂或抑制剂或它们的药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等。 本发明所述的miRNA或其促进剂或抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的miRNA或其促进剂或抑制剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的miRNA或其促进剂或抑制剂每天以约O. 00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的O. 0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法哺乳动物细胞株及细菌株HEK293T :人胚胎肾细胞系，由HEK293细胞衍生而来，同时表达SV40病毒的大T抗原。HepG2 :人肝癌细胞系。C2C12 :小鼠骨骼肌成肌细胞系。以上细胞株均购自中科院上海生命科学院细胞库。DH5ci细菌用于质粒克隆的大肠杆菌。主要试剂及试剂盒miR_181a， miR-543， miR_30a， miR_199b， miR_200a， miR_7， miR_9， miR-22，miR_29a， miR_29b， miR_34a， miR-128， miR-132， miR-138， miR-154， miR-204， miR-212，miR-217 WmiRBase 数据库(http://microrna. sanger. ac. uk/sequences/)得到。它们相应的Pre-miRNA序列相应的DNA序列化学合成经配对后连入pSIF-GFP的BamH I/EcoR I位点，获得可表达microRNA的质粒。miR-181a AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU (SEQ ID NO 1)miR-181a 的前体(Pre-Hsa_miR-181a)TGAGTTTTGAGGTTGCTTCAGTGAACATTCAACGCTGTCGGTGAGTTTGGAATTAAAATCAAAACCATCGACCGTTGATTGTACCCTATGGCTAACCATCATCTACTCCA(SEQ ID NO 2)MiRNA_181a 核苷酸类似物(即 miR_181a mimics);反义核酸(anti_181a)及miR-181a锁核酸反义核酸(LNA-anti_181a)均合成于上海吉玛制药技术有限公司(GenePharma, Shanghai, China)。它们的序列或结构是MiRNA_181a核苷酸类似物序列或结构正义5’-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU TT-3’ (SEQ ID NO 3)；反义5’-ACUCACCGACAGCGUUGAAUGUU TT-3’ (SEQ ID NO :4)。反义核酸为2' -O-甲基化修饰的ACTCACCGACAGCGTTGAATGTT(SEQ ID NO: 5)，每个碱基均有2' -O-甲基化修饰。miR_181a 锁核酸反义核酸(LNA-anti_181a):购于 Exiqon 公司。Taq酶、限制性内切酶及T4DNA连接酶为TaKaRa公司产品；细菌培养用胰蛋白胨、酵母粉购自Oxoid公司；琼脂粉购自捷倍思公司；核酸分析电泳用琼脂糖购自Biowest公司；质粒大抽试剂盒购自Qiagen公司。细胞总RNA抽提试剂TRIzol购自Invitrogen公司；M-MLV反转录试剂盒购自Promega公司；miR_181a反转录试剂盒购自Applied Biosystems公司。烟酰胺(nicotinamide),棕榈酸(palmitate),葡萄糖胺(D- (+) -Glucosaminehydrochloride)均购自Sigma公司；注射用胰岛素购自Novo Nordisk公司；PVDF膜购自 Millipore 公司；蛋白印迹化学发光试剂SuperSignal West Pico ChemiluminescentSubstrate 购自 Thermo Scientific 公司，Tmmobi I on TM Western Chemi luminescent HRPSubstrate 购自 Millipore 公司；X-Omat 光片购自 Kodak 公司。·抗体
权利要求
1.一种HiiR-ISla抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于抑制胰岛素抵抗，改善糖代谢，预防或治疗糖代谢失调相关疾病。
3.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于 上调SIRTl蛋白的表达； 上调胰岛素刺激的InsR，Akt或Gsk3 β磷酸化水平；和/或 上调胰岛素刺激的糖原合成酶活性或糖原合成。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂是抑制或阻止miR-181a与其靶向基因位点结合的物质。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂是抑制或阻止miR-181a与SIRTl的3’ UTR的UGAAUGUU序列位点结合的物质。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂包括miR_181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA ;或携带或表达miR_181a的反义核酸，miR-181a的锁核酸反义核酸，肽核酸；siRNA的构建物。
7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-181a抑制剂是SEQID N0:5所示的反义核苷酸，或2' -O-甲基化修饰的SEQ ID NO 5所示的反义核苷酸。
8.—种miR-181a抑制剂，其特征在于，其是SEQ ID NO :5所示的反义核苷酸，或2' -O-甲基化修饰的SEQ ID NO :5所示的反义核苷酸。
9.一种miR-181a的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标。
10.一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括 (1)用候选物质处理表达miR-181a的体系；和 (2)检测所述体系中miR-181a的表达情况； 其中，若所述候选物质可降低miR-181a的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(I)包括在测试组中，将候选物质加入到表达miR-181a的体系中；和/或 步骤⑵包括检测测试组的体系中miR-181a的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-181a的体系； 如果测试组中miR-181a的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的体系还表达SIRTl蛋白； 步骤(2)中，还包括检测所述体系中SIRTl基因的转录或蛋白的表达情况，若转录或表达发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质；或者，检测所述体系中miR-181a与SIRTl基因的相互作用，若相互作用减弱，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的体系还表达胰岛素通路中的 InsR, Akt 或 Gsk3 β ； 步骤(2)中，还包括检测所述体系中InsR，Akt或Gsk3i3的磷酸化情况，若磷酸化发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，所述的体系还表达糖原合成酶； 步骤(2)中，还包括检测所述体系中糖原合成酶的表达或活性，若表达或活性发生上调，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
15.一种测定miR-181a表达量的试剂的用途，用于制备诊断或检测动物胰岛素敏感性情况或胰岛素抵抗的试剂或试剂盒。
16.一种miRNA或其促进剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物；所述的miRNA 选自miR-27a 或 miR-146b。
17.—种miRNA的抑制剂的用途，用于制备提高胰岛素敏感性的组合物；所述的miRNA选自miR-181b、miR-181c，miR-181d。
18.—种miRNA的用途，用于作为筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的靶标，所述的miRNA 选自miR-27a、miR_146b、181b、miR_181c 或 miR_181d。
19.一种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括 (al)用候选物质处理表达miRNA的体系；和 (a2)检测所述体系中miRNA的表达情况； 其中，若所述候选物质可提闻miRNA的表达，则表明该候选物质是提闻膜岛素敏感性的潜在物质； 其中，所述的miRNA选自miR-27a或miR_146b。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(al)包括在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或 步骤(a2)包括检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系； 如果测试组中miRNA的表达在统计学上高于对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
21.—种筛选提高胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述方法包括 (bl)用候选物质处理表达miRNA的体系；和 (b2)检测所述体系中miRNA的表达情况； 其中，若所述候选物质可抑制miRNA的表达，则表明该候选物质是提高胰岛素敏感性的潜在物质； 其中，所述的 miRNA 选自:miR-181b、miR-181c，miR_181d。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，步骤(bl)包括在测试组中，将候选物质加入到表达所述miRNA的体系中；和/或 步骤(b2)包括检测测试组的体系中miRNA的表达，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达miRNA的体系； 如果测试组中miRNA的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是提高胰岛素敏感性的潜在物质。
全文摘要
本发明涉及若干个microRNAs，特别是miR-181a作为调节胰岛素敏感性的靶标的新用途。本发明揭示了miR-181a在调节胰岛素敏感性中发挥作用，其通过抑制SIRT1表达而影响胰岛素敏感性。因此，miR-181a抑制剂可用于提高胰岛素敏感性，从而预防、缓解或治疗胰岛素敏感性下降、胰岛素抵抗、糖代谢失调相关的疾病。
文档编号A61P3/10GK102908621SQ20111022014
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月2日 优先权日2011年8月2日
发明者翟琦巍, 周犇, 李程 申请人:中国科学院上海生命科学研究院