专利名称：人抗HBsAg单链抗体/人抗体轻链恒定区/鱼精蛋白截短体重组基因、编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的基因治疗，具体涉及基因工程方法构建的一 种由人抗HBsAg单链抗体、人抗体轻链恒定区和鱼精蛋白截短体的编码序列 组成的重组基因ScFv-Ck-tP，还涉及这种基因编码的ScFv-Ck-tP融合蛋白， 以及由该融合蛋白介导的siRNA、 siRNA表达组件(siRNA expression cassettes, SECs)或siMA表达质粒的靶向输送在抗HBV感染及相关疾病治 疗中的应用。
背景技术：
由乙型肝炎病毒(h印atitis B virus, HBV)所引起的乙型肝炎是一种 传播广泛、危害严重的传染性疾病，也是导致慢性肝病，如肝硬化、肝癌的 最常见原因。但是目前的抗HBV及其相关疾病的治疗并不让人满意，常用的抗 HBV的制剂主要有两大类cc-干扰素和核苷类似物如拉米呋啶(Lamivudine) 和阿德福韦(Adefovir)。但是oc干扰素的长期有效率仅为30% ~ 40%，而核苷 类似物在治疗过程中也存在着抗病毒作用短暂、易于诱发DNA多聚酶突变而形 成耐药以及病毒复制水平快速反跳等缺点，因此需要研究和发展高效、特异 的抗乙肝病毒药物。同时，由乙肝病人转变来的肝硬化、肝癌的治疗也非常 困难，严重威胁人类的健康，也需要开发出高效、特异的治疗药物。
RNA干涉(RNA interference, RNAi)是双链RNA介导的、序列特异的
转录后基因沉默现象。由于它能够高效特异地关闭或降低特定基因的表达， RNA干涉技术已被广泛应用于多种疾病的基因治疗研究中，并取得了显著的
结果，在乙型肝炎的治疗研究中更是取得了令人瞩目的结果体内外实验都 证实了针对HBV的siRNA或siRNA表达质粒都可以高效抑制HBV的基因表达 和复制。RNA干涉技术的出现为乙型肝炎的抗病毒治疗提供了新的契机，但 是，将RNA干涉技术应用于临床还面临许多问题，如siRNA或siRNA表达质
粒在体内不稳定、细胞摄取率低、无法靶向输送等。而如何安全有效地将siRNA 传递至体内靶部位是RNAi应用过程中最关键的一个问题。
siRNA或siRNA表达质粒的靶向输送将为上述问题的解决提供新的手段， 特异性地将siRNA或siRNA表达质粒导入靶细胞，而避免对正常细胞的副作 用，及大量应用siRNA或siRNA表达质粒时所引起的非特异性免疫反应。目 前关于siRNA靶向输送的研究还处于起步阶段，抗体引导的siRNA的耙向输 送是其中最有前景的策略之一。目前基于这一策略的研究报道不多，就所用 的抗体分子而言，已有报道的是抗HIV gP120的Fab抗体和抗HER2分子的单 链抗体两种，它们分别针对HIV感染细胞表面的胞膜糖蛋白和肿瘤细胞特异 性高表达的HER2分子，它们分别与鱼精蛋白形成的融合蛋白可以有效地将 siRNA特异性输送到相应的抗原阳性细胞。其中，由Fab抗体融合蛋白介导 的siRNA的输送效率约为40%，而单链抗体融合蛋白的输送效率为32%。
噬菌体抗体库技术是近年发展起来的一项分子生物学新技术。它是指利 用聚合酶链反应(PCR)扩增出抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示 技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)呈现在噬菌体的表面，经过"吸附-洗脱-扩增"过程筛选并富集特异性抗体。该技术为人源性抗体的制备提供了良好 的技术平台，并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一。目前，已 成功地从这种抗体库中筛选出针对多种抗原(如病毒和毒素等)的人源性抗 体分子。这些抗体分子对于感染性疾病以及肿瘤的诊断和治疗具有极为重要 的实验价值，也为新药的开发和疫苗的研制带来非常广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种将具有抗原识别功能的抗体与具有核酸结合 功能的鱼精蛋白或其截短体融合，构建成同时具有抗原和核酸结合活性的融 合蛋白，siRNA与这种融合蛋白结合后，可以在抗体的引导下被特异性地输 送到靶细胞，并随抗体内化入细胞浆，进入RNAi通路，从而实现对乾基因 的高效抑制。
我们构建了 一个人源性抗HBsAg的Fab段噬菌体抗体库，并从中筛选获 得了五株与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体，我们将其改造成单链抗体基因， 克隆入原核表达载体pET32a，在大肠杆菌中诱导表达后用Ni2+-NTA螯合层析
介质成功纯化了五株单链抗体，间接ELISA检测证实这五株单链抗体均具有 与HBsAg结合的活性，将它们与HBsAg阳性细胞孵育，经间接免疫荧光及共 聚焦显微镜分析发现其中一株单链抗体(ScFvl5)具有良好的内化活性，由 于抗体的内化活性对于siRNA或siRNA表达质粒的靶向输送非常关键，因此 我们选择该单链抗体作为siRNA或siRNA表达质粒输送的导向分子。有关 ScFvl5的基因序列可参考GenBank (包含轻链可变区和重链可变区序列的基 因登录号分别为U91942和AF455924 )。此外，我们已根据HBV的基因序列 选择了五个s iRNA干涉位点，构建了五种s iRNA表达质粒(pSUPER-HBVl ~ 5 ), 稳定转染表达HBV基因的HepG2.2.15细胞后，经比较分析，其中抑制效果最 明显的针对HBV X基因的siRNA序列(siRNA-H2)被选择用于进行靶向抑制 的研究。
本发明的内容包括由人抗HBsAg的单链抗体、人抗体轻链恒定区和鱼 精蛋白截短体的编码序列构成的人抗HBsAg单链抗体/人抗体轻链恒定区/鱼 精蛋白截短体重组基因ScFv-Ck-tP,其具有序列表〈400〉 1的序列。 上述基因编码的蛋白，其具有序列表〈400 > 2的序列。 上述重组基因在制备抗HBV感染及其相关疾病的治疗药物中的应用。 上述重组基因编码的蛋白在制备抗HBV感染及其相关疾病的治疗药物中 的应用。
本发明将能够特异性识别并结合HBV感染细胞表面HBsAg分子的单链抗 体ScFvl5基因与人鱼精蛋白截短体(truncated protamine, tP, 8-29位氨基 酸)的编码序列(基因序列可参考GenBank,登录号为BT006746 )连接，同 时，为了避免两个结构域之间空间结构的影响，又在两个基因之间插入了一 段人抗体轻链恒定区的编码序列(基因序列可参考GenBank,登录号为 U91942 ),构建成重组基因ScFv-Ck-tP，该基因编码的ScFv-Ck-tP融合蛋白 将同时具有抗原(HBsAg)结合活性和核酸结合活性，s iRNA或siRNA表达质 粒与该融合蛋白结合后，被靶向输送至HBV感染细胞，检测结果表明所获 得的ScFv-Ck-tP融合蛋白可以实现55。/。左右的siRNA输送效率，优于目前的
报道，提示我们所设计的融合蛋白结构合理，活性更强。同时，通过体内外 实验，我们证实由该蛋白靶向输送的针对HBV的siRNA或siRNA表达质粒能
够高效特异地抑制HBV的基因表达和复制。利用该融合蛋白可以在不损伤肝 细胞的情况下持续高效地抑制HBV的基因表达和复制，这一策略将为RNAi技 术用于乙型肝炎及其相关疾病的靶向治疗提供新的思路。
本发明所形成的siRM的靶向输送策略具有以下特点①特异性一一由 人抗HBsAg单链抗体、人抗体轻链恒定区和鱼精蛋白截短体构成的ScFv-Ck-tP 融合蛋白同时抗原结合活性和核酸结合活性，siRNA或siRNA表达质粒与之结 合后，被特异性地输送至HBV感染的靶细胞，而避免了对正常细胞的副作用。 ②高效性一一siRNA或siRNA表达质粒与ScFv-Ck-tP融合蛋白结合后，在抗 体的引导下到达靶部位，通过受体介导的内化途径进入细胞内吞体，并被释 放到细胞浆中，进入RNAi通路，从而高效的发挥抑制作用，由于有了抗体的 引导，在低浓度siRNA或siRNA表达质粒的情况下，也可以实现特异性输送。 另外，我们所构建的ScFv-Ck-tP融合蛋白对siRNA的靶向输送效率达到了 55%，优于目前报道的结果。③持续性一一ScFv-Ck-tP融合蛋白中tP带有正 电荷，与siRNA或siRNA表达质粒结合后可以保护它们避免被核酸酶降解，
从而提高它们的稳定性，延长了在血液循环系统中的存留时间，也就延长了 siRNA或siRNA表达质粒的干涉效果。④安全性一一由于构建的融合蛋白中的 抗HBsAg单链抗体、轻链恒定区及鱼精蛋白截短体均为人源性蛋白，不会引 起体内的强烈排异；由靶向输送的针对HBV的siRNA或siRNA表达质粒将在 不损伤肝细胞的情况下持续高效地抑制HBV的基因表达和复制，而并不引起 炎症反应，所以治疗的毒副作用较小。
本发明可望为HBV感染及相关疾病的靶向干涉提供一种新的手段。
图1为ScFv-tP和Ck基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。图中 1代表DL2000标记物；2、 3代表ScFv-tP基因PCR产物；4代表Ck的PCR产物。
图2为重组表达质粒pET28a/ScFv-tP和pET28a/ScFv-Ck-tP的酶切鉴 定结果图。
图3为ScFv ， ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的表达及纯化的SDS-PAGE 分析图。
图4为间接ELISA检测ScFv、 ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的抗原结
合活性分析结果图。
图5为间接免疫荧光检测ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的内化情况图 (x 400 )。
图6为共聚焦显微镜检测验证ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白与转铁蛋 白的共定位图(x 660 )。
图7为迁移阻滞实验检测ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白与质粒DNA 的结合图。
图8为迁移阻滞实验检测ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白与DNA片段的 结合图。
图9为流式细胞术检测ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白对siRNA的靶向
输送图。
图10为流式细胞术检测ScFv-Ck-tP融合蛋白对siRNA表达框或质粒的 靶向输送图。
图11为ScFv-Ck-tP输送的siRNA， siRNA表达框及siRNA表达质粒对 HepG2. 2. 15细胞分泌HBsAg的抑制作用图。
图12为ScFv-Ck-tP输送的siRNA, siRNA表达框及siRNA表达质粒对 H印G2. 2. 15细胞分泌HBeAg的抑制作用图。
图13为ScFv-Ck-tP输送的siRNA， siRNA表达框及siRNA表达质粒对 H印G2. 2. 15细胞上清中HBV DNA的抑制图。
图14为SDS-PAGE和Western blot检测证实ScFv-Ck-tP输送的siRNA, siRNA表达框及siRNA表达质粒对H印G2. 2. 15细胞中HBsAg表达的抑制图。
图15为肝肾组织切片的荧光显微镜观察ScFv-Ck-tP在体内对siRNA的 靶向输送图。
图16为Northern blot检测ScFv-Ck-tP输送的siRNA或siRNA表达质 粒对转基因小鼠肝脏组织内HBV mRNA水平的抑制图。
图17为ScFv-Ck-tP输送的siRNA或siRNA表达质粒抑制转基因小鼠血 清中HBsAg水平图。
图18为免疫组化染色检测ScFv-Ck-tP输送的siRNA或siRNA表达质粒 对转基因小鼠肝脏中HBsAg表达的抑制图。
图19为用ScFv-Ck-tP输送siRNA或siRNA表达质粒对转基因小鼠血清 中ALT水平的影响图。
具体实施例方式
1. ScFv-Ck-tP重组基因的构建、表达及表达产物的活性鉴定
本发明构建的ScFv-Ck-tP基因包括三个部分，分别为抗HBV感染细胞表
面HBsAg抗原的单链抗体(ScFv15)、人抗体轻链恒定区和具有核酸结合活性
的人鱼精蛋白截短体的编码序列。 (1)引物的设计与合成
根据已知的单链抗体ScFv 15的序列设计相应的PCR引物，引物序列为
SP5 : 5 , -TTTGAATTCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTC-3 ， ； SP3 : 5 ， —TGTCTC
TGGCGGTAATATCTGCTCCGGCTCTGGCTGCGCTCGAGTCGATTGATTTCCACCTTGG-3
SP3L : 5 ' -TTTGCGGCCGCGCTCCGCCTCCTTCGTCTGCGA
CTTCTTTGTCTCTGGCGGTAATATCTG-3，。在3，端引物中引入了人的鱼精蛋白截 短体的编码序列(即其中横线标出的部分)，同时在两端引物中分别引入&dl I与vVWl的酶切位点，在3，端引物中同时引入了一个的酶切位点(三 个酶切位点即其中框出的部分)，扩增后该位点位于单链抗体和鱼精蛋白截短 体的编码序列之间，以便于轻链恒定区序列的插入；扩增轻链恒定区的弓
序列为Ck5: 5 ' -TTTCTCGAGACTGTGGCTGCACCATCTGT-3 ' ， Ck3: 5 ，
-TTT|CTCGAG|TCTAGACTAACACTCTCC CCTGTTGA-3'，在两端引物中均引入J力o I
的酶切位点(即其中框出的部分)。 (2) ScFv-Ck-tP基因重组表达载体的构建及鉴定
在前期抗体库的构建所使用的质粒为pComb3H,我们以含有所选用Fab 抗体序列的质粒pComb3H-Fab15为模板，以Ck5和Ck3为引物扩增Ck片断， 克隆入pUC19质粒，并进行序列测定，测序正确的质粒命名为pUC19-Ck。以 质粒pEGFP-N3-ScFvl5为模板，以SP5和SP3为引物进行PCR扩增，再以纯 化的扩增片段为模板，以SP5和SP3L为引物进行PCR扩增，纯化第二轮扩增 产物，然后用I和#W I双酶切，连接入表达载体pET-28a中，并进行 酶切鉴定和序列测定。鉴定正确的质粒命名为pET28a/ScFv-tP,将pUC19-Ck 质粒用X力o I酶切后，电泳回收小片断并连入经Xho I酶切并纯化的
pET28a/ScFv-tP质粒，构建pET28a/ScFv-Ck-tP质粒，并进行酶切鉴定。 ScFv-tP基因及所编码的蛋白在实验中作为一种对照。附图1， 2提供了 ScFv-tP、 Ck的PCR扩增结果及pET28a/ScFv-tP和pET28a/ScFv-Ck-tP质粒 的酶切鉴定结果。
(3) ScFv-Ck-tP重组基因的诱导表达及纯化
将鉴定正确的重组质粒pET28a/ScFv 、 pET28a/ScFv-tP和 pET28a/ScFv-Ck-tP分别转化大肠杆菌BL21,挑取单克隆接种于含有卡那霉 素的LB培养基中，3rC过夜培养，次日以1 : 100接种，3rC培养至A副nm 达0. 6左右时，按照确定的最佳诱导条件(IPTG终浓度0. 1 m mol/L,诱导 时间为3h)进行诱导表达，并对表达产物加以纯化，纯化前后的蛋白样品 SDS-PAGE分析结果见附图3。
(4 ) ScFv-Ck-tP融合蛋白的抗原结合活性及内化活性分析
I. 间接ELISA检测抗原结合活性
用间接ELISA方法检测ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白的抗原结合活 性，用ScFvl5作为对照，结果提示随着稀释度的增加，ScFv-tP和ScFv-Ck-tP 融合蛋白与HBsAg抗原的结合降低，提示它们都具有HBsAg结合活性，且与 ScFv相比，ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白与HBsAg的结合活性无明显差别 (附图4)。提示Ck和tP的融合不影响ScFv的抗原结合活性。
II. 间接免疫荧光染色分析内化活性
将ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白分别与HBsAg阳性的H印G2. 2. 15细 胞或HBsAg阴性的HeLa细胞孵育后，进行间接免疫荧光染色，荧光显微镜观 察发现它们均可以内化入HBsAg阳性细胞，而都不能内化入HBsAg阴性的HeLa 细胞(附图5)。利用共聚焦显微镜进行共定位分析，发现ScFv-tP和 ScFv-Ck-tP融合蛋白均与Texas Red标记的转铁蛋白存在共定位现象，因此 ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白均保持了良好的内化活性，并且其内化是通 过网格蛋白介导的内吞途径实现的(附图6)。 (5 ) ScFv-Ck-tP融合蛋白的DNA结合活性检测
I.质粒的迁移阻滞实验
各取1 ju g质粒，分别与lmg,4iig，10pg纯化的ScFv-tP和ScFv-Ck-tP
融合蛋白于0. 2mol/L NaCl溶液中室温孵育30min后，进行1%琼脂糖凝胶电 泳分析发现ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白都可以抑制质粒DNA的迁移(附 图7)。
II. DNA片断的凝胶迁移阻滞实验
将10ng同位素标记的DNA探针分别与ljag, 4jig， 10 ju gScFv-tP或 ScFv-Ck-tP融合蛋白孵育后，非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分离后，制备干胶， 压X光片放射性自显影，结果提示ScFv-tP和ScFv-Ck-tP融合蛋白均可以 使DNA片段的迁移速度变慢，并且随着蛋白含量的增加，DNA片段的迁移明 显滞后，而单独用ScFv与DNA片段孵育却不影响DM片段的迁移(附图8 )。 这两项结果提示ScFv-Ck-tP融合蛋白都具有DNA结合活性，并且其结合 活性优于ScFv-tP。
2. 利用ScFv-Ck-tP融合蛋白可以在细胞水平实现siRNA的靶向输送 (1) ScFv-Ck-tP融合蛋白对siRNA的靶向输送
取5 jug FITC-siRNA分别与5jug纯化的ScFv-tP或ScFv-Ck-tP融合蛋白在 0. 2mol/L NaCl溶液中室温孵育30min后，加入六孔板中培养的HepG2. 2. 15或 HeLa细胞，24h后消化细胞，洗涤并固定后用流式细胞仪进行分析。结果发现 ScFv-Ck-tP融合蛋白可以能将FITC-siRNA特异性地携带入HepG2.2. 15细胞， 其FITC阳性细胞率分别达到55。/。，其输送效率比ScFv-tP (45%)更高一些(附
图9),因此被选择用于后续的靶向抑制实验。 (2 ) ScFv-Ck-tP融合蛋白对siRNA表达组件和质粒的乾向输送
取5 jug FITC-SECs或pEGFP-N3分别与5 |i g ScFv-Ck-tP融合蛋白在 0. 2mol/LNaCl溶液中室温孵育30min后，加入培养于六孔板中的HepG2. 2. 15 或HeLa细胞，24h后消化细胞用流式细胞仪进行分析。结果发现ScFv-Ck-tP 融合蛋白可以能将FITC-SECs或pEGFP-N3特异性地携带入H印G2. 2. 15细胞， 其FITC/EGFP阳性细胞率分别为38%和15°/。，但和FITC-siRNA相比， ScFv-Ck-tP融合蛋白对siRNA表达组件和质粒的输送效率相对较低(附图 10)。
3. ScFv-Ck-tP耙向输送的针对HBV的siRNA、 siRNA表达组件或siRNA表达质粒 可以高效抑制HepG2. 2. 15细胞中HBV的基因表达和复制
根据前期获得针对HBV的最佳干涉序列，化学合成针对该序列的siRNA (siRNA-H2),制备相应的siRNA表达组件(SECs-H2)，并利用前期所构建的针 对该序列的质粒pSUPER-H2，我们比较了利用ScFv-Ck-tP融合蛋白靶向输送针 对HBV的siRNA, siRNA表达组件及siRNA表达质粒对于H印G2. 2. 15细胞中HBV
基因表达和复制的抑制作用。 (1)对HepG2. 2. 15细胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制
分别用5 |ig ScFv-Ck-tP融合蛋白与5 jug siRNA-H2、 SECS-H2或pSUPER-H2 的混合物处理后第l、 2、 3、 4天收集HepG2. 2. 15细胞培养上清，检测HBsAg 和HBeAg的水平，结果发现HBsAg和HBeAg的分泌在处理后第l天就受到显著 抑制，其中，siRNA-H2组在前3天的抑制作用较好，但到第4天却是pSUPER-H2 和SECS-H2组抑制效果更好。提示siRNA的抑制效果出现较快，而siRNA表达 质粒和siRNA表达组件在后期却显示出比siRNA更强的抑制效果(附图ll, 12 )。
(2 )对HepG2. 2. 15细胞上清中HBV DNA的抑制
分别收集上述处理后第l、 2、 3、 4天的H印G2.2. 15细胞培养上清，检测HBV DNA含量，结果发现与未处理的对照组相比，三个实验组均检测到HBV DNA 拷贝数的下降，其中，siRNA的抑制作用出现较快，而siRNA表达质粒和siRNA 表达组件的抑制作用虽然早期不如s iRNA效果好，但它们的抑制作用更持续 (附图13)。
(3) SDS-PAGE和Western blot检测细胞内HBsAg的表达抑制
HepG2.2. 15细胞经过上述处理后第2天，收集细胞进行SDS-PAGE和 Western blot检测，SDS-PAGE结果显示三个处理组中HBsAg表达水平均明 显下降，而Western blot检测结果进一步证实了由输送的针对HBV的siRNA、 siRNA表达组件或siRNA表达质粒对HBsAg表达的抑制(附图14)。 4.利用ScFv-Ck-tP融合蛋白可以在体内实现siRNA的靶向输送
将40 ja g纯化的ScFv-Ck-tP融合蛋白与40 m g FITC-siRNA于生理盐水溶 液中混合，蛋白与siRNA的摩尔比约为l : 6,终体积确定为小鼠体重的1%，室 温孵育30min后，经尾静脉注入小鼠体内，24h后处死小鼠，取出各组织制作 冰冻切片，并置于荧光显微镜下直接观察。发现在给予ScFv-Ck-tP融合蛋
白与FITC-siRNA混合物的小鼠肝脏和肾脏内(HBsAg阳性)可观察到较强的绿
色荧光，而单独注射FITC-siRNA的对照组小鼠肝肾组织的荧光强度较弱(附
图15),提示ScFv-Ck-tP融合蛋白可以在体内实现siRNA的耙向输送。
5. ScFv-Ck-tP靶向输送的针对HBV的siRNA或siRNA表达质粒可以在体内持续
高效地抑制HBV的基因表达和复制
(1) 各治疗组的处理、取材及标本收集 将40jag纯化的ScFv-Ck-tP融合蛋白分别与40iig siRM-H2或pSUPER-H2
在生理盐水溶液中混合，蛋白与siRNA的摩尔比约为l : 6,终体积确定为小鼠 体重的1%,室温孵育30min后，经尾静脉注入小鼠体内，水压转染法单独注射 siRNA-H2或pSUPER-H2作为对照，另外，同时单独给予ScFv-Ck-tP融合蛋白作
为对照。
各组分别于注射后第l、 4、 7、 ll天选择两只小鼠通过眼球摘除术处死， 取血，静置20min后离心，取上清用于HBsAg或HBVDNA的测定。随后打开腹腔， 各取少量肝脏组织，留作RNA提取及Northern blot检测；另取各组织于4%多 聚甲醛中固定24h后，石蜡包埋，常规制片，做HE或免疫组织化学染色。
(2) 对HBV转基因小鼠体内HBV mRNA水平的抑制 取各组处理后第4天的肝脏组织，提取总RNA，进行Northern blot检测，
结果可见未处理组HBV的3. 5kb、 2. 4kb、 2. lkb转录产物条带清晰，而 siRNA-H2组、pSUPER-H2组及它们与ScFv-Ck-tP混合后处理组的相应条带明显 减弱，表明在这些处理组中HBV RNA得到有效降解，以siRNA-H2+ScFv-Ck-tP 组和pSUPER-H2组抑制效果尤其明显。而单独用ScFv-Ck-tP融合蛋白处理组的 mRNA水平与对照无明显差别(附图16)。
(3) 对HBV转基因小鼠血清中HBsAg水平的抑制
各组分别于处理后第l、 4、 7、 ll天选择两只小鼠处死，收集血清，测定 HBsAg水平,结果发现siRNA-H2组、pSUPER-H2组以及它们与ScFv-Ck-tP混 合后的处理组均检测到HBsAg水平的下降，其中以siRNA-H2+ScFv-Ck-tP组、 pSUPER-H2+ScFv-Ck-tP组和pSUPER-H2组效果更明显；siRNA-H2组早期的抑制 效果也很明显，但其抑制作用持续时间短；在ScFv-Ck-tP处理组也检测到 HBsAg水平的下降，这可能是通过抗体的中和作用实现的(附图17)。
(4) 对HBV转基因小鼠肝脏内HBsAg表达的抑制 各组分别于处理后第l、 4、 7、 ll天选择两只小鼠处死，取出肝脏组织，
福尔马林固定后，石蜡包埋，切片经脱蜡水化后进行免疫组织化学染色，结 果发现未处理组小鼠肝细胞浆内有大量棕褐色颗粒(HBsAg),而siRNA-H2 组、pSUPER-H2组及它们与ScFv-Ck-tP混合后的处理组的肝组织内棕褐色颗 粒明显减少减弱，其中以siRNA-H2+ScFv-Ck-tP组和pSUPER-H2+ScFv-Ck-tP 组效果更明显。ScFv-Ck-tP组的肝组织和对照差别不大，提示单独用 ScFv-Ck-tP处理不会抑制HBsAg的表达，附图18提供了处理后第7天的免 疫组化染色结果。
(5) 治疗对HBV转基因小鼠血清中ALT的影响 取各组不同时间点的小鼠血清，测定ALT水平发现和对照组相比，
siRNA-H2组、pSUPER-H2组治疗后血清ALT水平没有升高，用ScFv-Ck-tP及它 与siRNA-H2或pSUPER-H2的混合物治疗后第l， 4天ALT水平有轻微上升，但到 第7天基本恢复到正常水平(附图19)。说明体内应用ScFv-Ck-tP输送siRNA 或s iRNA表达质粒不会造成明显的肝脏损害。
序列表
<110>杨安钢
<120>人抗HBsAg单链抗体/人抗体轻链恒定区/鱼精蛋白截短体重组基 因、编码蛋白及应用
<160> 2
<210> 1 <211〉 1149 <212>腿
<213>人(homo sp.)
<220〉
<221> CDS
<222> (1)... (1149)
<400〉 1
atggaattcg aggtgcagct ggtggagtcg gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc60 ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca gctatgccatgagctgggtc120 cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcaggta taagtgctcg tggtggtagc180 acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct ccagagacaa ttccaagaac240 acgctgtatc tccaaatgaa cagcttgaga gccgaggaca cggccgtata ttactgtgcg300 aaagataggg gcaggatagc agcagctcac tttgactact ggggccaggg aaccctggtc360 accgtctcct caggtggagg cggUcaggc ggaggtggca gcggcggtgg cggatcggga420 attgtgttga cccagtctcc aggcaccctg tctttgtctt caggggaagg agccaccctc480 tcctgcaggg ccagtcagag tgttagcaac ggccaattaa cctggtacca gcagaagcct540 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccagca gggccactgg catcccagac600
aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac Ucactctca ccatcagcag actggagcct660 gaagattttg cagtgtatU ctgtcaccag tatgatggct ccccggagac gttcggccaa720 gggaccaagg tggaaatcaa tcgactcgag actgtggctg caccatctgt cttcatcttc780 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac840 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac则 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc960 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat1020 cagggcctga gatcgcccgt cacaaagagc Ucaacaggg gagagtgttc tagactcgag1080 cgcagccaga gccggagcag atattaccgc cagagacaaa gaagtcgcag acgaaggagg1140 cggagctga1149
<210〉 2 <211> 382 <212> PRT
<213>人(homo sp.) <400> 2
Met Glu Phe Glu Val Gin Leu Val
1 5 Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
20
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
35
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly
50
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
65
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
80
15
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
10 15 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
25 30 Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly
40 45 lie Ser Ala Arg Gly Gly Ser
55 60 Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg
70 75 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Trp
lie Ala Ala Ala
Thr Val Ser Ser
Phe
Gly
Gly Gly Gly Ser Gly lie Val Leu Thr Gin Ser
Ser Leu Ser Ser Gly Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
Gin Ser Val Ser Asn Gly Gin Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys
Ala Lys Val Gin
Ala 95 His 110 Gly 125 Gly 140 Gly 155 Asn 170 Arg 185 Asp 200 lie 215 Gin 230 Glu 245 Phe 260 Val 275
Trp Lys 290
Asp Tyr Gly Gly
Ser
Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie Tyr Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser Gly
Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala
Tyr Tyr Cys His Gin Tyr Asp Gly Ser Pro Glu Thr Phe Gly
Gly Thr Lys Val Glu lie Asn Arg Leu Glu Thr Val Ala Ala
Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
Ala 100 Gly 115 Gly 130 Gin 145 Leu 160 Trp 175 Gly 190 Ser 205 Pro 220 Pro 235 Glu 250 Glu 265 Asn 280 Ala 295
Lys
Gin
Gly
Asp Arg Gly Thr Gly Gly Pro Gly
Gly
Leu
Ser
Thr
Ala Ser Ser Arg
Gly Ser Gly Thr
Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly
Arg 105 Val 120 Gly 135 Leu 150 Ser 165 Pro 180 Ala 195 Asp 210 Val 225 Gin 240 Pro 255 Gly 270 Glu 285 Asn 300 Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
305 310 315
Ser Eeu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
320 325 330
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Arg Ser
335 340 345
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ser Arg Leu Glu
350 355 360
Arg Ser Gin Ser Arg Ser Arg Tyr Tyr Arg Gin Arg Gin Arg Ser
365 370 375
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ser
380 38权利要求
1、由人抗HBsAg的单链抗体、人抗体轻链恒定区和鱼精蛋白截短体的编码序列构成的人抗HBsAg单链抗体/人抗体轻链恒定区/鱼精蛋白截短体重组基因ScFv-Ck-tP，其具有序列表<400>1的序列。
2、 由权利要求1的基因编码的蛋白，其具有序列表〈400〉 2的序列。
3、 如权利要求1所述的基因在制备抗HBV感染及其相关疾病的治疗药物中的应用。
4、 如权利要求2所述的蛋白在制备抗HBV感染及其相关疾病的治疗药物 中的应用。
全文摘要
本发明提供一种人抗HBsAg单链抗体/人抗体轻链恒定区/鱼精蛋白截短体重组基因、编码蛋白及应用，该蛋白同时具有抗原结合活性和核酸结合活性，体内外实验都证实针对HBV的siRNA或siRNA表达质粒与之结合后，可以被特异性地输送到HBV感染细胞，并且在不损伤肝细胞的情况下持续高效地抑制HBV的基因表达和复制。本发明中由ScFv-Ck-tP融合蛋白实现的siRNA或siRNA表达质粒的靶向输送具有以下特点高度的特异性、高效性、持续性和安全性，本发明可为RNAi用于HBV感染及其相关疾病的靶向治疗提供一种新手段。
文档编号A61P1/16GK101100671SQ200710018088
公开日2008年1月9日 申请日期2007年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者刘家云, 孟艳玲, 杨安钢, 温伟红, 涛 王, 许彦鸣, 贾林涛, 晶 赵 申请人:杨安钢