专利名称：抗人端粒酶逆转录酶单链抗体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种用于抑制肿瘤细胞分裂生长，诱导 肿瘤细胞凋亡的基因工程单链抗体。
背景技术：
端粒、端粒酶与肿瘤的关系是近年来受到国际医学界高度重视的研究热点。肿瘤细胞 尤其是恶性肿瘤细胞常常因为获得永生性而具有了无限增殖能力，而肿瘤细胞无限增殖能 力的维持则依赖于端粒酶的活性。大量研究表明，各类恶性肿瘤中几乎都有端粒酶的异常
高表达(KimNW, 1994)。人端粒酶是由RNA和蛋白质组成，其中人类端粒酶逆转录酶 (human telomerase reverse transcriptase, hTERT)是端粒酶的催化活性亚单位(TakayaraJ， 1998; KanayaT， 1998; TakayaraM， 1998)。已发现大约85%的人类恶性肿瘤具有hTERT 的高表达，所以抑制人端粒酶端粒酶逆转录酶的活性为抗肿瘤药物的设计提供了新的目 标。
单链抗体(single chain Fv， ScFv)是一个重要的基因工程抗体，是在DNA水平上利用 基因工程方法使抗体重链可变区(VH)基因和轻链可变区(VL)基因通过一段约5 25个 氨基酸寡核苷酸(linker)的连接肽， 一般为(Gly4Ser) 4，首尾拼接而形成的重组蛋白。 具有(1)制备方法简单，成本低；(2)免疫原性弱；(3)能均匀分布于肿瘤且与抗原 结合特异性强；(4)体内周转快；(5)易于进一步进行基因工程改造等特点，因此它的 应用领域相当广泛，尤其在肿瘤人工免疫治疗方面。ScFv基因转染细胞表达的细胞内抗体 是继反义核酸、核酶和显性负突变技术后又一巧妙的基因治疗策略，同时又是用于表型敲 除研究的又一有力工具，可作用于各种靶分子。将含抗癌相关蛋白的抗体基因转染细胞,细 胞表达的scFv与癌相关蛋白作用，可能间接抑制肿瘤的生长。目前这方面的研究主要集中 在肿瘤细胞高表达的某些蛋白及与肿瘤细胞耐药、侵袭和转移等相关的蛋白上。人端粒酶 逆转录酶的表达和激活在调节细胞生长和分化中起重要作用,因此他们也就成为抗癌治疗 的新的耙标。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因，将该抗体的编码基因导 入到肿瘤细胞内部进行表达。体内表达的抗体分子与相应的催化亚基特异性结合，可阻断 端粒酶装配，封闭肿瘤细胞中端粒酶逆转录酶的活性，从而抑制肿瘤细胞生长分裂，诱导 其凋亡。
本发明的内容包括利用生物工程技术，提供编码抗hTERT-scFv基因和由此推断的 氨基酸序列；提供含有所述的抗hTERT-scFv基因的表达质粒和利用该质粒转化的工程菌； 同时提供从所述工程菌制备重组抗hTERT-scFv的方法，以及将抗hTERT-scFv基因作为治 疗对人端粒酶逆转录酶阳性肿瘤药物制剂应用。
本发明提出的重组抗hTERT-scFv基因，是由连接抗体的Vl和基因VH，建立一个抗 hTERT-scFv基因，该基因由738个碱基对组成。这种scFv的核苷酸序列为SEQ.ID.No.l 。 本发明的具体过程如下
1、 从稳定分泌人端粒酶逆转录酶单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、纯化mRNA。体外 反转录cDNA。
2、 克隆轻链可变区基因，连入pGEM-T载体(Promega)，进行序列分析，经同源对 比分析，证实该基因片段为抗体轻链可变区基因，序列为SEQ.ID.N03。
3、 克隆重链可变区基因，连入pGEM-T载体，进行序列分析，经同源对比分析，证 实该基因片段为抗体重链可变区基因，序列为SEQ. ID. N04。
4、 连接抗体轻链，重链基因，以编码(Gly4Ser) 4的连接DNA序列，连接抗体轻、 重链可变区，构建抗hTERT-scFv基因，序列为SEQ. ID. NOl。
将上述scFv基因克隆到商业化的pET28a表达载体(Novagen)上，转化BL21宿主大肠 杆菌，获得的转化菌株为工程菌株Rosetta/hTERT-scFv。
培养该工程菌株，经IPTG诱导表达3-4小时，利用该单链抗体上融合的6个组氨酸 标签，对其进行Ni柱亲和层析纯化，咪唑浓度梯度洗脱，得到本发明的分子量为30KD的 单链抗体蛋白，其序列为SEQ. ID. N02 。
TRAP-ELISA方法在体外检测纯化的hTERT单链抗体蛋白对HeLa细胞中内源端粒酶 逆转录酶活性的影响。
将上述scFv基因克隆到真核表达载体pEGFP-Cl(Clontech)上，构建可以用于肿瘤基因 治疗的细胞内抗体表达质粒pEGFP-Cl-scFv。
pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl质粒分别瞬时转染HeLa细胞，转染后三天内，每隔12 小时用PI染色法测定细胞周期分布及细胞凋亡。
图1为抗hTERT-scFv基因工程菌表达分析图。
其中1为pET28a/Rosetta诱导表达产物，2为pET28a-scFv/Rosetta基因工程菌表达 产物，3为纯化得到的hTERT-scFv蛋白，分子量为30KD。 图2为抗hTERT-scFv对端粒酶活性的抑制反应柱形图。
其中左侧为添加不相关蛋白的对照反应体系端粒酶活性，右侧为加hTERT-scFv后反 应体系中的端粒酶活性，可以看到纯化的hTERT-scFv对HeLa细胞端粒酶活性的抑制作用 可以达到42.6%。该图代表三次独立实验的结果，数据经t检测，"代表p〈0.001。
图3为真核表达scFv基因后MTT法测定细胞活力的柱形图。
分别转染pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl质粒后每个不同的时间点(24h, 36h, 48h, 60h， 72h和84h)的HeLa细胞，用MTT法染色后，酶标仪测定0057()，与本底值比较，得相对 细胞活力。该图代表三次独立实验的结果，数据经t检测，Mt表p〈0.01，"代表p〈0.001。
图4为真核表达scFv基因后PI染色法测定细胞周期的柱形图。
分别转染pEGFP-Cl-scFv和pEGFP-Cl质粒后每个不同的时间点(24h, 36h, 48h, 60h, 72h和84h)的HeLa细胞，用PI染色后，流式细胞术测定处于各细胞周期的细胞所占的百 分率。该图代表三次独立实验的结果，数据经t检测，Mt表p〈0.01，"代表p〈0.001。
具体实施方式
实施例1:
1、 细胞培养及鉴定将分泌hTERT单克隆抗体的杂交瘤细胞培养于含10。/。小牛血清 的完全RPMI1640培养基中。培养箱含5%C02的混合气体，湿度为98%。用ELISA方法 鉴定培养上清中单抗的特异性和滴度。
2、 抗hTERT单克隆抗体轻链、重链可变区基因的克隆取生长良好杂交瘤细胞株， 用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，用PCR技术，在反应体系中加入cDNA和 一套抗体轻链或重链可变区引物，10XPCR反应缓冲液，终浓度为2.5mM的dNTP， 1 u L7k DNA聚合酶，总反应体系为50yL。进行30个循环反应，每个循环的条件是94'C变 性30秒，55'C退火30秒，72'C延伸1分钟，最后一个循环结束后72'C保温10分钟。胶 回收轻链和重链可变区基因扩增产物后连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌保存阳性克隆。
轻链、重链可变区基因的筛选将轻链、重链可变区基因连入pGEM-T载体转化大肠 杆菌DH5 a ， PCR验证转化子。DNA测序分析hTERT抗体重链可变区是由351个核苷酸 组成，其基因序列为SEQ.ID.No.3。轻链可变区是由325个核苷酸组成，其基因序列为 SEQ.ID.No.4。
3、 hTERT-ScFv的构建PCR分别在重链、轻链可变区片段两端引入限制性内切酶 位点BawHI ， H/"dlI和编码(Gly4Ser)4的连接DNA序列。回收纯化后，再OVERLAP PCR 将重链和轻链可变区连接成端粒酶ScFv基因片段，割胶回收，用^/wHI和iVa I双酶切 消化，割胶回收，连入预先切好的pET28a表达载体，转化入大肠杆菌DH5a扩增，PCR 和限制性内切酶验证转化子。序列分析证明构建的单链抗体具有hTERT抗体的轻、重链可
变区以及(Gly4Ser) 4的连接肽，由738个核苷酸组成其基因序列为SEQ.ID.No.1。
4、 单链抗体基因的表达随机选取阳性克隆进行小量表达筛选，挑单菌接种于 Kan+Cm+LB培养液中，pET28a/Rosetta为负对照，37'C摇床过夜，第二天按ly。接种于2mL 新鲜培养液中，37'C培养2-3h，吸出lmL未诱导菌液，置于1.5mL离心管中，余下菌液 加入IPTG至终浓度为lmM， 37。C培养3-4h。超声裂解菌体蛋白，ELISA方法挑选与抗原 结合活性最高的阳性克隆，大量表达(图l)。
5、 单链抗体蛋白的纯化利用该单链抗体上融合的6个组氨酸标签，对其进行Ni柱 亲和层析纯化，咪唑浓度梯度(20到100mM)洗脱得到分子量为30KD的单链抗体蛋白
(图1 )。从DNA序列推导hTERT-scFv是由244个氨基酸组成，其序列为SEQ.ID.No.2。
6、 单链抗体蛋白对hTERT活性抑制的检测依照TRAP-ELISA端粒酶活性检测试剂 盒说明书操作，收集2Xl(^体外培养的人宫颈癌HeLa细胞，裂解缓冲液抽提蛋白，以蛋 白裂解液为模板，并在反应体系中添加纯化的单链抗体蛋白，以添加无关单链抗体蛋白的 反应作为负对照，以未添加单链抗体的HeLa细胞裂解液中的端粒酶逆转录酶活力为100%。 该反应液在25"C孵育30分钟后作为模板迸行PCR，迸行35个循环反应，每个循环的条件 是94'C30秒，59X:60秒。检测到该纯化的单链抗体对端粒酶活性有42.6%的抑制活性， 实验重复三次后取平均数土S.D (图2)。
本发明构建的抗hTERT单链抗体具有两个抗原结合臂，可以有效地和靶抗原结合。单 链抗体分子量只相当于完整抗体的1/6，在临床应用上比完整抗体优越免疫原性弱，对 实体瘤渗透能力强，可以用基因工程手段发酵生产。与传统的单克隆抗体药物相比，其可 以惊醒大规模细菌发酵生产，且价格低廉，易于普及应用，是一种极具应用潜力的抗体形 式。
实施例2:
1、 hTERT-scFv真核表达载体的构建设计引物，使用PCR方法在hTERT-scFv基因 的两端引入H/wcffll和Ba附HI酶切位点。在反应体系中加入模版和引物，10XPCR反应缓冲 液，终浓度为2. 5mM的dNTP， 1 u LT^DNA聚合酶，总反应体系为50 u L。进行30个循环 反应，每个循环的条件是94'C变性30秒，6CTC退火30秒，72'C延伸1分钟，最后一个 循环结束后72"C保温10分钟。用^wtHI和脸oI双酶切消化，割胶回收，连入预先切好 的pEGFP-Cl真核表达载体，转化入大肠杆菌DH5a扩增，PCR和限制性内切酶验证转化 子。序列分析验证阳性克隆。
2、 本发明依照产品说明书，使用LipofectAMINETM2000脂质体(Invitrogen)进行转 染，转染后24-84小时，进行细胞生长效应测定。以每孔5X1()S个细胞的密度接种6孔板，
在铺板率达到90%时，将2.5^il脂质体和3吗质粒分别溶解于250 plOPTI-MEM，室温静 止5分钟后，将脂质体和质粒均匀混合，室温静止25分钟。在6孔板中加入1.5mL无血 清培养基后，加入转染混合液，孵育5小时后，更换新鲜完全培养基。实验组质粒为 pEGFP-Cl-scFv，对照组为载体质粒pEGFP-Cl 。
3、 MTT法检测细胞存活率转染24小时后每个不同的时间点((24h, 36h, 48h， 60h, 72h 和84h)，对照组和实验组细胞分别用胰酶消化，调整密度为1X10V孔接种96孔板，24小 时后加入MTT， MTT用PBS缓冲液配成5mg/mL溶液，每孔加10uL，孵育3小时，使 MTT还原为甲月替。吸出上清液，加入100uL的酸化异丙醇溶解甲月替。酶标仪(Bio-Rad) 检测570nm波长处吸光值OD57Q。将各测试孔的OD值减去本底OD值(完全培养基加 MTT，无细胞)，各重复孔的OD值取平均数，细胞的存活率- (实验组细胞OD/对照组细 胞OD) X100% (图3)。
4、 PI染色法检测细胞周期转染24小时后每个不同的时间点(24h, 36h, 48h, 60h, 72h 和84h)，分别收集6孔板中对照组和实验组细胞(包括已经漂浮的细胞)，PBS洗涤后，于 70%的乙醇中，4。C固定过夜，1000rpm离心10分钟后，加入RNase A (10昭/mL)和PI (50吗/mL)， 37。C反应15分钟，流式细胞术分析细胞周期(图4)。
本发明以人端粒酶逆转录酶为靶点，结合基因工程技术，构建了具有分子量小，实体 组织穿透力强，免疫原性低等优点的单链抗体，该抗体被证明有很好的抗原结合力。且由 于该单链抗体可以有效地与端粒酶的催化亚基结合从而显著降低了端粒酶活性。在基于抗 人端粒酶逆转录酶单链抗体基因的基因治疗中，我们也观测到了该胞内抗体的表达对细胞 生长和周期显著的阻碍作用。因此，本发明有可作为一种新型的抗肿瘤制剂；且由于该基 因工程抗体制备工艺简单，成本低廉，所以有巨大的市场潜力。
序列表样例
<no〉复旦大学
<120>抗人端粒酶逆转录酶单链抗体
<160/ 2 〈170〉 <21()〉 1 <211> 738 <212> DNA
〈213〉大肠杆菌种65"sc力eri'c/n'a coU
<220〉 <400> 1<formula>formula see original document page 8</formula>
<213〉大肠杆菌种65"sc力en'c/n'a coh'J
<221〉 V—segment
<222〉 (l)... (116)
<223〉抗端粒,抗体重链可变区
〈220>
《221〉 V—segment
〈222〉 (137)... (244)
<223>抗端粒酶抗体轻链可变区
《22()>
<221〉 N_segment <222> (117)... (236)
<223〉连接抗端粒酶抗体轻茧链可变区的连接肽 "0()> 2
ttg cag ctg cag gag tct ggt gga gga ttg gtg cag cct咖ggg tea ttg咖etc tea 60 Leu Gin U'u (Uri Glu Ser Gly Gly Giy Lt，u Val Gin P—ro Lys (;iy Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 20
tgt gca gcc tct gga ttc a.cc etc aat acc tac gcc. atg aac tgg gtc cgc ca.g get cca 120 Cys Ala A:l.a Ser Gly Phe Thr Leu Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg (;lri Ala Pro 25 30 35 40
gga aag ggt ttg gaa tgg an act cgc ata柳agt. aaa agt aat aat ttt gca. aca tat 180 Gb' Lys Gl、v Leu Gl.u Trp lie Thr Arg He Arg Ser Lys Ser Asn Asri Phe Ala Thr Tyr 45 50 55 60
tat, gcc gat tea gtg aaa gac agg etc acc ate tec aga gat gat tea caa. aac atg etc 240 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Leu Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Gin A幼Met Leu 65 70 75 80
tat etc cfia a.tg acc aac ttg a幼act ga.g gac Tyr Leu Gin Met Thr Asn Leu Lys Thr Ghi Asp 85 90 95 100
aca gcc acg tat tac tgt gtg a.gc ggc 300 Thr Ala Th'r Tyr Tyr Cys Val Ser Glytat get ttg gac tac tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tec tea ggt gga ggc ggt 360
Tyr A:la Leu Asp Tyr T:rp Gly G:l.n G:l.y Thr Thr Val Th:r V'a.Ser Ser Gly Gly Gly G:[y 105 110 115 120
tea ggc gga ggt ggc tct ggc ggt gga ggt teg ggt gga ggc ggt teg gac a.tt gtg atg 420
Ser Gly Gly Gly Gl.y Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gl.y Gl.y Gly Gly Ser Asp ]:le Va.l Met 125 130 135 140
acc cag tct cca. get, tec tta. get gta tct ctg ggg cag agg gec acc ate tea. tgc agg 480
Thr (;ln Ser l:)e() Ala. Ser Leu A:l.a. Va.Ser Leu (;:l.y Gin Arg Ala. Th:r :[le Se:r Cys Arg 145 150 155 160
gec age aaa a.gt gtc a,gt a.ca tct. ggc t.at. agt tat atg cac tgg a.ac caa c邻a.aa cca 540
Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gl.y Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gin Gin Lys Pro 165 170 175 180
gga cag cca ccc aga etc etc ate tat ctt gta. tec aac eta gaa tct ggg gtc cct gec 600
Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu lie Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 185 190 195 200
agg tt.c agt ggc a.gt ggg u't ggg a('.a gac ttc acc etc aac ate cat cct gtg ga名gag 660
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu 205 210 215 220
gag gat, get gca acc tat ta.(: tgt: (:ag (:ac a", agg gag ctt: aca cgt teg gag ggg gga 720
Glu As!) Ala Ala Thr Tyr Tyr Cy's Gin His lie Arg Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly
225 230 235 240 cca age 't.gg a.aa Pro Ser Trp Lys <210> 3 <211〉 351 <212〉 DNA
<213〉大肠杆菌种(^sc力e/7'c/w'a coh'J
<220〉
732
<40()> 3
atgUgcagc tgca卿gtc tggtggagga Uggtgcagc ctaaagggtc
tcatgtgcag cct.ctggatt c.accctcat]t acctac.gcca tgaactgggt
cc邓gafmgg gttt.gg肌tg gattactcgc ataag肌gta腦igtaatafi
tattatgccg iattxagtgaa agacaggctc accatctcca gagatgattc
ctcta.tctcc eiaatga,ccaa cttgaaaact, g邓ga,caca.g ccacgtatta ggctatgctt tggactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc a <210〉 4
〈211 〉 325
<212、跳
<213>大肠杆菌种(r&r力er/c力is co7/J
<220>
〈■400/ 4
ggacattgtg atgacccagt ct，ccagcttc cttagctgta tctctggggc catctcatgc agggccagca aaagtgtcag tacatc.tggc tatagttata ccaacagaaa ccaggacagc cacccagact cctcatctat cttgtatcca tggggtccct gcc鄉t，tca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcaccc tcctgtggag gaggaggatg ctgcaaccta ttactgtcag caca.ttaggg
ccgccaggct :120
ttttgcaaca 180
acaaaacatg 240
ctgtgtgagc 300 351
aga,gggccac 60 tgcactggaa 120 accteigtiatc 180 tcaacatcca 240 agcttac(icg 300
ttcggagggg ggaccaagct ggaaatga 32权利要求
1、一种抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因，该单链抗体基因是由738个核苷酸组成，其序列为SEQ.ID.No.1。
2、 一种抗人端粒酶逆转录酶单链抗体蛋白，由244个氨基酸组成，其序列为 SEQ. ID. No. 2。
3、 一种如权利要求1所述的单链抗体作为治疗端粒酶逆转录酶阳性肿瘤的药物制剂 的应用。
4、 一种如权利要求1所述的抗人端粒酶逆转录酶单链抗体基因的制备方法，其特征 在于具体步骤如下(1) 从稳定分泌人端粒酶逆转录酶单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取、纯化mRNA，体外 反转录cDNA;(2) 克隆轻链可变区基因，连入pGEM-T载体，进行序列分析，经同源对比分析，证实 该基因片段为抗体轻链可变区基因，序列为SEQ. ID.N03;(3) 克隆重链可变区基因，连入pGEM-T载体，进行序列分析，经同源对比分析，证实 该基因片段为抗体重链可变区基因，序列为SEQ. ID. N04;(4) 连接抗体轻链，重链基因，以编码(Gly4Ser) 4的连接DNA序列，连接抗体轻、 重链可变区，构建抗hTERT-scFv基因，序列为SEQ. ID. N01 。
全文摘要
本发明属基因工程抗体技术领域，具体涉及一种功能性表达纯化的新的多肽——抗端粒酶逆转录酶单链抗体(ScFv)，以及此多肽基因作为肿瘤基因治疗制剂的应用。该基因工程抗体是由一条连接肽将天然抗体轻链和重链可变区首尾相接的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键形成具有抗原结合功能的片段，具有亲本抗体结合抗原的特性和功能，该抗体可以与肿瘤细胞里广泛而特异性表达的人端粒酶逆转录酶结合并使其失去原有活性，从而影响肿瘤细胞活力，以及细胞周期的分布，并明显地诱导了肿瘤细胞的程序性死亡。且该ScFv分子量小，仅为完整抗体分子的1/6，易穿入固体组织及肿瘤内部，是具有应用价值的肿瘤基因治疗制剂。
文档编号C07K16/40GK101104854SQ200710038640
公开日2008年1月16日 申请日期2007年3月29日 优先权日2007年3月29日
发明者任大明, 朱向莹, 陈丽珊 申请人:复旦大学