脑炎病毒基因修饰系统的构建及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了脑炎病毒基因修饰系统的构建及其应用。本发明提供了一种脑炎病毒突变株，是将野生型脑炎病毒基因组RNA中编码E1蛋白的第253位氨基酸Phe的密码子替换为编码氨基酸Ser的密码子，且将编码PE2蛋白中RKRR四肽的核苷酸序列缺失后得到的重组病毒。实验证明，本发明以痘苗病毒载体为基础，建立了脑炎病毒的反向遗传学技术平台，构建得到了脑炎病毒突变株，该突变株是很好的疫苗候选株。同时本发明对于从分子、细胞和动物三级水平开展脑炎病毒致病机理的研究，具有重要意义。
【专利说明】脑炎病毒基因修饰系统的构建及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脑炎病毒(Encephalitis Virus，EV)基因修饰系统的建立及其突变株应用，特别涉及一种在野生型脑炎病毒XJ-90260株基础上进行突变后得到的脑炎病
毒突变株。
【背景技术】
[0002]脑炎病毒XJ-90260株属于披膜病毒科甲病毒属成员。病毒颗粒一般呈球形,直径60-70nm,具囊膜和微细纤突，核酸为单股正链RNA。该病毒可通过蚊虫叮咬，导致动物和人间疫情的暴发，既是典型的虫媒传染病病毒，也是传统的人兽共患病病毒。感染者大多呈流感样症状，但也有出现严重神经症状的患者，特别是在儿童，该病有较高的死亡率，给家庭和社会均造成沉重的负担。
[0003]目前，尚未有利用痘苗病毒载体基因修饰技术开展脑炎病毒相关研究的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种脑炎病毒突变株及其应用。
[0005]本发明所提供的脑炎病毒突变株，是将野生型脑炎病毒基因组RNA中编码El蛋白的第253位氨基酸Phe的密码子替换为编码氨基酸Ser的密码子，且将编码PE2蛋白中RKRR四肽的核苷酸序列缺失后得到的重组病毒。
[0006]在本发明中，所述编码氨基酸Ser的密码子具体为AGC。
[0007]在本发明中，所述野生型脑炎病毒具体为脑炎病毒XJ90260株。
[0008]所述脑炎病毒XJ90260株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列3第45-11489位。
[0009]在本发明中，所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列具体为序列表中序列2的第45-11477位，即为将所述脑炎病毒XJ90260株的基因组cDNA序列(序列3的第45-11489位)的第10757-10759位的TTT (对应序列3的第10801-10803位)突变为AGC(对应序列2的第10789-10791位)，且将第8552-8563位(对应序列3的第8596-8607位)缺失后得到的核苷酸序列。
[0010]本发明的另一个目的是提供一种制备所述脑炎病毒突变株的方法。
[0011]本发明所提供的制备所述脑炎病毒突变株的方法，具体可包括如下步骤:
[0012](a)将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
[0013]所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列I中；
[0014](b)用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；
[0015]Ce)将步骤(a)中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸片段A为含有所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段；
[0016](d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(C)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；
[0017](e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述脑炎病毒突变株。[0018]在上述方法中，所述野生型痘苗病毒具体可为野生型痘苗病毒WR株。
[0019]进一步，所述野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列为GenBank号为NC_006998.1 的序列。
[0020]在上述方法的步骤(a)中，所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为 GenBank 号为 NC_006998.1 的序列(Up date:2012-11-22)的第 80267-80725位和第80726-81194位(对应序列I的第1-459位和第460-928位)的序列。
[0021 ] 在上述方法中，在所述核苷酸片段A中，在所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列如，含有T7启动子相关序列；所述T7启动子相关序列具体可为序列表中序列2 (或序列3)的第10-44位。
[0022]进一步，所述核苷酸片段A的序列具体为序列表中序列2的第10-11534位。
[0023]在本发明的一个实施例中，制备所述脑炎病毒突变株的方法具体包括如下步骤:
[0024](a)将GenBank号为NC_006998.1的野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列(Update:2012-11-22)的第80267-80725位(对应序列I的第1-459位，命名为上游同源臂)和第80726-81194位(对应序列I的第460-928位，命名为下游同源臂)分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游(如酶切位点Sal I和Pst I之间)和下游(如酶切位点Not I和Sac II之间)，得到重组质粒，将其命名为pGPT-1n ；
[0025](b)用所述野生型痘苗病毒WR株感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒pGPT-1n转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒WR株与所述重组质粒pGPT_in通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获得以所述gpt基因插入到所述野生型痘苗病毒WR株中的GenBank号为NC_006998.1的序列的第80725位和第80726位(对应序列I的第459位和第460位)之间后得到的重组痘苗病毒载体，将其命名为V.V.-GPT-1n ；
[0026](c)将步骤(a)中的所述重组质粒pGPT-1n中的所述gpt基因替换为含有所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段(序列2的第10-11534位)，得到重组质粒，分别将其命名为pGPT-out-mut ；
[0027](d)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体V.V.-GPT-1n感染新的CV-1细胞后，用步骤(c)获得的重组质粒pGPT-out-mut,转染所述新的CV-1细胞,所述重组痘苗病毒载体V.V.-GPT-1n与所述重组质粒pGPT-out-mut通过所述上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阴性筛选标记，获得以含有所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段(序列2的第10-11534位)替代所述重组痘苗病毒载体V.V.-GPT-1n中所述gpt基因的重组豆苗病毒载体，分别将其命名为V.V.-EV-mut ；
[0028](e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体V.V.-EV-mut的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体V.V.-EV-mut的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA分别转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述脑炎病毒突变株(EV-mut突变株)。
[0029]在上述方法的步骤(e)中，所述培养转染后的细胞，具体为将所述转染后的细胞(BHK-21)与VeiO细胞按照1:4的比例混合培养。之后，待细胞出现病变后，收集细胞培养物，感染新的Vero细胞，进而获得所述脑炎病毒突变株(EV-mut突变株)。
[0030]当然，在所述制备所述脑炎病毒突变株(EV-mut突变株)的方法的基础上，将所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列替换为野生型脑炎病毒(如脑炎病毒XJ-90260株)基因组RNA反转录的cDNA序列，由此形成的脑炎病毒的拯救方法也属于本发明的保护范围。
[0031 ] 本发明的再一个目的是提供一种蛋白质。
[0032]本发明所提供的蛋白质为所述脑炎病毒突变株(EV-mut突变株)基因组编码的蛋白质。
[0033]编码所述蛋白 质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0034]所述核酸分子具体可为如下I) -3)中任一 DNA分子:
[0035]I)序列表中序列2的第89-11357位核苷酸所示的DNA分子；
[0036]2)序列表中序列2的第10-11534位核苷酸所示的DNA分子；
[0037]3)序列表中序列2所示的DNA分子。
[0038]其中，序列2的第89-7482位为非结构基因编码区，第7606-11357位为结构基因
编码区。
[0039]所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子在制备抗病毒疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。
[0040]所述抗病毒疫苗具体为抗脑炎病毒疫苗，如抗脑炎病毒XJ90260株的疫苗。
[0041]本发明的又一个目的是提供如下(bl)_ (b3)任一中的生物材料:
[0042](bl)含有所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的离体动物细胞或
重组菌；
[0043](b2)含有所述脑炎病毒突变株的基因组RNA或cDNA的载体；
[0044](b3)活性成分为权利要求1-8中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的抗病毒(如脑炎病毒，具体如脑炎病毒XJ90260株)疫苗。
[0045]实验证明，本发明以痘苗病毒载体为基础，建立了脑炎病毒病毒的反向遗传学技术平台，构建得到了脑炎病毒突变株，该突变株是很好的疫苗候选株。同时本发明对于从分子、细胞和动物三级水平开展脑炎病毒致病机理的研究，具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0046]图1为痘苗病毒TK基因上下游同源序列的PCR扩增结果。其中，I为上游同源片段(L) ；2 为下游同源片段(R) ;3 为 DNA Markers (DL2000)。[0047]图2为脑炎病毒基因组全长cDNA扩增结果。其中，I为脑炎病毒XJ-90260株基因组全长cDNA扩增片段；2和4为DNA Marker (由大到小依次为2000bp、1000bp、7500bp、500bp、250bp、100bp) ；3为脑炎病毒突变株的基因组全长cDNA扩增片段。
[0048]图3为重组痘苗病毒V.V.-GPT-1n的PCR检测结果。其中，1，2样品的模板为痘苗病毒WR株；4，5样品的模板为V.V.-GPT-1n ；3为DNA Markers (由大到小依次为2000bp、1000bp、7500bp、500bp、250bp、100bp) ；1, 4 为引物 vv L_up 和 GPT L 的扩增产物；2，5 为引物GPT R和vv R-down的扩增产物。
[0049]图4为重组痘苗病毒V.V.-EV-1nf-Ι和V.V.-EV-mut的PCR扩增产物电泳结果。其中，1，3样品的模板为V.V.-EV-1nf-Ι ;2，4样品的模板为V.V.-EV-mut ；6样品的模板为V.V.-GPT-1n ；5 为 DNA Markers (由大到小依次为 2000bp、1000bp、750bp、500bp、bp)。1,2为引物EV-R和vv R-down的扩增产物；3，4，6为引物vv L_up和EV-L的扩增产物。
[0050]图5为EV-wt、EV-res和EVnut的一步生长曲线。
[0051]图6为C57BL/9小鼠染毒后临床观察结果。其中，A:腹腔接种EV_wt，接种量为I X IO6PFU/只；B:腹腔接种EV-res,接种量为I X IO6PFU/只；C:腹腔接种EV-mut,接种量为I X IO6PFU/只；D:正常对照，腹腔注射PBS，剂量Iml/只。
【具体实施方式】
[0052]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054]毒株、细胞与小鼠:
[0055]野生型痘苗病毒WR 株(Vaccinia virus WR strain):(参见文献:Thiel, V.，J.Heroldj B.Schellej and S.G.Siddell.2001.1nfectious RNAtranscribed in vitro froma cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.J.Gen.Virol.82:1273 - 1281.)。
[0056]脑炎病毒XJ-90260株(XJ-90260病毒):(参见文献:何海怀，吕新军，扬益良，付士红，周国林，张桂筠，陈向伟，粱国栋，金奇，候云德。我国分离的两株病毒为重组甲病毒，中华实验和临床病毒学杂志，2001，15 (2) =120-124.)。
[0057]质粒pSV2-gpt (购自ATCC公司，产品目录号:37145?)、CV-1细胞(购自ATCC，产品目录号:CCL-70)、BHK-21细胞(购自ATCC公司，产品目录号:CCL-10), D980R细胞(参见文献:Kerr, S.M., and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessentialfor virus repIication:recovery of plasmids from virus-1nfected cells.Virology,180:625 - 632.)、Vero细胞(购自ATCC公司，产品目录号:CCL_81)。
[0058]C57BL/6小鼠:3_4周龄，雄性，购自维通利华实验动物技术有限公司。
[0059]主要试剂和材料:
[0060]DMEM 培养基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase, Suoerscript III反转录酶，脂质体(Lipofectamine2000)转染试剂等均购自Invitrogen公司；RiboMAX RNA T7试剂盒购自Promega公司；Gelrite等均购自sigma公司；Eag I限制性内切酶购自NEB公司；RNeasy Mini Kit 购自 QIAGEN。
[0061]实施例1、脑炎病毒突变株的构建[0062]一、同源重组质粒的构建
[0063]1、重组质粒pGPT-1n的构建及鉴定
[0064]将野生型痘苗病毒WR株的基因组DNA序列(GenBank号:NC_006998.1，Up date:2012-11-22)的第80267-80725位(对应序列I的第1_459位，命名为上游同源臂)和第80726-81194位(对应序列I的第460-928位，命名为下游同源臂)分别克隆至质粒pSV2_gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT-1n。具体操作如下:
[0065](1)野生型痘苗病毒WR株基因组DNA的提取
[0066]具体操作如下:
[0067]将野生型痘苗病毒WR株用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加入到培养至单层的BHK-21细胞中(MOI=I),于37°C培养，每日观察细胞病变。待细胞病变达到+++ (约3d)时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70°C冻存备用。
[0068]提取痘苗病毒DNA，具体步骤如下:
[0069]1)取细胞沉淀，加入一定体积的 Buffer A (IOmM Tris-Cl pH9.0, ImM EDTA)充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
[0070]2)加 1/10 体积 0.5% (0.5g/100ml)的胰蛋白酶，37°C水浴，消化 20min。
[0071]3)将上述反应液加入到含有蔗糖垫(用ImM的pH9.0的Tris配制)的超速离心管中，16000rpm,4°C,90min离心。弃上清,用400μ1 Buffer A重悬沉淀,储存于4°C冰箱。
[0072]4)加适量RNase-free DNase到病毒重悬液，37°C，20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度IOmM的EDTA，65°C，IOmin终止消化。
[0073]5)向上述反应液中加入对倍体积的2XProteinase K Digestion Buffer和适量Proteinase K (终浓度 50 μ g/ml), 50°C温育 2h。
[0074]6)加I倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液(体积比为25:24:1)，轻轻颠倒混合均匀，13，OOOrpm离心5min。将上层水相转入新管(注意不要吸到中间蛋白质层)。
[0075]7)向新管中加I倍体积的氯仿/异戊醇(体积比24:1)，轻轻颠倒混合均匀，14, OOOrpm离心5min。将上层水相转入新管。
[0076]8)加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,轻轻颠倒混合均匀，14, OOOrpm离心15min。
[0077]9)弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14，OOOrpm离心10min。用移液器完全移除液体，加40-100 μ I无RNase水溶解DNA。
[0078]10)提取完成后，于260nm处测定OD值，以判断DNA浓度和纯度，并_70°C冻存备用。
[0079](2)引物的设计与合成
[0080]根据野生型痘苗病毒WR株的基因组cDNA序列(GenBank号:NC_006998.1，Update:2012-11-22)设计并合成如下两个引物对:
[0081]扩增上游同源臂的引物对:
[0082]W L-up:5'- gtc?ae cttaacgatgttcttcgcagatg-3> (下划线粗体部分为酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_006998.1的第80267-80289位，即序列I的第1-23位)；
[0083]W L-down: 5? - CtgCffiffiCggC^C atgatgacaataaagaattaattattg-3’ (下划线粗体部分依次为酶切位点Pst I和Not I的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_006998.1的第80699-80725位的反向互补序列，即序列I的第433-459位的反向互补序列)
[0084]扩增下游同源臂的引物对:
[0085]vv R-UP:5? ~ggaacggcggacatattcagttgataatc—3’ (下划线粗体部分为酶切位点Not I的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_006998.1的第80726-80753位，即序列I的第460-487位)
[0086]vv R-down:5，_ CgCSB tatctcggtttcctcacccaatcgt-3，(下划线粗体部分为酶切位点Sac II的识别序列，其后的序列为GenBank:NC_006998.1的第81170-81194位的反向互补序列，序列I的第904-928位的反向互补序列)
[0087](3)重组质粒pGPT-1n的构建及鉴定
[0088]以步骤(1)获得的野生型痘苗病毒WR株基因组DNA为模板，以步骤(2)设计合成的两对引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源臂和下游同源臂。扩增反应及结果如下:
[0089]PCR扩增体系组成:
[0090]
【权利要求】
1.脑炎病毒突变株，是将野生型脑炎病毒基因组RNA中编码El蛋白的第253位氨基酸Phe的密码子替换为编码氨基酸Ser的密码子，且将编码PE2蛋白中RKRR四肽的核苷酸序列缺失后得到的重组病毒。
2.根据权利要求1所述的脑炎病毒突变株，其特征在于:所述野生型脑炎病毒为脑炎病毒XJ90260株。
3.根据权利要求1或2所述的脑炎病毒突变株，其特征在于:所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列为序列表中序列2的第45-11477位。
4.制备权利要求1-3中任一所述脑炎病毒突变株的方法，包括如下步骤: Ca)将在野生型痘苗病毒基因组DNA中位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲； 所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列I中； (b)用所述野生型痘苗病毒感染CV-1细胞后，用步骤(a)获得的重组质粒甲转染所述CV-1细胞，所述野生型痘苗病毒与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述野生型痘苗病毒中的所述待取代核苷酸序列，或在所述野生型痘苗病毒中的所述待插入位点处插入所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙； (c)将步骤(a)中的所述重组质粒甲中的所述gpt基因替换为核苷酸片段A，得到重组质粒乙；所述核苷酸 片段A为含有权利要求1-3中任一所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列的核苷酸片段； Cd)用步骤(b)得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤(c)获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述核苷酸片段A替代所述重组痘苗病毒载体乙中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙； (e)提取步骤(d)得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA ;将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述脑炎病毒突变株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述野生型痘苗病毒为野生型痘苗病毒WR株。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述方法的步骤(a)中，所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别为GenBank号为NC_006998.1的序列的第 80267-80725 位和第 80726-81194 位；或 在所述核苷酸片段A中，在所述脑炎病毒突变株的基因组RNA反转录的cDNA序列前，含有T7启动子相关序列； 所述T7启动子相关序列具体为序列表中序列2的第10-44位； 所述核苷酸片段A的序列具体为序列表中序列2的第10-11534位。
7.蛋白质，为权利要求1-3中任一所述脑炎病毒突变株的基因组编码所得蛋白质。
8.编码权利要求7所述蛋白质的核酸分子； 所述核酸分子具体为如下I) _3)中任一 DNA分子: I)序列表中序列2的第89-11357位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2的第10-11534位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列2所示的DNA分子。
9.权利要求1-8中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子在制备抗病毒疫苗中的应用； 所述抗病毒疫苗具体为抗脑炎病毒疫苗。
10.如下(bl)-(b3)任一中的生物材料: (bl)含有权利要求1-8中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的离体动物细胞或重组菌； (b2)含有权利要求1-6中任一所述脑炎病毒突变株的基因组RNA或cDNA的载体；(b3)活性成分为权利要求1-8 中任一所述脑炎病毒突变株或所述蛋白质或所述核酸分子的抗病毒疫苗。
【文档编号】C12N7/00GK103898067SQ201410141195
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月9日 优先权日:2014年4月9日
【发明者】常国辉, 刘京梅, 孙走南, 韩鹏飞, 唐玥, 吴晓燕, 杨益 申请人:中国人民解放军疾病预防控制所