胶原粉末和/或胶原衍生物粉末及其制造方法

专利名称：胶原粉末和/或胶原衍生物粉末及其制造方法
技术领域：
本发明涉及通过将由胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物构成的平均粒径I 1，000 μ m的粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂后进行干燥而得到的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末及其制造方法。
背景技术：
胶原具有3根多肽链缠绕成螺旋的结构，约300nm的多个胶原分子通过每个错开67nm而凝聚(会合)从而形成长胶原纤维。胶原是形成鱼、猪、牛等的原皮、腱、骨等的主要蛋白质，但在生物体内所含的大部分在水中是不溶性的。尽管胶原是不溶性的，但是生物体成分从而具有安全性良好、由于在动物之间相同性高因而难以引起免疫反应等优点。因此，正在研究在食品、医药品、化妆品领域中的应用，正在开发各种可溶化方法、可溶化胶原的利用方法。作为可溶化胶原，除了将在动物的皮、骨等原料中所含的微量可溶性胶原通过稀酸提取而得到的胶原以外，还有添加蛋白酶等酶来可溶化而得到的胶原(专利文献I)、添加碱来可溶化而得到的胶原(专利文献2)等。另一方面，水溶性胶原由于含水分量多，在透明的溶液化状态下的热改性温度低，因而也有提高了热改性温度的胶原(专利文献3)。在化妆品的配方中所采用的pH范围内具有等电点的胶原的水不溶性凝聚体(会合体)，由于是乳白色且不均匀等理由，认为不适于作为化妆品原料，但发现将具有PH5.5 8.5的等电点的胶原水溶液调整至其等电点付近的PH而得到的凝聚体的热改性温度显著提高，这样的凝聚体就可以作为化妆品原料来使用。实施例中，在等电点为PH约7.0的胶原溶液中添加最终浓度为5质量％的氯化钠来进行盐析，将所得的胶原沉淀物由盐酸溶解，之后由氢氧化钠中和，从而得到凝聚体的分散物。未改性的胶原是具有特有的三重螺旋结构的棒状分子，其水溶液耐热性低，经过热处理容易破坏胶原的螺旋结构。上述专利文献3中，使用所得的未改性胶原来评价人皮肤表皮细胞的接着性，明胶的情况下30分钟培养后的接着性全无，3小时培养后是能够观察到一点接着性的程度，但在使用未改性胶原的情况下，30分钟培养后观察到显著的接着性。未改性的胶原溶液在常温下也有改性的可能性，关于保管需要冷藏等温度管理。鉴于这样的胶原的保存性，有使用干燥胶原的方法(专利文献4)。制造方法为，将胶原溶液由喷嘴吐出到挥发性的亲水性有机溶剂介质中，生成丝状物或膜状物，将该丝状物等干燥，进行细切或粉碎得到粒状或粉状的胶原干燥物。记载了如下要点，即吐出至所述亲水性有机溶剂介质中的胶原溶液的胶原浓度为3 10质量％、由喷嘴的吐出速度为I 30m/min是合适的。此外，还有源自鱼皮的胶原衍生物的干燥物(专利文献5)。为了降低源自鱼的胶原的臭气，特征为将有机溶剂处理和离心分离处理进行组合，进而调制作为胶原的酰基化胶原等的胶原衍生物。实施例2中，在对鱼皮进行有机溶剂处理和离心分离处理后，通过醋酸酸性而将胶原可溶化，通过盐析而得到胶原沉淀物，将其冻结干燥而得到胶原干燥物。此夕卜，实施例4中，对鱼皮进行有机溶剂处理和离心分离处理，在沉淀物中添加氢氧化钠，搅拌一夜，离心分离后，在沉淀中加入柠檬酸水溶液并提取胶原，添加柠檬酸钠使胶原沉淀，在该胶原沉淀物中添加氢氧化钠溶液，调整至PH10，与琥珀酸酐发生作用来得到琥珀化胶原，然后通过盐酸酸性使琥珀化胶原沉淀，将所得的沉淀冻结干燥，得到胶原干燥物。此外，胶原因处理方法不同而等电点各异，在酸性条件下进行可溶化的胶原的等电点存在于pH7 9.5，因此，在pH5以上溶解性变差，生成沉淀凝集，鉴于此，还有将胶原酯化而提高水溶性的方法(专利文献6)。专利文献6中，预先在动物组织的状态下进行胶原的酯化反应，然后进行酯化胶原的提取操作。由此，可以以简单的工序低价地制造酯化胶原。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特公昭44-1175号公报专利文献2:日本特公昭46-15033号公报专利文献3:日本特开2000-128764号公报专利文献4:日本特开平6-228505号公报专利文献5:日本特开2000-256398号公报专利文献6:日本特开平8-27192号公报

发明内容
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发明所要解决的课题由于维持三重螺旋结构的未改性的胶原的保湿性良好且对于人皮肤表皮细胞的接着性良好，因此是化妆品配比、医疗用的用途开发所要求的化合物。但是，溶解于溶液的胶原的热改性温度低，即使在常温也会改性，需要冷藏保存。即，将维持了三重螺旋结构的胶原在溶解的状态下混合的胶原化妆品，为了防止胶原的改性，需要在冰箱等中保存，使用上不便利。此外，由于胶原在等电点容易析出，如果因细菌感染等溶解液的PH变动则溶液变得白浊，或因析出而易于发生堵塞等。因此，希望开发在溶解时构成三重螺旋结构的未改性的胶原粉末的制造方法。另一方面，由于胶原会因微量水分而膨润，因此不易于制造粉末。在上述专利文献4记载的方法中，为了得到干燥胶原，将可溶化胶原溶液在有机溶剂中吐出而纤维化，但纤维化的操作极为复杂。此外，专利文献5虽然对胶原进行冻结干燥而得到胶原干燥物，但处理时间长，所需的必要的干燥能量大。进一步，胶原本身是保湿性良好的化合物。如上述专利文献6的比较例I所示，记载了:尝试将端胶原(atelocollagen)进行盐析而得到的胶原的沉淀物由乙醇洗净，但由于胶原纤维中浸入了含有食盐的水而无法除去。这样的话，在胶原的干燥中，需要冻结干燥、喷雾干燥等技术，制造工序、装置变得复杂。因此，希望开发出不需复杂工序、简便地调制胶原粉末的方法。另一方面，未改性胶原，如上述专利文献3所示，具有细胞培养时的接着性方面良好等活性。因此，即使是胶原粉末，在将其溶解时，也需要维持三重螺旋结构。例如，有经过加压喷嘴从塔顶供给含有目标成分的溶液，输送热风来造粒的方法等，但胶原易于热改性，这样的方法来造粒也很困难。因此，希望开发出制造工序简易、制造能量少、溶解时能构成三重螺旋结构的未改性的胶原粉末的制造方法。进一步，本来可溶性胶原具有依存于提取方法的等电点，可溶性胶原在等电点的溶解性低。因此，使用中性化妆水等来溶解干燥胶原是困难的。因此，在用于化妆品用途时，希望有在一般化妆品的PH5.5 8.5能快速溶解的胶原粉末。对于将胶原粉末化的需求，不限于天然的胶原，对于胶原衍生物也同样。鉴于上述现状，本发明的目标在于提供微细的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。此外，本发明的目标在于提供能够简便地调制的未改性的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法。解决课题的手段本发明人发现，如果对胶原溶液进行等电点沉淀，在溶液中胶原凝聚而沉淀，但如果在搅拌胶原溶液的同时进行等电点沉淀，可以得到由比通常更短径的平均粒径I
I,000 μ m的胶原沉淀物构成的粗胶原沉淀物；如果将所述粗胶原沉淀物的浓度调节到12 50质量％，将其分散于亲水性有机溶剂中，则可有效地对胶原沉淀物进行脱水而分离取出固形物，通过风干而成为胶原粉末；通过使用短径的粗胶原沉淀物，可以进行有效地脱水和干燥，其结果，可以制造短径的胶原粉末；由上述方法所得的胶原粉末在110°C的高温也不改性，耐热性良好；如果将该粉末溶解，胶原在溶液中呈现三重螺旋结构，从而完成了本发明。即，本发明提供胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，通过将含有12 50质量％的平均粒径I 1，000 μ m的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂，分离固形物，进行干燥而获得。进而，本发明提供胶原粉末和/或胶原衍生物粉末制造方法，特征在于，将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液，在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时在PH3.5 10进行等电点沉淀，得到平均粒径I 1，000 μ m的等电点沉淀物，调制所述等电点沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度至含有12 50质量％以作为粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。此外，本发明提供胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于，将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在PH3.5 10进行等电点沉淀，将所述沉淀破碎，得到平均粒径I 1，000 μ m的等电点沉淀物,调制所述等电点沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度至含有12 50质量％以作为粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。此外，本发明提供胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于，将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时进行盐析，得到平均粒径I 1，000 μ m的盐析物，调整所述盐析物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度至12 50质量％，得到粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。此外，本发明提供胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于，对含有胶原和/或胶原衍生物的溶液进 行盐析，将所述盐析物破碎，得到平均粒径I 1，000 μ m的盐析物，调整所述盐析物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度至12 50质量％，得到粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。此外，本发明提供的上述胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法中，所述亲水性有机溶剂是醇、酮、醚及其混合液。此外，本发明中，在从胶原和/或胶原衍生物溶液使所述胶原和/或胶原衍生物凝聚而形成胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物时，通过在搅拌所述胶原和/或胶原衍生物溶液的同时添加盐类以通过盐析使胶原和/或胶原衍生物沉淀，或将所述胶原和/或胶原衍生物溶液调整到PH3.5 10并在进行搅拌的同时使胶原和/或胶原衍生物进行等电点沉淀，可以调整胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的粒径。发明效果由本发明的制造方法所得到的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的热稳定性、保存性良好。而且，由于胶原和/或胶原衍生物构成为三重螺旋结构，胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的溶解液对于皮肤等的保湿性良好。本发明的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末与其溶液相比，输送效率良好，可以降低保管、输送费用。进而，由于胶原等的溶液粘度高，在从容器转移时会发生在容器上的附着、残存、流失等，而胶原粉末则避免了这些问题，可以进行简便的操作。本发明的胶原粉末的制造方法，由于粗胶原沉淀物的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度为12 50质量％，通过亲水性有机溶剂易于进行脱水，可以通过风干来进行干燥，制造极为简便。


图1是显示 实施例1中调制的胶原沉淀物的相差显微镜图像的图。图2是显示实施例1中调制的胶原粉末的电子显微镜图像的图。图3是显示实施例1中调制的胶原粉末的差示扫描量热计(DSC)的结果的图。图4是显示实施例1中的将粉末胶原再溶解的胶原溶液的圆二色性的图。图5是实施例1中所得的胶原粉末的粒度分布的图。图6是显示实施例1中的测定粒度分布的胶原粉末的电子显微镜图像的图。图7是显示实施例4中调制的胶原粉末的电子显微镜图像的图。图8是显示实施例4中的将粉末胶原再溶解的胶原溶液的圆二色性的图。图9是显示比较例3中调制的胶原沉淀物的相差显微镜图像的图。图10是比较例4中所得的胶原粉末的粒度分布的图。图11是显示比较例4中的使用喷雾干燥机干燥而得的胶原粉末的电子显微镜图像的图。图12是计算实施例1、实施例7的粉末胶原和比较例3、比较例5的胶原的溶解初速度的图。图13是显示比较例5中所得的胶原海绵的电子显微镜图像的图。图14是显示比较例6中所得的胶原纤维的电子显微镜图像的图。
具体实施方式
本发明的第一方面是胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，是通过将含有12 50质量％的平均粒径I 1，000 μ m的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中、分离固形物、干燥而得到的。此外，本发明的第二、第三方面是胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于，将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时在pH3.5 10进行等电点沉淀,或将等电点沉淀物破碎，得到平均粒径I 1，000 μ m的等电点沉淀物，调整所述等电点沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度至含有12 50质量％，作为粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。此外，本发明的第四、第五方面是胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于，将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时进行盐析，或将盐析物破碎，得到平均粒径I 1，000 μ m的盐析物，将所述盐析物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度调整到12 50质量％，得到粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。以下，详细说明本发明。(I)胶原和/或胶原衍生物本申请说明书中，“胶原”是蛋白质的一种，是3根多肽链卷绕成螺旋的蛋白质的总称。以往已知有I XXIX型，但作为本发明中所使用的胶原，可以是任一种，也可以是新发现的胶原。生物体内中所含的胶原的大部分是水不溶性的，本发明中，把将动物的皮、骨等原料中所含的胶原通过添加蛋白酶等酶而可溶化的胶原、通过添加碱而可溶化的胶原称为“可溶化胶原”。需要说明的是，生物体内，在动物的皮、骨等原料中，也含有少量溶解于中性盐溶液、酸性溶液的可溶 性胶原。本发明中所使用的胶原，只要是在水溶液中可溶解的即可，可以是将不溶性胶原进行可溶化而成的，也可以是本来含有的可溶性胶原。需要说明的是，本申请说明书中，是使用以生物体内大量存在的不溶性胶原作为原料来调制的“可溶化胶原”来进行说明，但本申请的发明中的“胶原”中包括“可溶性胶原”和“可溶化胶原”的双方。此外，“胶原纤维”是指多个“胶原分子”相互之间凝聚而成的意思。作为胶原分子，相当于所述的可溶化胶原、可溶性胶原。对可溶化胶原溶液进行等电点沉淀或盐析，则胶原分子相互之间发生凝聚，可以作为沉淀物分离胶原纤维。胶原纤维有时会在沉淀时多个胶原纤维凝聚而作为大的凝集体来沉淀。因此，本发明中的“凝聚”包含了胶原分子相互之间的结合和胶原纤维相互之间的结合。此外，“胶原沉淀物”是指从胶原溶液以固体析出的胶原，“胶原粉末”是指“胶原沉淀物的粉状固形物”。需要说明的是，“可溶化胶原”、“可溶性胶原”，在化学处理时，构成氨基酸被改性。因此，作为本发明中所使用的“胶原”，包括例如通过碱处理将天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基等通过碱的脱酰胺反应而分别改变为天冬酰胺酸残基和谷氨酰胺酸残基的胶原。即，将胶原分子中所含的酰胺基转变为羧基，在胶原的实效电荷为负时，将等电点调整至酸性或中性。例如，对于碱可溶化胶原，天冬酰胺残基和谷氨酰胺残基通过碱的脱酰胺反应而转变为天冬酰胺酸残基和谷氨酰胺酸残基，等电点为PH4.5 6.0，转变为酸性。本发明中，也可以是这样的构成胶原的氨基酸被改性的胶原。进而，本发明中的“胶原衍生物”是指在构成所述胶原的氨基酸上修饰了其他的官能基团的物质。例如，酰基化胶原、酯化胶原等。需要说明的是，作为胶原衍生物，除了预先调制的酰基化胶原、酯化胶原以外，也可以是盐析、等电点沉淀时被酯化或被酰基化的胶原。在从含有胶原组织提取可溶化胶原、可溶性胶原的工序之前，有时会对胶原进行酰基化来调整等电点，此外，作为酯化胶原的制造方法，有时预先将含有胶原组织中所含的不溶性胶原进行酯化，然后对酯化胶原进行等电点沉淀来分离。需要说明的是，作为酰基化胶原、酯化胶原，如下所示。(i)酰基化胶原作为酰基化胶原，有琥珀化胶原、邻苯二甲酸化胶原、马来化(7 X力化)胶原等。例如是将经过酶处理而提取的端胶原溶液调整到PH9 12，之后，添加琥珀酸、邻苯二甲酸酸酐、马来酸酐等酸酐而成的琥珀化胶原、邻苯二甲酸化胶原、马来化胶原等的酰基化胶原等。(ii)酯化胶原作为酯化胶原，除了将可溶化胶原酯化外，包括在不溶性胶原酯化后，由酶反应等进行可溶化的酯化胶原等。作为用于对胶原进行作用而得到酯化胶原的醇类，除了伯醇之外，还可以是仲醇、叔醇。此外，不限于I元醇，可以是2元醇、3元醇、其他的多元醇。例如，作为I元醇，例举甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、dl-2-丁醇、叔丁醇、1-戊醇、dl-2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、dl-2-己醇、dl_3-己醇、1_庚醇、2-庚醇、3-庚醇、
1-辛醇、dl-2-辛醇、3-辛醇、1-壬醇、2-壬醇、3-壬醇、4-壬醇、5-壬醇、癸醇、1-1^一醇、
2-1^一癸醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚、乙二醇单苯基醚等。此外，作为2元醇，有乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇(M.W.200 20000)、丙二醇、1，3_ 丙二醇、二丙二醇、甘油、1，2_ 丁二醇、1，3_ 丁二醇、1，4-丁二醇、2，3-丁二醇、1，5-戊二醇、2，4-戊二醇、1，6-己二醇、2，5-己二醇。作为其他的多元醇，有甘油、各种糖醇等。本发明中所使用的胶原衍生物和胶原在溶解液中具有三重螺旋结构。(2)粗胶原沉淀物本发明中使用的粗胶原沉淀物是“含有12 50质量％的平均粒径I 1，000 μ m的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的粗胶原沉淀物”。如所述的胶原在生物体内是不溶性的，这样的不溶性胶原通过酶处理、碱处理可以调制成可溶化胶原。这样的可溶化胶原在水溶液中进行调制，通过盐析、等电点沉淀而被精制，成为固形的沉淀物。本发明中，使用如此得到的胶原的沉淀物。这样的胶原沉淀物、由此得到的胶原粉末如果再度在溶液中溶解，则成为具有三重螺旋结构的胶原溶液。此外，将粗胶原沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的平均粒径限定为I 1，000μπι，这是因为发现胶原沉淀物通过亲水性有机溶剂而可以效率良好地脱水，通过风干而可以粉末化，所得的粉末成为微细的胶原粉末。为此，本发明中，还发现了将胶原沉淀物的平均粒径控制在短径一侧的方法。即，如果将可溶化胶原溶液进行等电点沉淀、盐析，则胶原分子相互之间发生凝聚而成为胶原纤维，进而胶原纤维发生凝聚而成为凝集体，因此，一般地，沉淀物的 平均粒径为约2，000 μ m或其以上。但是，通过在搅拌胶原溶液的同时控制胶原的凝聚，同时生成胶原沉淀物，可以将所得的胶原沉淀物的平均粒径控制在I 1，OOO μ m,最终可以得到平均粒径I 1，000 μ m的胶原粉末。⑴平均粒径本发明中使用的粗胶原沉淀物的平均粒径为I Ι,ΟΟΟμπι，更优选为5 900 μ m,特别优选为10 750 μ m,更加优选为30 500 μ m。平均粒径如果超过1，000 μ m，则有时会有粉末化困难的情形。需要说明的是，胶原分子的长径是300nm，在胶原分子相互之间不发生凝聚的情况下，胶原的粒径为300nm。但是，如后所述，发现这样的300nm的胶原分子平行地多个结合形成的SLS纤维，SLS纤维相互凝聚而形成凝集体，成为沉淀物。这样的SLS纤维的沉淀物中，如果假定3个以上的SLS纤维发生凝聚，则下限为I μ m。需要说明的是，本申请中的粗胶原沉淀物的平均粒径是由相差显微镜所观察的值。本申请的发明中，将相差显微镜图像中具有的长径作为粗胶原沉淀物的粒径，将十个视野中所含的全部粗胶原沉淀物的粒径进行平均，得到平均粒径。在调制粗胶原沉淀物时，在控制所构成的胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物的粒径为短径的过程中，对溶解可溶化胶原、胶原衍生物的溶液进行物理处理、化学处理，或将生成的沉淀物进行物理破碎，可以进行调整。(1-Ι)物理处理作为物理处理方法，例如，有将溶解胶原、胶原衍生物的溶液进行搅拌的同时进行盐析，或在搅拌溶液的同时在PH3.5 10进行等电点沉淀的方法。通过搅拌，抑制胶原分子相互之间的凝聚，成为纤维长度较短的胶原纤维，进而可以抑制由多个胶原纤维的凝聚生成的凝集体。进而，通过将生成的沉淀物破碎，可以沉淀出粒径短的胶原沉淀物。搅拌的程度可以根据溶液的胶原、胶原衍生物的浓度、搅拌方法、搅拌容器的形状、尺寸等适宜地选择。此外，为了有效地抑制因胶原纤维的凝聚而生成的凝集体，或有效进行生成的沉淀物的破碎，还可以使用具有搅拌和破碎机构 的装置。(1-2)化学处理此外，作为化学处理方法，有添加阻止胶原分子相互之间的凝聚的凝聚阻止剂的方法。作为这样的凝聚阻止剂，有葡萄糖、蔗糖、木糖、半乳糖、果糖、甘油等的糖类。此外，有形成胶原分子的束状集合体的ATP。例如，在胶原溶液中在酸性条件下添加三磷酸腺苷(ATP)，胶原分子的碱基性部位相互之间被ATP的磷酸基交联。通过ATP，多个胶原分子平行地交联，生成胶原分子的碱基性部位相互之间被ATP的磷酸基交联的SLS(Segment-long-spacing)纤维。即，通过所述的疏水性相互作用，胶原分子相互之间优先凝聚，由ATP而产生胶原分子的交联，因此，300nm的胶原分子平行地连结，成为平均粒径300nm的SLS纤维。需要说明的是，多个SLS纤维凝聚而形成凝集体，形成沉淀。SLS纤维中，除了胶原之外，含有ATP作为交联剂，与其他胶原、胶原衍生物同样，可以在含有ATP的状态下粉末化。此外，还可以在得到SLS纤维的沉淀物后除去ATP，然后进行粉末化。(ii)胶原浓度粗胶原沉淀物中的所述平均粒径I 1，000 μ m的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度为12 50质量％，更优选为15 40质量％，特别优选为20 35质量％。如果为12质量％以下，则粗胶原沉淀物的含水率过高，通过亲水性有机溶剂的脱水效率变差，如果进行干燥，有时不能成为微细且多孔质的胶原粉末，而成为膜状。另一方面，不容易调制成50质量％以上的粗胶原沉淀物，而且，有时还不能均匀地分散于亲水性有机溶剂中。需要说明的是，粗胶原沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物以外的主成分是构成沉淀前的胶原溶液、胶原衍生物溶液的水溶液。(iii)粗胶原沉淀物的调制方法本发明中，可以将等电点沉淀、盐析中所得的粗胶原沉淀物作为原料来使用。由于在等电点沉淀物的调制工序中也可以进行盐析，以下对调制等电点沉淀物的情形下的粗胶原沉淀物的调制方法进行说明。此外，本发明中，还可以使用I XXIX型中任一种胶原，但以下对于从生物体提取I型胶原的情形进行说明。本发明中使用的胶原，可以自牛、猪、鸟、鱼等动物的皮肤、其他的含有胶原的组织中采取。一般地，胶原多含于动物的结缔组织中，但如果通过热处理来提取，胶原发生热改性而破坏特有的三重螺旋结构，成为明胶状态。本发明中使用能构成三重螺旋结构的胶原。作为这样的胶原的提取方法，有将动物的骨、皮等作为材料，通过碱处理、酸处理、酶处理而可溶化的方法等。优选将牛、猪、鸡、鸵鸟、马、鱼类等的真皮、腱作为胶原的提取原料。如果使用源自胎儿等的组织或使用动物的组织，则收率提高，因而优选。(ii1-Ι)等电点ρΗ4.5的粗胶原沉淀物例如，可以使用如下物质，即:作为成为原料的不溶性胶原，将石灰浸溃后的二层皮(床皮)洗净，用切片机细切成约IOcm方块，剁碎后进一步将机械性地磨碎的物质使用丙酮、醚等有机溶剂或者脂肪分解酶使用进行脱脂后，充分洗净来使用。将不溶性胶原在最终浓度为3质量％氢氧化钠、1.9% (v/w) 一甲胺的混合的可溶化水溶液中悬浊，使得胶原的最终浓度为4.5质量％，在18°C进行3周可溶化处理。可溶化反应停止后，加入最终浓度为5质量％氯化钠等盐，进行盐析，在由盐酸等调制成酸性的水溶液中再溶解盐析沉淀，由布、滤纸、金属网等进行过滤来精制，将该胶原溶液用氢氧化钠调制到PH4.5即可以得到等电点4.5的粗胶原沉淀物。需要说明的是，平均粒径可以通过在搅拌上述胶原溶液的同时进行pH4.5的等电点沉淀、盐析来调整到I Ι,ΟΟΟμπι。这样的平均粒径的控制方法在(ii1-2)、(iii_3)、(ii1-4)中也同样。(ii1-2)等电点ρΗ9.0的粗胶原沉淀物可以将牛皮的真皮层用绞肉机等搅碎，将脱脂后充分洗净的不溶性胶原作为原料。在蒸馏水中悬浊，使得不溶性胶原的胶原最终浓度为I质量％，之后，加入盐酸，调整到ρΗ3.0。加入相对于胶原重量百分之一量的酸性蛋白酶，在25°C进行72小时可溶化处理。酶反应停止后，如上所述，在得到的酶可溶化胶原液中加入最终浓度为5质量％的氯化钠来进行盐析，通过离心分离来回收沉淀。回收的盐析沉淀分散到一定容量的蒸馏水中，使得胶原浓度为2质量％，加入盐酸，调整到pH3.0,进行均匀溶解，得到胶原溶液。然后，将该胶原溶液用布和滤纸过滤后，由氢氧化钠调整到PH9.0，可以得到等电点9.0的粗胶原沉淀物。(ii1-3)等电点ρΗ4.5 9.0的粗胶原沉淀物将不溶性胶原、(ii1-2)记载的所述酶可溶化胶原悬浮于最终浓度3质量％氢氧化钠、1.9% (v/w) 一甲胺 的水溶液中，进行所需时间的碱处理，从而可以得到沉淀物。例如，在以酶可溶化胶原为原料的情况下，4小时的碱处理可以将等电点降低到7.8，通过I天的碱处理将等电点降低至5.6。在到达所需等电点时，加入盐酸来停止反应，加入氯化钠使最终浓度为5质量％来进行盐析，通过离心分离回收沉淀。将回收的盐析沉淀物分散于一定容量的蒸馏水中，使得胶原浓度为2质量％，加入盐酸，调整至pH3.0，进行均匀地溶解，得到胶原溶液。然后，将该胶原溶液用布和滤纸过滤后，由氢氧化钠调整到所需的等电点的PH即可，可以得到等电点4.5 9.0的粗胶原沉淀物。(ii1-4)由胶原衍生物构成粗胶原沉淀物将不溶性胶原、(ii1-2)记载的酶可溶化胶原或者(ii1-Ι)记载的碱可溶化胶原进行酰基化或酯化，可以得到等电点PH4.5 9.0的胶原衍生物。需要说明的是，还可以将胶原分子中羧基衍生成羧酸酰氯、所述醇类的羟基与酰氯的脱盐酸反应来进行酯化。例如，在将等电点9.0的酶可溶化胶原进行酰基化时，胶原的氨基被改性而等电点向酸性侧偏移。此外，在将等电点4.5的碱可溶化胶原进行酯化时，胶原的羧基被改性而等电点向碱性侧偏移。在到达所需等电点时，加入最终浓度为5质量％的氯化钠来进行盐析，通过离心分离回收沉淀。将回收的盐析沉淀分散于一定容量的蒸馏水中，使得胶原浓度为2质量％，加入盐酸调整至pH3.0，进行均匀溶解，得到胶原溶液。然后，将该胶原溶液用布和滤纸过滤后，由氢氧化钠调整到所望的等电点的pH，可以得到等电点4.5 9.0的粗胶原沉淀物。(iv)等电点胶原、胶原衍生物的等电点可以通过可溶化方法、其他的方法来调整。本发明中，以将所述胶原和/或胶原衍生物溶液调整到PH3.5 10而得到的胶原和/或胶原衍生物为对象来作为等电点沉淀物。等电点是指在含有胶原和/或胶原衍生物的水溶液中，胶原和/或胶原衍生物表现出最小溶解度时的溶液的pH。一般地，胶原的等电点为pH4.3 9.3，但在不足PH4.3、超过p H9.3的溶液中也会形成沉淀物，因此，把将所述胶原和/或胶原衍生物溶液调整至PH3.5 10而得到的胶原和/或胶原衍生物作为等电点沉淀物。更优选为pH4.0 9.0、特别优选为pH4.5 9.0的等电点沉淀物。此外，对应于用途，还可以使用ρΗ3.5 8.0、ρΗ3.5 7.0、ρΗ3.5 6.0、ρΗ4.5 5.0的等电点沉淀物。如后述实施例所示，本发明的胶原粉末，即使平均粒径增大，也具有与微细粒子大致相同的比表面积，因而认为溶解性良好，即使在本来溶解性差的中性溶液中溶解性也良好。需要说明的是，将含有胶原和/或胶原衍生物溶液调整至ΡΗ4.5而回收的粗胶原沉淀物的等电点为ΡΗ4.5、含有胶原和/或胶原衍生物水溶液调整至ρΗ9.0而回收的粗胶原沉淀物的等电点为ΡΗ9.0。本申请的发明中，在亲水性有机溶剂中分散的“粗胶原沉淀物”并不限于等电点为ΡΗ4.5的粗胶原沉淀物、等电点为ρΗ9.0的粗胶原沉淀物，根据用途还可以使用等电点为ΡΗ4.5的粗胶原沉淀物和等电点为ρΗ9.0的粗胶原沉淀物的混合物等。这是因为，不限于等电点，粗胶原沉淀物中所含的所述胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度只要为12 50质量％，将胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物在亲水性有机溶剂中均匀分散，就可以制造微细的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。(2)亲水性有机溶剂作为分散所述粗胶原沉淀物的亲水性有机溶剂，只要是与水混和的含有碳原子的溶剂即可，没有特别限定，例举例如醇、酮、醚、酯、极性非质子性溶剂等。作为醇，有甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等碳原子数I 6的一元醇、乙二醇、丙二醇等多元醇等。作为酮，有丙酮、甲乙酮等。此外，作为醚，有二乙醚、甲乙醚、乙二醇单甲醚、二乙二醇单丁醚等乙二醇醚、四氢呋喃、二恶烷等环状醚等。而且，作为酯，有醋酸乙酯、乳酸乙酯等，作为极性非质子性溶剂，有二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶等。其中优选可以与水以任意比例混和的溶剂，可以举出例如丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺等。其中，可以适合地使用乙醇、丙酮、二乙基醚或这些的混合液。使用量可以根据亲水性有机溶剂而适宜选择，例如在使用乙醇时，相对于所述粗胶原沉淀物I质量份可以添加乙醇3 2000质量份，优选5 1000质量份，更优选10 100质量份，特别优选10 30质量份。(3)胶原粉末和胶原衍生物粉末本发明的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末是通过将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中、分离固形物、干燥而获得的。通过亲水性有机溶剂对粗胶原沉淀物进行脱水，将所得的固形物干燥而成为胶原粉末、胶原衍生物粉末。所述粗胶原沉淀物通过等电点沉淀调整至固有的等电点。该等电点由于不因亲水性有机溶剂的脱水、其后的干燥而改变，因而本发明的胶原粉末、胶原衍生物粉末的等电点依存于等电点沉淀时的等电点。在使用等电点为PH4.5的粗胶原沉淀物时，则成为等电点为PH4.5的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，在使用等电点为pH9.0的粗胶原沉淀物时，则成为等电点为pH9.0的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。而且，在使用例如等电点为PH4.5 9.0的胶原和/或胶原衍生物的混合物时，成为等电点为pH4.5 9.0的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。本发明的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末在等电点为pH3.5 8.0、更优选等电点PH3.5 7.0、特别是等电点pH3.5 6.0的场合，该粉末5mg的pH6.5溶液的溶解初速度为0.2mg/分以上，更优选为0.3mg/分以上，特别优选为0.5mg/分以上。需要说明的是，本发明中的“溶解初速度”是以后述实施例中所示方法测定的。由于以往的等电点pH3.5 8.0的胶原在中性溶液中的溶解性不充分，因此，需要在比其等电点更酸性侧的溶液中暂时溶解，然后添加碱来调整至PH5.5 8.5。本发明中，例如等电点为PH4.5的胶原粉末的情况下，为了在pH5.5 8.5的溶解液中快速溶解，不需要在酸性更强的酸中溶解，因此，也就不需要其后的碱的添加。不仅溶解操作简便，且可以避免因使用酸和碱而形成的盐类。此外，由于不再需要溶解于碱，可以避免胶原的肽化，可以制造三重螺旋结构的含有率高的胶原溶液。对本发明的胶原粉末和胶原衍生物粉末的平均粒径没有限定，但通过使用平均粒径1 1，000 μ m的粗胶原沉淀物等，最终平均粒径为8 1，000 μ m、优选为10 1000 μ m、更优选为30 950 μ m、更加优选为30 900 μ m、特别优选为30 800 μ m的胶原粉末、胶原衍生物粉末。需要说明的是，本申请说明书中，胶原粉末、胶原衍生物粉末的平均粒径，与所述粗胶原沉淀物同样地，也是由电子显微镜测定的值。如上所述，由于凝聚通常变为2000 μ m以上，如果通过喷雾干燥则不足5 μ m。本发明的胶原粉末和胶原衍生物粉末，由于平均粒径为8 1，000 μ m，可以防止飞散且可以确保流动性。而且，如后述的实施例所示，如果胶原粉末的平均粒径不足5 μ m，则有时会在溶解液中会形成结块(”)，溶解性下降，但如果在上述范围内就不会形成结块，溶解性良好。
此外，本发明的胶原粉末和胶原衍生物粉末，由于以亲水性有机溶剂来分散粗胶原沉淀物，在溶剂中胶原微细地分散，所得的沉淀物为多孔质，发现增大了比表面积。本发明的胶原粉末和胶原衍生物粉末的比表面积为0.5m2/g以上，优选为0.8 30m2/g，更优选以上，1.0 25m2/g，特别优选1.2 20m2/g，更加优选1.5 20m2/g。基于这样的比表面积，确保了亲水性、溶解性。即使胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，在胶原浓度低的情况下，因亲水性有机溶剂进行脱水困难，沉淀物固化成颗粒状，不能得到粉末状的干燥物。此外，胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物的平均粒径为以往的2，000 μ m的情形下，粉末化变得困难。因此，本发明中，为了将胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的平均粒径控制在I 1，000 μ m，将粗胶原沉淀物中所含的胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物的浓度控制在12 50质量％，在由亲水性有机溶剂进行脱水时，能以粉末状进行脱水，分离的固形物通过风干得到胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。而且，在亲水性有机溶剂中分散之前的胶原沉淀物，由于平均粒径为I 1，000 μ m,发现将其风干则成为平均粒径8 1，000 μ m的胶原粉末。这被认为是在上述亲水性有机溶剂中的分散、干燥工序中，可以避免胶原的凝聚、凝集。需要说明的是，本发明中，还可以对上述胶原衍生物粉末、胶原粉末实施更微细的加工。本发明的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，由于不经过加热工序而被干燥，若将其溶解，则成为三重螺旋结构的胶原。此外，本发明的胶原粉末、胶原衍生物粉末的耐热性良好，因而不需要以往的胶原溶液那样的冷藏保存。需要说明的是，如果将本发明的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末溶解，所述凝集体、胶原纤维溶解成为原来的胶原分子、胶原衍生物分子。因此，将该溶液以以往的方法进行等电点沉淀或盐析，能够生成平均粒径比1，000 μ m大，即以往的约2，000 μ m的胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物。(4)用途本发明的胶原粉末、胶原衍`生物粉末适合用于医疗用途、化妆品用途等。例如，作为化妆品用途，可以例示化妆水、乳液、美容液、一般霜剂、卸妆油等的洗脸用、面膜、剃须霜、防晒霜、防晒乳、防晒油、化妆皂、粉底、扑面粉、口红、唇膏、洗发水、护发素等。此外，作为医疗用途，可以例示再生医疗中使用的DDS(给药系统，Drug DeliverySystem)的载体、ES细胞、iPS细胞等各种细胞的培养基材、止血剂、褥创治疗剂、骨充填剂
坐寸ο(5)制造方法本发明的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末由如下方式制造:将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时，在PH3.5 10进行等电点沉淀，得到平均粒径I 1，000μπι的等电点沉淀物，调整所述等电点沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度至含有12 50质量％，作为粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。此外，也可以通过改变等电点沉淀物而进行盐析，得到平均粒径I 1，000 μ m的盐析物，调整所述盐析物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度到12 50质量％，得到粗胶原沉淀物，将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。
(i)粗胶原沉淀物的生成对胶原溶液进行等电点沉淀或盐析，一般会沉淀出平均粒径约2，000 μ m的胶原沉淀物。但是，如前所述，通过抑制胶原分子的凝聚或物理粉碎，调制出由平均粒径I 1，000 μ m的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物构成的粗胶原沉淀物。需要说明的是，为了得到平均粒径为I 1，000 μ m的胶原沉淀物而搅拌胶原溶液时，优选在胶原沉淀物生成前和胶原沉淀物生成后都进行搅拌。在胶原沉淀物的生成前，可以阻止胶原分子的凝聚而生成纤维长的短胶原纤维，并且，在胶原沉淀物的生成后，可以阻止胶原纤维的凝聚来抑制凝集体的生成。需要说明的是，在使用所述的电动磨碎机(I ^ZT 口 4夕''一)等的石臼式磨碎机时，由于在搅拌的同时进行沉淀物的破碎，因而优选。这是因为对由胶原溶液生成的沉淀物进行破碎，能使粒径变小。进而，在通过盐析或等电点沉淀得到沉淀物后，也可以在溶液中由石白式磨碎机等对所述沉淀物进行破碎。由于是在溶液中，不会加热沉淀物而进行破碎，可以分离凝集体的凝聚，使沉淀物的粒径变小。搅拌、破碎的程度，可以根据溶液的胶原、胶原衍生物的浓度、搅拌方法、搅拌容器的形状、尺寸等适宜选择，如前所述，在使用均质器时，旋转数为1，000 20，OOOrpm,搅拌时间可根据旋转数等而适宜选择，为I分钟 5小时。通过测定实际的粒径，改变搅拌强度，可以得到所需平均粒径的胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物。需要说明的是，本发明中，胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物的破碎，如上所述在胶原溶液中进行。这是因为不需要从溶液中分离沉淀物的工序，且破碎效率良好。需要说明的是，本发明中作为抑制胶原分子的凝聚的方法，可以添加所述的凝聚阻止剂，例如，在胶原溶液中在酸性条件下添加三磷酸腺苷(ATP)等凝聚阻止剂，通过ATP的添加，可以生成300nm的SLS纤维， 得到多个SLS纤维凝聚而成的凝集体作为沉淀物。本发明中，在添加凝聚阻止剂的同时，还可以搅拌胶原溶液来物理地抑制凝聚。通过搅拌来破碎SLS纤维的凝集，可以将沉淀物的粒径调整至更短径。本发明中，将胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度为12 50质量％的等电点沉淀物作为粗胶原沉淀物来使用。在所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度不足12质量％时，将经过离心分离、过滤等回收的等电点沉淀物再度进行等电点沉淀，由调整到相同PH的水进行洗净、脱盐，再度进行离心分离、过滤等，可以作为粗胶原沉淀物来使用。同样地，在由盐析生成沉淀物时，如果再度盐析并由相同盐浓度的水洗净后，再度进行离心分离、过滤等，可以作为粗胶原沉淀物来使用。需要说明的是，在通过等电点沉淀物、盐析物的单次的离心分离、过滤等达到上述浓度时，这样的离心分离、过滤就同时成为浓度调整工序，不再需要特别的浓度调整工序。(ii)在亲水性有机溶剂中的分散本发明中，将如此所得的粗胶原沉淀物分散于所述亲水性有机溶剂中。如此是对粗胶原组成物进行脱水。所使用的亲水性有机溶剂的温度优选为15°C以下。这是为了可溶化胶原、胶原衍生物不发生改性，维持三重螺旋结构。相对于粗胶原沉淀物的所述亲水性有机溶剂的使用量可以根据所使用的亲水性有机溶剂而适宜选择，例如，在使用乙醇时，相对于所述粗胶原沉淀物I质量份，添加乙醇3 2000质量份，优选5 1000质量份，更优选10 100质量份，特别优选10 30质量份。需要说明的是，在分散有粗胶原沉淀物的亲水性有机溶剂中，优选所述亲水性有机溶剂的浓度为75质量％以上，更优选为90质量％以上，特别优选为95质量％以上。如果粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中的胶原分散液的亲水性有机溶剂的浓度不足75质量％，由于从亲水性有机溶剂回收的胶原吸湿，需要长时间的干燥时间，且干燥中胶原分子相互接着，会有不能得到微细且多孔质的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的情形。粗胶原沉淀物还可以在亲水性有机溶剂中分散后进行搅拌。例如，在使用均质器时，以旋转数1，000 20，OOOrpm、更优选2,000 13，OOOrpm、特别优选2，500 10，OOOrpm、尤其优选3，000 5，OOOrpm来搅拌。搅拌时间可以根据旋转数等适宜选择，为I分钟 5小时，更优选为I分钟 3小时，特别优选为3分钟 I小时，更加优选为5分钟 30分钟。需要说明的是，上述搅拌条件是例示，根据搅拌装置的搅拌方法而各不同。对应于实际的分散程度，可以适宜选择。需要说明的是，由于搅拌会产生热，优选在冷却的同时进行搅拌。(iii)固形物的分离在亲水性有机溶剂中分散的粗胶原沉淀物在溶剂中进行沉淀。本发明中，为了分离该沉淀物，对亲水性有机溶剂分散液进行过滤，或通过离心分离等的分离手段来分离胶原沉淀物。通过这样的亲水性有机溶剂进行的分散和分离，I次就足够了，但也可以进行2 3次等多次。(iv)干燥本发明中，对所述固形物进行干燥，可以得到胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。本发明的特征在于，在室温通过 风干来干燥所述固形物。但是，也可以以采用干燥机等其他的方法来干燥。此时，优选温度不足15°C。构成所述粗胶原沉淀物的胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物，平均粒径为I 1，000 μ m,比以往更短，因而每单位质量的表面积增大，通过亲水性有机溶剂的脱水变得容易，由于粗胶原沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度为12 50质量％，降低了亲水性有机溶剂中所含的水分量，通过风干干燥，能够使胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物的粉末化。而且，由于可通过风干来干燥，避免了加热处理，可以防止胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的热改性。由此，胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的溶液呈现三重螺旋结构。需要说明的是，本发明中，如此所得的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末还可以进一步由研磨等进行破碎来调整粒径。以往，作为胶原的精制方法，已知有在酸性的胶原溶液中添加盐类来沉淀的盐析方法、添加有机溶剂的有机溶剂沉淀法、添加酸或碱的等电点沉淀法等。但是，没有在等电点为pH3.5 10的胶原溶液的等电点沉淀物、盐析物中添加亲水性有机溶剂而使胶原粉末化的例子。胶原本来的亲水性高，即使在等电点沉淀物中也存在大量的水，因此一般是通过冻结干燥、喷雾干燥等来形成固形物。当然，在所述专利公报6的比较例I中，尝试了用乙醇对端胶原进行盐析的胶原的沉淀物进行洗净，但记载了由于在胶原纤维中浸入了含有食盐的水而无法脱水。但是，本发明中，通过将等电点沉淀物、盐析物中所含的胶原沉淀物、胶原衍生物沉淀物控制在平均粒径为I 1,000 μ m，可以容易地在亲水性有机溶剂中分散，通过将粗胶原沉淀物的所述胶原沉淀物的浓度限制在12 50质量％，可以由亲水性有机溶剂有效地进行脱水，因此，可以将从亲水性有机溶剂中分离的固形分的含水率调整至极低，将其在室温进行干燥，可以调制成微细的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末。需要说明的是，尽管可以花长时间将胶原溶液在室温干燥而得到胶原的干燥物，但胶原、胶原衍生物附着在容器的壁上等，成为膜状、板状或块状。本发明的特征在于，通过风干来得到胶原粉末。此外，如果将胶原浓度为0.1 10质量％的溶解液经过喷嘴的吐出孔投入到亲水性有机溶剂中来使胶原纤维沉淀，所得的胶原纤维的表面上不能形成多孔，成为表面平滑的膜状。实施例以下例举实施例来具体说明本发明，本发明不受这些实施例的任何限制。(实施例1)(I)将猪皮的真皮层由绞肉机等细碎，将脱脂后充分洗净的不溶性胶原作为原料。在构成为最终浓度为3质量％氢氧化钠、1.9% (v/w) 一甲胺混合可溶化水溶液中，使调制的不溶性胶原悬浊，使得胶原最终浓度为4.5质量％，在18°C进行3周的可溶化处理。如上所述而得到的碱可溶化胶原液中，添加氯化钠以使得最终浓度为5质量％来进行盐析，通过离心分离回收沉淀。将回收的盐析沉淀在一定容量的蒸馏水中分散，使得胶原浓度为3质量％，添加盐酸调整至pH3.0，均匀地溶解。然后由布和滤纸过滤后，由氢氧化钠调整至PH4.5，由电动磨碎机(石臼式磨碎机增幸产业社制)以流速500ml/min、旋转数1，500rpm、间隙(” 了 m )50μπι进行搅拌，同时对胶原进行等电点沉淀。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为141 μ m。然后,通过17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀，再度调整至PH4.5，由蒸馏水洗净、脱盐，进行10次上述的离心分离，回收粗胶原沉淀物。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为30质量％。所得的胶原沉淀物的相差显微镜图像示于图1。

然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器进行30分钟的分散，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。表I中显示胶原的性状、等电点、可否粉末化等。(2)通过电子显微镜图像观察所得的胶原粉。结果示于图2。粉末胶原的平均粒径为158mm,判断为多孔质的粉体。(3)用差示扫描量热计(DSC)测定所得的胶原粉末的改性温度。结果示于图3和表
2。作为对照也显示实施例1中所得的碱可溶化胶原溶液的结果。确认了粉末胶原在112°C有大的热量变化的峰。(4)将所得的胶原粉末5mg再溶解于IOmM醋酸Iml中，在20°C测定由5mM醋酸调制的最终浓度0.lmg/ml的胶原溶液的圆二色性(CD)。结果示于图4。作为对照，也显示了实施例I中所得的碱可溶化胶原溶液(未改性胶原)和所述碱可溶化胶原溶液在温度100°C进行3分钟热改性的碱可溶化胶原溶液(改性胶原)的结果。再溶解的胶原溶液(本发明的胶原粉末)与未改性胶原的曲线基本一致，表明在20°C维持了三重螺旋结构。(5)将上述(I)中调制的固形胶原，使用中央化工机株式会社制的振动干燥机VU-45，在真空度40Torr、干燥温度40°C干燥4小时，得到胶原粉末。对该胶原粉末，使用4连式比表面积细孔分布测定装置(Quantachrome制、商品名“N0VA_4200e型”)，由BETl点法测定比表面积。结果示于表3。
(6)对于上述(5)中调制的胶原粉末，由激光衍射散乱法测定粒度分布。使用(株式会社七4 V >企业制、商品名“LMS_2000e”)进行测定。该胶原粉末的平均粒径示于表3，粒度分布示于图5，胶原粉末的电子显微镜图像示于图6。(7)将所得的胶原粉末5mg分别添加到Iml的表4所示组成的溶解基准液、溶解液A、溶解液B、溶解液C、溶解液D中，评价溶解性。(8)此外，使用溶解液B来测定溶解初速度。由于胶原的亲水性高，不清楚溶解与膨润之间的区别，所以如下进行溶解初速度的测定。溶解初速度的测定在内径10mm、长度40mm、容量2ml的圆筒形试管中，与Iml表I的溶解液B—起混合样品5mg，密封，进行I分钟内20次的180°C的摇动混和。需要说明的是，溶解液B和操作在温度20°C下进行。混和后，在2分钟、4分钟、6分钟、8分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟时，取样其一部分，对5，OOOrpm离心的上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用CBB染色凝胶。脱色后，用图像解析软件(NIH image)对胶原带的浓度定量，算出上清液的胶原浓度。接着，根据经过时间与胶原浓度之间的关系算出溶解初速度。需要说明的是，溶解初速度是由混和O时至10分钟以内的直线性的时间来算出。表5中显示溶解性、表6中显示溶解初速度的结果。需要说明的是，表5中，◎表示不到45分钟即溶解的情形，〇表示在45分钟以上不到90分钟内溶解的情形，Λ表示在90分钟以上不到180分钟内溶解的情形，X表示180分钟以内不溶解的情形。此外，图12显示测定溶解初速度时，上述上清液的胶原浓度的经时变化。(实施例2)
除了将分散粗胶原沉淀物的亲水性有机溶剂变更为丙酮以外，与实施例1同样地操作，得到胶原粉末。使用所得的胶原粉末5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I显示实施例2的概要，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。由于溶解液的添加，胶原粉末快速溶解，得到透明的胶原溶液。(实施例3)除了将分散粗胶原沉淀物的亲水性有机溶剂变更为二乙醚以外，与实施例1同样地操作，得到胶原粉末。使用所得的胶原粉末5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I显示实施例3的概要，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。由于溶解液的添加，胶原粉末快速溶解，得到透明的胶原溶液。(实施例4)(I)将牛皮的真皮层由绞肉机等细碎，将脱脂后充分洗净的不溶性胶原作为原料。在蒸馏水中悬浊，使得不溶性胶原的胶原最终浓度为2质量％，之后，加入盐酸调整至pH3.0。加入相对于胶原重量百分之一的量的酸性蛋白酶,在25°C进行72小时可溶化处理。酶反应停止后，在如上所述所得的酶可溶化胶原液中加入最终浓度为5质量％的氯化钠，来进行盐析，通过离心分离回收沉淀。将回收的盐析沉淀分散于一定容量的蒸馏水中，使得胶原浓度为I质量％，加入盐酸调整至PH3.0，均匀地溶解。然后，使用布和滤纸进行过滤，之后由氢氧化钠调整至pH9.0,由电动磨碎机在流速500ml/min、旋转数1，500rpm、间隙50 μ m下进行搅拌，同时对胶原进行等电点沉淀。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为131 μ m。然后，由17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀后，再度调整至PH9.0，用蒸馏水洗净、脱盐，将上述离心分离进行10次，回收作为粗胶原沉淀物。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为23质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器进行30分钟的分散，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。(2)通过电子显微镜图像观察所得的胶原粉末。结果示于图7。粉末胶原的平均粒径为333 μ m，判明为多孔质的粉体。(3)由差示扫描量热计(DSC)测定所得的胶原粉末的改性温度。结果示于表2。确认了粉末胶原在113°C的大的热量变化的峰。(4)在IOmM醋酸Iml中再溶解所得的胶原粉末5mg，在20°C测定由5mM醋酸调制到最终浓度0.lmg/ml的胶原溶液的圆二色性(CD)。结果示于图8。确认了再溶解的胶原溶液(本发明的胶原粉末)的三重螺旋结构特有的221nm的峰，明确可知在20°C维持了三
重螺旋结构。(5)使用所得的胶原粉末5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I表示实施例4的概要，表5表示溶解性，表6表示溶解初速度的结果。(实施例5)在实施例4所得的酶可溶化胶原液中，加入最终浓度为5质量％的氯化钠，由电动磨碎机在流速500ml/min、旋转数1，500rpm、间隙50 μ m下搅拌，同时对胶原进行盐析，由17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀，上述离心分离进行10次，得到粗胶原沉淀物。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为142 μ m。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为38
质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器进行30分钟分散，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(实施例6)在实施例4所得的酶可溶化胶原液中一边搅拌一边加入最终浓度为0.22质量％的三磷酸腺苷2钠(ATP 2Na)，在冰上静置I小时。由离心分离回收生成的SLS纤维。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为13.4μπι。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为12
质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物SOmg投入温度20°C的乙醇20g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(实施例7)在实施例1所得的碱可溶化胶原液中，加入氢氧化钠，调制至pH4.5，通过静置对胶原进行等电点沉淀。之后，由电动磨碎机在流速500ml/min、旋转数1，500rpm、间隙50 μ m的条件下对等电点沉淀进行破碎。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为724 μ m。由离心分离回收沉淀后，再度调制至pH4.5，用蒸馏水洗净、脱盐，上述离心分离进行10次，回收作为粗胶原沉淀物。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为27质量％。

然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。
使用所得的胶原粉末5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。此夕卜，图12显示在测定溶解初速度中，上述上清液的胶原浓度的经时变化。(实施例8)在实施例1所得的碱可溶化胶原液中，添加氢氧化钠，调制至pH4.5，通过静置对胶原进行等电点沉淀。之后，由电动磨碎机在流速500ml/min、旋转数1，500rpm、间隙50 μ m的条件下，进行3次等电点沉淀的破碎。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为335 μ m。由离心分离回收沉淀后，再度调制至pH4.5，由蒸馏水洗净、脱盐，上述离心分离进行10次，回收作为粗胶原沉淀物。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为28质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。使用所得的胶原粉末5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。(实施例9)将实施例1所得的碱可溶化胶原的等电点沉淀物(等电点pH4.5)在甲醇中分散，加入最终浓度为0.1M的盐酸。在室温搅拌3小时的同时进行酯化反应，由氢氧化钠溶液调至PH中性，停止反应的同时使胶原沉淀。将沉淀物离心分离后，再溶解于IOmM的醋酸，得到甲酯化胶原。甲酯化胶原的等电点为PH7.9。在甲酯化胶原溶液中加入最终浓度为5质量％的氯化钠，由均质器搅拌的同时进行盐析，由17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀，上述离心分离进行10次，得到粗胶原沉淀物。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为244 μ m，胶原浓度为29质量％。
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然后，将所得的粗胶原沉淀物0.5g投入温度20°C的乙醇9.5g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液，分离固形胶原，在室温风干，得到胶原粉末。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(实施例10)在实施例4所得的酶可溶化胶原液(等电点pH9.0)中加入氢氧化钠溶液，调整至PH8 9，对胶原进行等电点沉淀。在该等电点沉淀分散液中加入最终浓度为0.5mM的琥珀酸酐，在室温搅拌的同时进行I小时酰基化反应。反应后，加入盐酸使溶液为酸性，加入最终浓度为5质量％的氯化钠，使反应停止的同时使琥珀化胶原沉淀。将沉淀物离心分离后，在IOmM的醋酸中再溶解琥珀化胶原，得到琥珀化胶原。琥珀化胶原的等电点为5.4。在琥珀化胶原液中加入最终浓度为5质量％的氯化钠，用均质器搅拌的同时进行盐析，由17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀，上述离心分离进行10次，得到粗胶原沉淀物。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为167 μ m，胶原浓度为42质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物0.5g投入温度20°C的乙醇9.5g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。表I显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(实施例11)在实施例4所得的酶可溶化胶原液(等电点9.0)中加入5倍浓度的PBS (_)，调整至胶原浓度为0.75mg/ml，在37°C搅拌一夜的同时形成胶原再生纤维。该用均质器破碎再生纤维分散液,调制微细的再生纤维分散液。将该再生纤维分散液由17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀，上述离心分离进行10次，得到粗胶原沉淀物。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为213 μ m。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为30质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物0.5g投入温度20°C的乙醇9.5g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液，分离固形胶原，在室温通过风干得到胶原粉末。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(比较例I)将实施例1所得的碱可溶化胶原溶液(最终浓度I质量％ ) 50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液。但是，过滤后胶原分散物成为膜状，没有形成为粉末。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(比较例2)在实施例1所得的碱可溶化胶原液中添加氢氧化钠调整至pH4.5，由电动磨碎机在流速500ml/min、旋转数1，500rpm、间隙50 μ m下搅拌的同时对胶原进行等电点沉淀。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为141 μ m。然后，由17，500rpm、20分钟的离心分离回收沉淀后，再度用调整至PH4.5的蒸馏水进行洗净、脱盐，回收作为粗胶原沉淀物。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为10质量％。然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液。但是，过滤的胶原分散物为膜状，没有形成为粉末。表I中显示粗胶原沉淀物的性状、等电点、可否粉末化等。(比较例3)(I)在实施例1所得的碱可溶化胶原液中添加氢氧化钠调制至pH4.5，通过静置对胶原进行等电点沉淀。所得的沉淀物中所含的胶原沉淀物的平均粒径为1，858 μ m。由离心分离回收沉淀后，再度调整至PH4.5，由蒸馏水洗净、脱盐，上述离心分离进行10次，回收作为粗胶原沉淀物。该粗胶原沉淀物的胶原浓度为33质量％。所得的胶原沉淀物的相差显微镜图像示于图9。然后，将所得的粗胶原沉淀物50g投入温度20°C的乙醇950g中，使用均质器分散30分钟，过滤分散液。但是，过滤的胶原分散物为膜状，没有形成为粉末。(2)使用所得的胶原固形物5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I显示比较例3的概要，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。此外，图12显示在溶解初速度的测定中，上述上清液的胶原浓度的经时变化。(比较例4)(I)将实施例1中所得的碱可溶化胶原的等电点沉淀物在蒸馏水中分散，使得最终浓度为3%，进行30分钟均质，以得到均匀的分散液。使用喷雾干燥机，以入口温度1200C、出口温度60°C的方式调节热风温度，对该分散液进行喷雾干燥，得到胶原粉末。表I显示比较例4的概要，表4显示溶解性的结果。通过喷雾干燥而得到的胶原粉末在20小时后仍仅有约20%左右的溶解。由于原料的胶原沉淀物与实施例1相同 ，因此，与实施例1之间的溶解性的差异不是胶原分子的不同，而是依存于处理工序的形状的不同造成的。如果观察溶解残留，喷雾干燥品的胶原粉末因微细而成为小块状，仅小块的表面半透明地溶解。由于喷雾干燥中胶原粒子的平均粒径小至4.60 μ m，且其表面比较光滑，因而溶解液难以浸透到小块的内部，这被认为是溶解性差的理由。与此相对,实施例1 4，实施例7 10任一项都没有形成小块。(2)对于上述⑴中调制的胶原粉末，与实施例1同样地由BETl点法测定比表面积，由激光衍射散乱法测定粒度分布。比表面积和平均粒径示于表3，粒度分布使用图10，胶原粉末的电子显微镜图像示于图11。(比较例5)(I)将实施例1所得的粗胶原沉淀物在盐酸中再溶解，使得最终浓度为I质量！％，之后由氢氧化钠中和，得到PH7.5的碱可溶化胶原溶液。将该溶液冻结干燥，制作胶原海绵。图13显示胶原海绵的电子显微镜图像。(2)使用所得的胶原海绵5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I中显示比较例5的概要，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。此外，图12中显示溶解初速度的测定中，上述上清液的胶原浓度的经时变化。(比较例6)(I)将实施例1所得的粗胶原沉淀物在盐酸中再溶解，使得最终浓度为I质量％，之后由氢氧化钠中和,得到PH7.5的碱可溶化胶原溶液。使用27G( H )的注射针在乙醇中吐出该溶液，之后通过风干制作胶原纤维。图14显示胶原纤维的电子显微镜图像。(2)使用所得的胶原纤维5mg，与实施例1同样地操作，评价溶解性。表I显示比较例6的概要，表5显示溶解性，表6显示溶解初速度的结果。[表 I]

权利要求
1.一种胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，是通过将含有12 50质量％的平均粒径I 1，000 μ m的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中、分离固形物、干燥而得到的。
2.如权利要求1所述的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，特征在于，所述粗胶原沉淀物是胶原和/或胶原衍生物的PH3.5 10的等电点沉淀物或盐析物。
3.如权利要求1所述的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末，特征在于，所述粗胶原沉淀物的等电点为PH3.5 8.0，该粉末5mg的pH6.5溶液的溶解初速度为0.2mg/分钟以上。
4.一种胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时在pH3.5 10进行等电点沉淀,得到平均粒径I 1，000 μ m的等电点沉淀物， 调整所述等电点沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度到含有12 50质量％，作为粗胶原沉淀物， 将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。
5.如权利要求4所述的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，所述胶原的凝聚的控制是对含有所述胶原和/或胶原衍生物的溶液进行搅拌。
6.一种胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液 在PH3.5 10进行等电点沉淀，破碎所述沉淀，得到平均粒径I 1，000 μ m的等电点沉淀物， 调整所述等电点沉淀物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度到含有12 50质量％，作为粗胶原沉淀物， 将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。
7.—种胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 将含有胶原和/或胶原衍生物的溶液在控制胶原和/或胶原衍生物的凝聚的同时进行盐析，得到平均粒径I 1，000 μ m的盐析物， 将所述盐析物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度调整到12 50质量％，作为粗胶原沉淀物， 将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。
8.—种胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，特征在于， 对含有胶原和/或胶原衍生物的溶液进行盐析，破碎所述盐析物，得到平均粒径I 1,000 μ m的盐析物， 将所述盐析物中所含的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的浓度调整至12 50质量％，得到粗胶原沉淀物， 将所述粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。
9.如权利要求4 8任一项所述的胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的制造方法，所述亲水性有机溶剂是醇、酮、醚及其混合液。
全文摘要
本发明提供胶原粉末和/或胶原衍生物粉末及其制造方法，该制造方法的特征在于，将含有12～50质量％的平均粒径1～1,000μm的胶原沉淀物和/或胶原衍生物沉淀物的粗胶原沉淀物分散于亲水性有机溶剂中，分离固形物，进行干燥。由于通过分散于亲水性有机溶剂中可将沉淀物脱水，因此可以将所得的上述所述固形物通过风干进行干燥。而且，由于扩大了比表面积，所得胶原粉末和/或胶原衍生物粉末的溶解性良好，且由于平均粒径为8～1,000μm，操作性良好。
文档编号A61K38/00GK103080194SQ201180037728
公开日2013年5月1日 申请日期2011年7月29日 优先权日2010年7月30日
发明者田中启友, 小仓孝之, 服部俊治, 松田刚一, 小林善胜, 大井章司 申请人:株式会社日皮