一种防治胰岛素抵抗及其相关疾病的新靶标的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种防治胰岛素抵抗及其相关疾病的新靶标。首次论证了催乳素受体对机体胰岛素敏感性具有提高作用，下调PRLR会明显降低胰岛素敏感性。因此，PRLR其本身或其上调剂能够用于增加胰岛素敏感性；并且可基于PRLR的上述功能，筛选增加胰岛素敏感性的物质。
【专利说明】一种防治胰岛素抵抗及其相关疾病的新靶标
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和制药学领域；更具体地，本发明涉及一种防治胰岛素抵抗及其相关疾病的新靶标。
【背景技术】
[0002]胰岛素抵抗是指血液循环中的胰岛素对于脂肪，肝脏，肌肉中糖脂代谢调控能力的下降。胰岛素抵抗(胰岛素不敏感)已成为对公众健康最严重的威胁之一。它导致机体葡萄糖动态平衡的失调并与葡萄糖不耐性、肥胖、脂代谢紊乱、高血压以及心血管疾病有着密切的联系。胰岛素抵抗发生后，机体为补偿胰岛素敏感性的下降而非正常的产生大量的胰岛素，直接导致血液循环中高胰岛素症状。胰岛素抵抗发展的最终结果是糖尿病的发生。
[0003]目前，全球糖尿病患者呈现越来越多的趋势，其中90%患者为2型糖尿病。2型糖尿病的主要特征是发生胰岛素抵抗，具体表现为肌肉和脂肪组织的葡萄糖吸收减少，肝脏中糖原分解增加。胰岛素抵抗是非酒精性脂肪肝发生的主要原因之一，并且可能进一步导致更严重的肝脏疾病发生，甚至肝癌。
[0004]胰岛素抵抗产生的原因是胰岛素受体对胰岛素刺激响应的下降。通常状态下，血液循环中的胰岛素被脂肪，肝脏，肌肉细胞表面的胰岛素受体识别，胰岛素受体被激活后磷酸化胰岛素受体底物蛋白(IRS proteins)，胰岛素受体底物蛋白的磷酸化进一步介导下游PI3K信号通路的激活。PI3K信号通路介导了胰岛素主要的代谢功能。
[0005]胰岛素信号通路是一个复杂并受高度精确调控的信号网络。在此通路中，PI3K能磷酸化PI4，5-P2产生Akt和TOKs的膜锚定分子PI3，4，5_P3。Akt 一旦迁移到膜上，就会被TOKs磷酸化并激活。活化的Akt依次磷酸化下游的激酶和转录因子，从而介导大多数的胰岛素代谢活动。胰岛素信号通路中诸如Akt等关键蛋白的缺陷都将导致严重的胰岛素抵抗。Akt基因敲除或激酶活性的丧失都直接`导致胰岛素抵抗。
[0006]机体不同组织分泌的激素，例如瘦素，脂联素，在调节胰岛素敏感性过程中起着非常重要的作用。因为激素主要是通过结合其在细胞表面的受体来发挥作用，所以激素受体是决定最终特异生理反应的关键因子。
[0007]催乳素是主要由垂体前叶分泌的激素，但是，其受体催乳素受体对胰岛素敏感性的调节作用并不清楚。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种防治胰岛素抵抗及其相关疾病的新靶标。
[0009]在本发明的第一方面，提供一种催乳素受体或其上调剂的用途，用于制备增加胰岛素敏感性的组合物。
[0010]在一个优选例中，所述的催乳素受体是:(a) GenBank登录号:NP 000940.1所示氨基酸序列的多肽；或(b)由(a)多肽的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或(C)与(a)多肽的氨基酸序列同源性高于80% (较佳地高于90%，更佳地高于95%，更佳地高于98%)且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。
[0011]在另一优选例中，所述的组合物用于预防、缓解或治疗胰岛素抵抗或胰岛素抵抗相关疾病。
[0012]在另一优选例中，所述的胰岛素抵抗或胰岛素抵抗相关疾病包括(但不限于):糖尿病(较佳地为2型糖尿病)，高血压,脂代谢紊乱,心血管疾病,肥胖,高胰岛素症,高尿酸症，或葡萄糖不耐性。
[0013]在另一优选例中，所述的组合物还用于:
[0014]增加胰岛素受体(IR)或AKT磷酸化水平；或
[0015]增加葡萄糖耐受和清除能力。
[0016]在另一优选例中，所述的催乳素受体的上调剂选自(但不限于):包含编码催乳素受体的多聚核苷酸及与之操作性相连的表达调控序列的表达载体(较佳地，为pCMV-HA，该表达载体能用于转化细胞并表达催乳素受体)；或亮氨酸缺乏的组合物(如食品、饮料、保健品、药品)。
[0017]在另一优选例中，所述的表达载体为质粒载体。
[0018]在另一优选例中，所述的表达载体为病毒载体。
[0019]在另一优选例中，所述的病毒载体选自下组:逆转录酶病毒，腺病毒，疱疹病毒或
牛痘病毒。
[0020]在本发明的另一方面，提供催乳素受体的用途，用于作为筛选增加胰岛素敏感性的药物的靶标。
[0021]在本发明的另一方面，提供一种筛选用于增加胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括:
[0022](I)将候选物质与包含(如表达)催乳素受体的体系接触；
[0023](2)检测候选物质对催乳素受体的影响；
[0024]若所述候选物质可提高催乳素受体的表达或活性，则表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
[0025]在一个优选例中，步骤(1)包括:在测试组中，将候选物质加入到包含(如表达)催乳素受体的体系中；和/或
[0026]步骤(2)包括:检测测试组的体系中催乳素受体的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的包含(如表达)催乳素受体的体系；
[0027]如果测试组中催乳素受体的表达、活性在统计学上高于(优选显著高于，如高20%以上，较佳的高50%以上；更佳的高80%以上)对照组，就表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
[0028]在另一优选例中，步骤(1)中，所述的体系中还包含(如表达)胰岛素受体(IR)或AKT ;且，
[0029]步骤(2)中，还包括:检测胰岛素受体(IR)或AKT磷酸化水平，若胰岛素受体或AKT磷酸化水平增加(优选显著增加，如增加20%以上，较佳的增加50%以上；更佳的增加80%以上)，则表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
[0030]在另一优 选例中，所述的体系选自:细胞体系(或细胞培养物体系)(如重组表达胰岛素受体的细胞、HepG2细胞或原代肝细胞)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
[0031]在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于):针对催乳素受体设计的过表达载体(质粒)、受体激动剂、小分子化合物。
[0032]在另一优选例中，所述方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于增加胰岛素敏感性有用的组合物。
[0033]在本发明的另一方面，提供一种增加哺乳动物胰岛素敏感性的方法，所述方法包括:上调哺乳动物体内催乳素受体的表达或活性。
[0034]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1、催乳素在体外调节胰岛素敏感性。
[0036]细胞感染腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR) 48h (A)，HepG2细胞用催乳素受体干扰片段(+PRLR RNAi)或者对照片段(-PRLR RNAi)处理48h，原代肝细胞感染腺病毒表达针对催乳素受体的小发夹(sh)结构RNA (+Ad-shPRLR)或者对照病毒(-Ad-shPRLR) 72h (B)，然后加(+ins)或者不加(-1ns) IOOnM胰岛素(Ins)刺激20min。数据至少经过三次独立实验，平均值土标准误。数据显著性通过t-test计算(p〈0.05)。(A和B)p-1R，p-AKT，PRLR蛋白。其中，上图为免疫印迹，下图为上图各条带相对于actin定量图。
[0037]图2、在体内利用腺病毒Ad-PRLR过表达催乳素受体提高胰岛素敏感性。
[0038]C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR)，12天时检测肝脏中催乳素受体表达(A，上图为免疫印迹，下图为催乳素受体相对于actin定量图)，14天时检测血糖和血清中胰岛素水平(B和C，B为血糖水平，C为胰岛素水平)，计算HOMA指数(D)，第8天或者第10天时做葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验(E)，12天时检测肝脏中胰岛素信号通路(F，左图为免疫印迹，右图为左图各条带相对于actin定量图)。动物实验数据至少经过2次独立实验,每组n=5-6,平均值土标准误。数据显著性通过t-test计算(p〈0.05)。
[0039]图3、在体内利用腺病毒Ad-shPRLR降低催乳素受体降低胰岛素敏感性。
[0040]C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射腺病毒过表达针对催乳素受体的小发夹(sh)结构RNA (+Ad-shPRLR)或者对照病毒(-Ad-shPRLR)，7天时检测肝脏中催乳素受体表达(A，上图为免疫印迹，下图为催乳素受体相对于actin定量图)，14天时检测血糖和血清中胰岛素水平(B和C，B为血糖水平，C为胰岛素水平)，计算HOMA指数(D)，第3天或者第4天时做葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验(E)，12天时检测肝脏中胰岛素信号通路(F，左图为免疫印迹，右图为左图各条带相对于actin定量图)。动物实验数据至少经过2次独立实验，每组n=5-6,平均值土标准误。数据显著性通过t-test计算(p〈0.05)。
[0041]图4、催乳素受体通过激活ERK增加胰岛素敏感性。
[0042]HepG2细胞感染腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR) 48h，C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR) 12天(A，催乳素受体和p-erk表达，上图为免疫印迹，下图为上图条带相对于actin定量图)，C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR)，然后第七天做ITT(B)之前5h注射PD98059(+PD)或者对照(-PD)，第九天打胰岛素检测肝脏胰岛素信号通路变化(C，左图为免疫印迹，右图为左图各条带相对于actin定量图)，A图数据至少经过三次独立实验，平均值土标准误，A-C动物实验数据至少经过2次独立实验，每组n=5-6，平均值土标准误，数据显著性通过t-test或者one-way ANOVA计算(ρ〈0.05)。
[0043]图5、催乳素受体过表达可以提高体内体外胰岛素抵抗状态下的敏感性。
[0044]HepG2细胞感染腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR)，30h后葡萄糖胺(+GlcN)或者不加(-GlcN)刺激18h后，IOOnM胰岛素刺激20min(A和B，左图为免疫印迹，右图为左图各条带相对于actin定量图)，催乳素受体在野生型(wt)和db/db(db)中蛋白表达分析(C，上图，免疫印迹，下图为上图各条带相对于actin定量图)，C57BL/6J db/db雄性小鼠尾静脉注射腺病毒过表达催乳素受体(+Ad-PRLR)或者绿色荧光蛋白(-Ad-PRLR)，11天和7天时检测血糖和血清中胰岛素水平(D和E，D为血糖水平，E为胰岛素水平)，第7天或者第9天时做葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验(F)，A和B图数据至少经过三次独立实验，平均值土标准误，C-F动物实验数据至少经过2次独立实验，每组n=5-6，平均值土标准误，数据显著性通过t-test或者one-wayANOVA 计算(ρ〈0.05)。
[0045]图6、降低催乳素受体表达可以在体内体外降低亮氨酸缺乏引起的胰岛素敏感性增加。
[0046]C57BL/6J雄性小鼠给予正常(+Leu)或者亮氨酸缺乏粮食(_Leu)喂养七天，HepG2细胞给予正常培基(+Leu)，或者亮氨酸缺乏培基(-Leu)处理12h(A和B，A，催乳素受体mRNA，B,催乳素受体蛋白)，HepG2细胞在给予正常培基(+Leu)，或者亮氨酸缺乏培基(-Leu)处理12h之前转染催乳素受体干扰片段(+PRLRRNAi)或者(-PRLR RNAi) 36h,然后IOOnM胰岛素刺激20min(C)，C57BL/6J雄性小鼠给予正常(+Leu)或者亮氨酸缺乏粮食(-Leu)喂养，然后尾静脉注射腺病毒过表达针对催乳素受体的小发夹(sh)结构RNA (+Ad-shPRLR)或者对照病毒(-Ad-shPRLR)，第三天做做葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验(D和E，D，GTT, E，ITT)第五天打胰岛素检测肝脏胰岛素信号通路变化(F)，A-C图细胞实验数据至少经过三次独立实验，平均值土标准误，A、B、D、F图动物实验数据至少经过2次独立实验,每组n=5-6,平均值土标准误,数据显著性通过t-test或者one-way ANOVA计算(p<0.05) ο
[0047]图7、亮氨酸缺乏时引起的催乳素受体增加是通过GCN2/S6K途径。[0048]GCN2+/+或者GCN2+雄性小鼠给予正常(+Leu)或者亮氨酸缺乏粮食(_Leu)喂养七天(A和B，A，催乳素受体mRNA，B，催乳素受体蛋白)，C57BL/6J雄性小鼠尾静脉注射腺病毒过表达HA标记持续激活S6K1 (+Ad-CA-S6K1)或者绿色荧光蛋白(-Ad-CA_S6K1)后给与亮氨酸缺乏饮食喂养7天(C和D，C，催乳素受体mRNA，D，催乳素受体蛋白)，GCN2+雄性小鼠亮氨酸缺乏饮食喂养7天，每天腹腔注射雷帕霉素(+Rapa)或者(-Rapa) lmg/Kg (E,催乳素受体，p-S6，P-S6K1蛋白表达，上图为免疫印迹，下图为定量图)，调控机制模型图(F)。动物实验数据至少经过2次独立实验，每组n=5-6，平均值土标准误，数据显著性通过t-test计算(p<0.05) 。【具体实施方式】
[0049]本发明人经过广泛而深入的研究,首次论证了催乳素受体(prolactin receptor,PRLR)对机体胰岛素敏感性具有提高作用，下调PRLR会明显降低胰岛素敏感性。因此，PRLR其本身或其上调剂能够用于增加胰岛素敏感性；并且，可基于PRLR的上述功能，筛选增加胰岛素敏感性的物质。
[0050]PRLR 及其用途 KTHYJHFK
[0051]催乳素受体(PRLR)是一种特异的、高亲和性的膜受体，研究发现其属于I类细胞因子受体家族，缺少内源激酶结构域，主要依靠胞内激酶来传导信号。目前已经发现三种催乳素受体，依据它们的长度分为短型，中型和长型。长型催乳素受体表达广泛，本发明人对于催乳素受体信号通路的研究也主要来源于长型。催乳素受体主要通过激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)和JAK/STAT5信号通路行使功能。
[0052]催乳素受体在哺乳动物的大部分组织和细胞中都有表达，参与调节很多生理过程，包括本领域技术人员所熟知的在增殖过程中起作用。但是，催乳素受体是否参与胰岛素敏感性这一影响葡萄糖稳态调节的重要机制，并不清楚。
[0053]本发明人发现了 PRLR增加胰岛素敏感性的新功能。本发明人在研究中发现，在小鼠肝脏过表达或抑制催乳素受体的表达能够增强或降低小鼠的胰岛素敏感性；在体外实验中采用人肝细胞H印G2或鼠原代肝细胞观察到了同样的现象。接着本发明人发现，发现 Extracellular Regulated Protein Kinases (ERK)在这一过程中起了重要作用。在胰岛素抵抗 模型db/db小鼠和胰岛素敏感性增强条件下(如亮氨酸缺乏小鼠)中，催乳素受体的表达分别降低或升高。相应的增强或减弱催乳素受体的表达能够恢复这两种条件下的胰岛素敏感性。最后本发明人发现，亮氨酸缺乏通过general controlnonderepressible (GCN) 2/mammalian target of rapamycin (mTOR)/S6K1 信号通路调节催乳素受体的表达。这些研究阐明了催乳素受体调节胰岛素敏感性的新功能，催乳素受体可作为治疗胰岛素抵抗药物的新靶点。这些结果明确了肝脏催乳素受体在调节胰岛素敏感性方面的新功能并且阐明了营养因素调节催乳素受体的表达。这些结果也暗示了催乳素受体作为治疗胰岛素抵抗及其相关疾病非酒精性脂肪肝的潜在靶标的可能性。
[0054]因此，基于本发明人的新发现，本发明提供了 PRLR蛋白的用途，用于制备增加胰岛素敏感性的组合物；或用于筛选增加胰岛素敏感性的物质。
[0055]胰岛素敏感性的增加对于预防、缓解或治疗胰岛素胰岛素抵抗或胰岛素抵抗相关疾病是有用的，这些疾病包括(但不限于):2型糖尿病，高血压，脂代谢紊乱，心血管疾病，肥胖，高胰岛素症，高尿酸症，或葡萄糖不耐性。
[0056]在本发明中，所用的PRLR蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的PRLR蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组PRLR蛋白。优选的，本发明可采用重组的PRLR蛋白。
[0057]任何适合的PRLR蛋白均可用于本发明。所述的PRLR蛋白包括全长的PRLR蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的PRLR蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号NP000940.1所示的序列基本上相同。[0058]经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的PRLR蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。PRLR蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见 Watson 等，Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, TheBenjamin/Cummings Pub.C0.P224。
[0059]任何一种PRLR蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PRLR蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PRLR蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长PRLR蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PRLR蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。
[0060]本发明也可采用经修饰或改良的PRLR蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的PRLR蛋白。所述经过修饰或改良的PRLR蛋白可以是一种PRLR蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的PRLR蛋白可以是与天然存在的PRLR蛋白具有较小的共同点，但也能增加胰岛素敏感性，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响PRLR蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中。
[0061]根据PRLR蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。优选的，所述的PRLR蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号NP 000940.1所示的序列基本上相同。
[0062]PRLR的上调剂及其用途
[0063]基于本发明人的上述新发现`，本发明提供了一种PRLR的上调剂的用途，用于制备增加胰岛素敏感性。`
[0064]如本文所用，所述的PRLR的上调剂包括了促进剂、激动剂等。任何可提高PRLR蛋白的活性、维持PRLR蛋白的稳定性、促进PRLR蛋白的表达、促进PRLR蛋白的分泌、延长PRLR蛋白有效作用时间、或促进PRLR的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于增加胰岛素敏感性的有效物质。
[0065]作为本发明的优选方式，所述的PRLR的上调剂包括(但不限于):包含编码催乳素受体的多聚核苷酸及与之操作性相连的表达调控序列的表达载体，该表达载体能够转化细胞并表达催乳素受体；或亮氨酸缺乏的食品。
[0066]作为本发明的优选方式，所述的PRLR蛋白的上调剂包括(但不限于):在转入细胞后可表达(优选过表达)PRLR的表达载体或表达构建物。通常,所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码PRLR的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0067]本发明中，PRLR多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0068]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PRLR的DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0069]组合物
[0070]本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00000 l-50wt% ;较佳的0.00001-20wt% ;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的PRLR蛋白或其上调剂，以及药学上可接受的载体。
[0071 ] 本发明的组合物可直接用于增加胰岛素敏感性。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。
[0072]通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
[0073]如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0074]如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0075]本发明的组合物含有安全有效量的PRLR蛋白以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0076]本发明所述的PRLR蛋白或其上调剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述的PRLR蛋白或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的PRLR蛋白或其上调剂每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0077]本发明还提供了一种增加胰岛素敏感性的方法，包括给予受试者有效量的PRLR蛋白或其上调剂，优选采用重组的PRLR蛋白。
[0078]本发明的PRLR蛋白或其上调剂的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局部的。例如，本发明的PRLR蛋白或其上调剂可通过脊髓鞘内注射、腹腔注射、静脉注射、口月艮、皮下注射、皮内注射等的方式给予动物，较为优选的是脊髓鞘内注射。
[0079]在得知了所述的PRLR蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的PRLR蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可直接将PRLR蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带PRLR基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的PRLR蛋白。
[0080]作为本发明的一种实施方式，可将所述的PRLR蛋白直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码PRLR蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或真核表达载体、或病毒载体如疱疫病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述PRLR蛋白的细胞中，使所述的细胞表达PRLR蛋白。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现PRLR蛋白的表达。
[0081]PRLR蛋白的上调剂的给药方式主要取决于所述上调剂的类型和特性，这是本领域人员可以评估的。
[0082]筛选增加胰岛素敏感性的潜在物质的方法
[0083]在得知了所述的PRLR蛋白在增加胰岛素敏感性方面的用途后，可以基于该特征来筛选促进PRLR的表达或活性的物质。
[0084]因此，本发明提供一种筛选可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质的方法，所述的方法包括:将候选物质与表达PRLR的体系接触；和检测候选物质对PRLR的影响；若所述候选物质可提高PRLR的表达或活性，则表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
[0085]在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到PRLR的表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达PRLR的体系。
[0086]所述的表达PRLR的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可以是内源性表达PRLR的细胞；或可以是重组表达PRLR的细胞。所述的表达PRLR的体系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)
坐寸ο
[0087]作为本发明的优选方式，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于增加胰岛素敏感性真正有用的物质。
[0088]本发明对于PRLR蛋白的表达、活性或存在量的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)=SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA 等。
[0089]另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于增加胰岛素敏感性真正有用的物质，从而用于临床。
[0090]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0091]除非另行定义，文1中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。[0092]1.研究方法及技术路线
[0093]本发明将动物模型与细胞模型相结合，分别以野生型C57BL/6J小鼠、HepG2和原代肝细胞为研究对象，收集胰岛素抵抗和催乳素受体基因敲除、过表达模型的肝脏组织及细胞样品，用于相应的研究。研究方法以qRT-PCR、Western Blotting、分子克隆等为主。
[0094]II.材料与方法
[0095]实验动物和处理
[0096]雄性C57BL/6J小鼠购买于上海斯莱克实验动物中心。GCN2敲除(knockout)(Gcn2+)和 Leptin receptor-deficient (db/db)小鼠分别获自 Penn State University,USA和中国南京大学。8-10周龄的雄性小鼠在上海斯莱克实验动物中心进行日常饲养，SPF条件严格符合以下标准:单笼培养，饲养温度23±3°C,湿度35±5%。昼夜12小时进行循环。在进行正式实验前，小鼠用购于该动物中心的符合国际标准的普通食物进行饲养。
[0097]正式实验所用的对照组粮食和亮氨酸缺乏组粮食购于美国Research Diets公司(New Brunswick, NJ),饲养方法见之前描述(Xiao F 等，Leucine deprivation increaseshepatic insulin sensitivity via GCN2/m T0R/S6K1 and AMPK pathways.Diabetes60:746-756)，简言之，小鼠首先用包含全部氨基酸的对照组粮食饲养7_10天，在适应了该种对照组粮食后，这些小鼠被随机分为2组:对照组和亮氨酸缺乏组。小鼠进行葡萄糖耐受(GTT)或胰岛素耐受实验(ITT)之后，用二氧化碳处死小鼠。
[0098]PD98059 购于美国 Promega 公司，是 ERK 的抑制剂(Di Paola R 等，PD98059，aspecific MAP kinase inhibitor, attenuates multiple organ dysfunction syndrome/failure (MODS) induced by zymosan in mice.Pharmacol Res61:175-187),用于注射腺病毒过表达催乳素受体或者对照组过表达绿色荧光蛋白的小鼠。PD98059处理组小鼠，在ITT实验之前5小时，尾静脉注射200ul PBS包含75uM Η)98059，对照组注射200ul PBS包含0.37%DMS0, PD98059 剂量是根据之前文章报道(Nijhara R 等，Sustained activation ofmitogen-activated protein kinases and activator protein I by the hepatitis Bvirus X protein in mouse hepatocytes in viv0.J Virol 75:10348-10358,2001)。雷帕霉素处理实验中，雷帕霉素购于中国Tauto Biothech公司，首先溶于无水乙醇中配成10mg/ml储液，注射之前，稀释于5%PEG400，5%Tween80和4%乙醇中，终浓度为0.4mg/ml，然后腹腔注射lmg/kg体重,对照组注射溶剂如之前描述(Ge Y等,mTOR regulates skeletalmuscle regeneration in vivo through kinase-dependent and kinase-1ndependentmechanisms.Am J Physiol Cell Physiol 297: C 1434-1444, 2009)。所有小鼠实验操作均遵循中国科学院营养科学研究所的动物保护与使用守则的相关细节。
[0099]原代细胞分离，细胞培养和处理
[0100]原代细胞通过灌注胶原酶分离，如之前描述(Wang Q等，Abrogation of hepaticATP—citrate lyase protects against fatty liver and ameliorates hyperglycemiain leptin receptor-deficient mice.Hepatology 49:1166-1175,2009)。分离的肝细胞在10%(v/v)FBS的DMEM中重悬，培养一天后感染病毒。
[0101]HepG2用含有10%热灭活胎牛血清、100微克/毫升链霉素和100单位/毫升青霉素的DMEM培养液进行培养。培养条件为37 °C，5%C02。PD98059处理组，HepG2先用TO98059预处理30min，然后在PD98059存在的情况下用IOOnm胰岛素刺激20min，对照组不加H)处理。
[0102]胰岛素抵抗的细胞模型利用HepG2细胞在含18mM葡萄糖胺(glucosamine)的无血清培基中培养18小时诱导形成，如之前所述(Sun C等，SIRTl improves insulinsensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B.Cell Metab6:307-319,2007)。对照组培基(含所需的所有氨基酸)和亮氨酸缺乏培基的配制方法:向Amino Acid-free DMEM(Invitrogen)中加入普通DMEM培基中所含的全部氨基酸(其中，亮氨酸缺乏培基不加亮氨酸)。
[0103]HepG2细胞转染siRNA:针对人源催乳素受体的双链siRNA从中国上海吉玛公司订购，细胞利用德国罗氏公司X-tremeGene siRNA转染试剂转染40pmol/L siRNA，对照组只加转染试剂。siRNA的序列为:正向:GAAGCAUUGUUCUAGACAATT(SEQ ID NO:1);反向:UUGUCUAGAACAAUGCUUCTT。
[0104]重组腺病毒的产生和注射
[0105]催乳素受体过表达质粒及CA-S6K1重组腺病毒是利用Qbiogene公司的AdEasy?Vector System 来产生的。
[0106]催乳素受体过表达重组腺病毒的构建步骤如下:催乳素过表达载体PACT2来自日本 Akihiko Yoshimura 实验室(参见 Takaho Endo 等，CISl Interacts with theY532of the Prolactin Receptor and Suppresses Prolactin-Dependent STAT5Activation.The Journal of Biochemistry 133:109-113，2002),以其为模板设计引物(序列为:正向:CGGGGTACCATGTCATCTGCAC (SEQ ID NO: 2);反向:CCGCTCGAGTCAGTGAAAGGA(SEQ ID NO:3))PCR 得到催乳素受体 cDNA,将其连在 P shut t Ie-CMV (Qbiogene, Montreal, Canada)的kpn-1和xho-1酶切位点，得到prlr-pshuttle质粒后，pmel酶切线性化与pAd-easy质粒(Qbiogene, Montreal, Canada)重组,重组成功之后,将重组质粒用pac I酶切,转染293A细胞(ATCC)，待细胞变圆，包出病毒，`包出病毒后扩增，然后cscl密度梯度超速离心，纯化进行后续试验。
[0107]CA-S6K1重组腺病毒构建步骤如下:CA_S6K1质粒从Addgene购买(编号8991)，构建方法同催乳素受体过表达病毒，先将其克隆到pshuttle-CMV的kpn_l和xho_l酶切位点，然后pmel酶切线性化与pAd-easy质粒重组，重组成功之后，将重组质粒用pac I酶切，转染293A细胞，待细胞变圆，包出病毒，包出病毒后扩增，然后cscl密度梯度超速离心，纯化进行后续试验。
[0108]绿色突光蛋白过表达重组腺病毒参见Yifu Qiu等,A crucial role for RACKlinthe regulation of glucose-stimulated IREl a activation in pancreatic β -cells.Science Signaling 3(106), ra7,2010。
[0109]腺病毒过表达scrambled(序列为TTCTCCGAACGTGTCACGT (SEQ ID N0:4)，不针对任何蛋白的shRNA序列)或者特异针对小鼠催乳素受体的shRNA序列是利用Invitrogen公司的BLOCK-1T? Adenoviral RNAi Expression System来产生的，具体的实验步骤参考该产品的说明书。病毒用PBS稀释，12孔板用量为107pfu/ml，小鼠尾静脉注射为109pfu/小鼠。
[0110]shRNA载体(催乳素受体knock down腺病毒载体)的构建方法:根据Invitrogen公司提供的BL0CK-1T? RNAi Designer程序，输入长型PRLR cds区序列，软件输出合适的序列，合成序列(Top:5’ -CACCGCCACCTACCATAACTGATGTCGAAACATCAGTTATGGTAGGTGGC-3’ (SEQ ID NO:5)， bottom:5’-AAAAGCCACCTACCATAACTGATGTTTCGACATCAGTTATGGTAGGTGGC-3’ (SEQ ID NO:6)),然后按照 BLOCK-1T? Adenoviral RNAi Expression System protocol,将序列连在pENTR?/U6载体(InvitiOgen)上，然后将连接成功的质粒与腺病毒载体pAd/BLOCK-1?-DEST (Invitrogen)重组，重组成功之后，将重组质粒用pac I酶切，转染293A细胞，待细胞变圆，包出病毒，包出病毒后扩增，然后cscl密度梯度超速离心，纯化进行后续试验。
[0111]血糖，血清胰岛素的测定，葡萄糖耐受实验(GTT)和胰岛素耐受实验(ITT)
[0112]血糖和血清中胰岛素的测定分别用Glucometer Elite monitor和MercodiaUltrasensitive Rat Insulin ELISA kit (ALPCO Diagnostic)检测。
[0113]葡萄糖耐受测试(GTT)，C57BL/6小鼠饥饿过夜后腹腔注射2g/kg葡萄糖溶液，然后分别在0，15，30，60，90，120min时利用血糖仪检测血糖水平。
[0114]胰岛素耐受测试(ITT)，C57BL/6小鼠饥饿4小时后腹腔分别注射0.75U/kg胰岛素，然后分别在0，15，30，60，90，120min时利用血糖仪检测血糖水平。
[0115]胰岛素抵抗指数(HOMA-1R)的计算为[饥饿葡萄糖水平(mmol/L) ] X [饥饿血清胰岛素(yU/ml)]/22.5。
[0116]体内胰岛素信号通路的检测
[0117]小鼠饥饿6小时注射胰岛素，如之前所述(Wang Q等，Abrogation ofhepaticATP—citrate lyase protects against fatty liver and ameliorateshyperglycemia in leptin receptor-deficient mice.Hepatology 49:1166-1175,2009)。小鼠麻醉后，下腔静脉注射2U/kg胰岛素，3min后，肝脏组织取一小块，液氮冷冻后放入-80°C冰箱保存备用。组织收取后加入细胞裂解液，提蛋白，然后western blot检测p-1R/t-1R, p-AKT/t-AKT 表达。
[0118]免疫印迹
[0119]免疫印迹方法如之前描述(ChengY 等，Leucine deprivation decreases fatmass by stimulation of lipolysis in white adipose tissue and upregulation ofuncoupling protein I (UCPl) in brown adipose tissue.Diabetes 59:17-25)。一抗(ant1-p-1R, ant1-1R, ant1-p-AKT, ant1-AKT, ant1-p-ERK, ant1-ERK(均购自美国 CellSignaling Technology 公司)，ant1-PRLR(购自 Santa Cruz Biotechnology))4°C孵育过夜，特殊蛋白利用ECL Plus (Amersham Biosciences)显色，条带亮度通过QuantityOne (Bio-Rad Laboratories)统计。
[0120]RNA提取及相对定量RT-PCR
[0121]催乳素受体mRNA水平通过RT-PCR检测，如之前所述(Xiao F等，Leucinedeprivation increases hepatic insulin sensitivity via GCN2/mT0R/S6Kl and AMPKpathways.Diabetes 60:746-756),序列为:
[0122]正向:5，-TGAGGACGAGCGGCTAATG-3，(SEQID NO:7)；
[0123]反向5’ -GGTGTGTGGGTTTAACACCTTGA-3’ (SEQ ID NO:8)。
[0124]统计分析
[0125]数值均以均值土标准差表示。两组间差别是否具有统计学意义采用非配对组间双尾t检验进行检测。对照组，亮氨酸缺乏组和限制饮食量组，这三组间的差别用one-wayANOVA检测后再用Student-Newman-Keuls test。当p〈0.05时,认为组间有统计学差异。
[0126]II1.实施例
[0127]实施例1、催乳素受体在体外调节胰岛素敏感性
[0128]为了确定催乳素受体在调节胰岛素敏感性方面的作用，本发明人利用催乳素过表达腺病毒载体感染HepG2细胞和原代肝细胞，检测催乳素受体对胰岛素信号通路两个关键组成蛋白胰岛素受体(IR)和AKT磷酸化的影响。之前研究发现催乳素的多种作用在上调催乳素受体表达之后被增强，并且催乳素受体的过表达会激活催乳素相关的细胞内信号通路。
[0129]本发明人发现，在HepG2细胞和原代肝细胞中过表达催乳素受体后，胰岛素引起的IR和AKT磷酸化水平显著增加(图1A)，提示催乳素受体在增加胰岛素敏感性方面的作用。和这些发现一致，分别利用RNAi干扰片段和腺病毒过表达shRNA降低催乳素受体表达之后，会降低胰岛素刺激引起的IR和AKT磷酸化水平(图1B)。
[0130]实施例2、在体内过表达催乳素受体增加胰岛素敏感性
[0131]为了研究催乳素受体在体内对胰岛素敏感性的调节作用，本发明人向小鼠尾静脉注射催乳素受体过表达腺病毒，首先发现实验组小鼠肝脏中，无论RNA水平还是蛋白水平，Prlr的表达相对于对照组都有很显著的增加(图2A)，然后实验组小鼠相对于对照组血糖在饱腹和饥饿状态都显著下降(图2B)，虽然饱腹时血清中胰岛素水平相差不大，但是饥饿状态下实验组小鼠血清中胰岛素水平显著下降，与此一致，催乳素受体过表达小鼠组HOMA指数也显著降低，为了进一步证明实验组小鼠葡萄糖的耐受和清除能力，本发明人做了葡萄糖耐受实验和胰岛素耐受实验，发现实验组小鼠注射葡萄糖60分钟后，血糖水平显著低于对照组(图2E)，注射胰岛素后，实验组小鼠血糖下降显著低于对照组(图2E)。
[0132]以上结果说明，催乳素受体过表达可以提高全身的胰岛素敏感性。与此一致，本发明人发现，催乳素受体过表达组小鼠肝脏中，胰岛素(Ins)刺激引起的IR和AKT磷酸化水平也显著增加(图2F)。雌鼠中也得到相似的结果。
[0133]实施例3、在体内降低催乳素受体表达降低胰岛素敏感性
[0134]为了进一步在体内研究催乳素受体对胰岛素敏感性的作用，本发明人利用催乳素受体knock down腺病毒载体尾静脉注射小鼠，发现肝脏中催乳素受体无论是mRNA水平还是蛋白水平相对于对照组都显著下降(图3A)。尽管小鼠饱腹血糖和空腹血糖都没有显著变化(图3B)，但是血清中胰岛素水平在两种状态下相对于对照组显著增加(图3C)，HOMA指数也有所增加(图3D)。和这些结果一致，GTT和ITT实验证明，实验组小鼠葡萄糖耐受和清除能力都显著降低(图3E)，并且肝脏中胰岛素刺激引起的IR和AKT磷酸化水平也显著降低(图3F)。
[0135]因此，在体内降低催乳素受体表达降低胰岛素敏感性。
[0136]实施例4、催乳素受体过表达腺病毒在体内通过激活ERK增加胰岛素敏感性
[0137]之前有研究发现ERK是催乳素受体信号通路的下游(Posner BI等；Pix)laCtinreceptors in rat liver!possible induction by prolactin.Science 188:57—59，1975)，而ERK信号通路可以调节胰岛素反应(Ge Y等，mTOR regulates skeletalmuscle regeneration in vivo through kinase-dependent and kinase-1ndependentmechanisms.Am J Physiol Cell Physiol 297: C1434-1444, 2009),这些研究暗不了 ERK作为催乳素受体的下游调节胰岛素敏感性，所以本发明人检测了催乳素受体对ERK磷酸化的影响。
[0138]本发明人发现，hepG2细胞和肝脏中过表达催乳素受体之后，ERK磷酸化水平显著增加(图4A)。为了进一步研究ERK在催乳素受体调节胰岛素敏感性中的作用，本发明人按照之前文章报道的剂量(Nijhara R 等，Sustained activation of mitogen-activatedprotein kinases and activator protein I by the hepatitis B virus X protein inmouse hepatocytes in viv0.J Virol 75:10348-10358, 2001)向小鼠体内注射ERK 的抑制剂PD98059 (PD)，检测它对催乳素受体过表达增加引起的胰岛素敏感性增加的作用。ITT实验发现催乳素受体过表达之后，葡萄糖清除能力增加，而Η)98059注射之后可以显著降低这种作用(图4B)。同时，催乳素受体过表达引起的IR和AKT磷酸化增加在注射TO98059之后也被显著抑制(图4C)。尽管只注射TO98059组小鼠胰岛素信号通路受损，但是TO98059对葡萄糖的清除能力并没有影响(图4C)。
[0139]实施例5、催乳素受体过表达可以提高体内体外胰岛素抵抗状态下的敏感性
[0140]基于通过注射过表达或者Knock Down催乳素受体腺病毒载体发现的催乳素受体对胰岛素敏感性的调节作用，本发明人推测催乳素受体可能参与胰岛素抵抗或者敏感性增加过程中对敏感性的调节。
[0141]首先，本发明人根据之前文章报道(Sun C等，SIRTl improves insulinsensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTP1B.CellMetab6:307-319, 2007)用18mM葡萄糖胺处理H印G2细胞，造成胰岛素抵抗细胞模型，然后本发明人检测胰岛素抵抗细胞中催乳素受体的表达，发现葡萄糖胺处理组催乳素受体表达显著下降(图5A)，在葡萄糖胺处理细胞中过表达催乳素受体之后，可以显著逆转葡萄糖胺造成的磷酸化IR和AKT下降(图5B)。
[0142]瘦素受体缺乏(db/db)小鼠，是常见的胰岛素抵抗小鼠模型(Cheng Y等；Leucinedeprivation decreases fat mass by stimulation of lipolysis in white adiposetissue and upregulation of uncoupling protein I(UCP I)in brown adipose tissue.Diabetes 59:17_25)，本发明人检测了 db/db小鼠中催乳素受体的表达，和体外结果一致，相对于正常小鼠，催乳素受体表达显著降低(图5C)。
[0143]为了研究催乳素受体下降是否是造成db/db小鼠胰岛素信号下降的原因，本发明人向db/db小鼠尾静脉注射催乳素受体过表达病毒，发现催乳素受体过表达组小鼠虽然血清中胰岛素水平变化不大，但是饱腹和空腹血糖都显著下降(图和图5E)，而且葡萄糖耐受和清除能力也显著增加(图5F)。
[0144]实施例6、降低催乳素受体表达可以在体内体外降低亮氨酸缺乏引起的胰岛素敏感性增加
[0145]之前研究发现亮氨酸(Ieu)缺乏时，胰岛素敏感性增加(Kelly PA等；Theprolactin/growth hormone receptor family.Endocr Rev 12:235-251,1991),所以本发明人在这种胰岛素敏感性增加情况下检测催乳素受体的表达，相对于胰岛素抵抗时催乳素受体表达下降(图5A和图5C)，催乳素受体mRNA和蛋白水平在亮氨酸缺乏培基处理的HepG2细胞和亮氨酸缺乏饮食喂养的小鼠肝脏中表达显著增加(图6A和图6B)。[0146]所以本发明人推测，催乳素受体参与了亮氨酸缺乏时对敏感性的调节，为了验证这个假设，本发明人在亮氨酸缺乏处理细胞中利用RNAi干扰片段降低催乳素受体表达，发现可以阻止亮氨酸缺乏引起的磷酸化IR和AKT增加(图6C)。为了进一步验证，本发明人在亮氨酸饮食缺乏7天处理小鼠(Kelly PA等)中注射knock down催乳素受体腺病毒载体，发现和体外结果相似，亮氨酸缺乏引起的葡萄糖耐受和清除能力增加在knock down催乳素受体之后显著降低(图6D和图6E)，并且胰岛素刺激后磷酸化IR和AKT也显著降低(图 6F)。
[0147]实施例7、亮氨酸缺乏时引起的催乳素受体增加是通过GCN2/S6K途径
[0148]尽管催乳素受体在调节亮氨酸缺乏时的胰岛素敏感性中起重要作用，但是亮氨酸缺乏是调节催乳素受体表达的机制并不清楚。GCN2是一种丝氨酸蛋白激酶，主要功能是作为氨基酸缺乏的感受器(Zhang W等，MAPK/ERK signaling regulates insulinsensitivity to control glucose metabolism in Drosophila.PLoS Genet 7: e1002429 ；Kodama H 等！Development of hyperglycaemia and insulin resistance inconscious genetically diabetic(C57BL/KsJ_db/db)mice.Diabetologia37:739-744,1994 ；ffek RC 等；Juxtaposition of domains homologous to protein kinases andhistidyl-tRNA synthetases in GCN2protein suggests a mechanism for coupling GCN4expression to amino acid availability.Proc Natl Acad Sci USA86:4579-4583,1989),本发明人推测GCN2可能参与了亮氨酸缺乏时对催乳素受体的调节。为了验证这种可能性，本发明人检测了 GCN2正常小鼠和敲除小鼠在亮氨酸缺乏或者正常饮食喂养7天后催乳素受体的表达，和预期一致，正常小鼠在亮氨酸缺乏时引起的催乳素受体mRNA和蛋白表达增加在GCN2敲除小鼠中大部分被阻止(图7A和图7B)。
[0149]之前研究发现，亮氨酸缺乏小鼠肝脏中mT0R/S6Kl信号通路降低(Kelly PA等)，因此本发明人推测降低的mT0R/S6Kl活性可能参与了催乳素受体的表达。为了验证这种可能性，本发明人在亮氨酸缺乏小鼠注中射持续激活S6K1过表达腺病毒，看其是否会降低亮氨酸缺乏时催乳素的表达。和预期一致，在注射持续激活S6K1过表达腺病毒小鼠肝脏中，催乳素受体mRNA和蛋白水平相对对照组显著降低(图7C和图7D)。因为之前发现亮氨酸缺乏引起的S6K1活性降低依赖于GCN2，暗示了 S6K1可能是GCN2调节催乳素受体表达的下游。这种可能性通过在売氣Ife缺乏饮食喂养的GCN2敲除小鼠中注射mTOR抑制剂雷帕霉素(Wek SA 等，The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF_2alphaprotein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation inresponse to starvation for different amino acids.Mol Cell Biol 15:4497—4506,1995)得到进一步验证，发现GCN2敲除小鼠雷帕霉素注射组肝脏催乳素受体表达显著高于对照组(图7E)。
[0150]实施例7、药物筛选
[0151]第一步:将HepG2细胞(或应用原代肝细胞)作为用于筛选增加胰岛素敏感性的药物的细胞模型。
[0152]第二步:药 物筛选:
[0153]测试组:用候选物质处理的H印G2细胞(或应用原代肝细胞)的培养物；
[0154]对照组:不用候选物质处理的HepG2细胞(或应用原代肝细胞)的培养物。[0155]在处理后适当时间，采用常规方法测定H印G2细胞的催乳素受体蛋白的表达(Western Blotting)或活性以及相应胰岛素信号通路的变化。如果与对照组相比，测试组中的催乳素受体蛋白的表达或活性显著上升30%以上，则说明该候选物质是潜在的增加胰岛素敏感性的物质。
[0156]将过表达催乳素受体蛋白的腺病毒载体作为候选物质，加入到H印G2细胞培养物中，观察胞内催乳素受体蛋白的量，结果发现催乳素受体蛋白的量显著增加30%以上，从而指示过表达催乳素受体蛋白的腺病毒载体可以作为提高胰岛素敏感性的候选药物。
[0157]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.一种催乳素受体或其上调剂的用途，用于制备增加胰岛素敏感性的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于预防、缓解或治疗胰岛素抵抗或胰岛素抵抗相关疾病。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的胰岛素抵抗或胰岛素抵抗相关疾病包括:糖尿病，高血压，脂代谢紊乱，心血管疾病，肥胖，高胰岛素症，高尿酸症，或葡萄糖不耐性。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于: 增加胰岛素受体或AKT磷酸化水平；或 增加葡萄糖耐受和清除能力。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的催乳素受体的上调剂选自:包含编码催乳素受体的多聚核苷酸及与之操作性相连的表达调控序列的表达载体；或亮氨酸缺乏的组合物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的表达载体为病毒载体。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的病毒载体选自下组:逆转录酶病毒，腺病毒，疱疫病毒或牛痘病毒。
8.催乳素受体的用途，用于作为筛选增加胰岛素敏感性的药物的靶标。
9.一种筛选用于增加胰岛素敏感性的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括: (1)将候选物质与包含催乳素受体的体系接触； (2)检测候选物质对催乳素受体的影响； 若所述候选物质可提高催乳素受体的表达或活性，则表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括:在测试组中，将候选物质加入到包含催乳素受体的体系中；和/或 步骤⑵包括:检测测试组的体系中催乳素受体的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的包含催乳素受体的体系； 如果测试组中催乳素受体的表达、活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的体系中还包含(如表达)胰岛素受体(IR)或AKT;且， 步骤(2)中，还包括:检测胰岛素受体或AKT磷酸化水平，若胰岛素受体或AKT磷酸化水平增加，则表明该候选物质是可用于增加胰岛素敏感性的潜在物质。
【文档编号】G01N33/15GK103585629SQ201210289347
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月14日 优先权日:2012年8月14日
【发明者】郭非凡, 肖斐, 于俊杰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院