耐热菌类的检测方法

耐热菌类的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种耐热菌类的检测方法，所述检测方法使用序列号7～9和73～78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核核酸，或者使用在该碱基序列中使1～3个碱基缺失、置换或者添加而得到并能够用于耐热菌类的检测的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核核酸，对属于篮状菌（Talaromyces）属的耐热菌类进行鉴定。
【专利说明】耐热菌类的检测方法
[0001 ] 本申请是申请日为2009年5月28日、申请号为200980126323.2、发明名称为耐热菌类的检测方法的专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种耐热菌类的检测方法。
【背景技术】
[0003]耐热的菌类(真菌类)广泛分布于自然界，在蔬菜、水果等农作物上繁殖，并污染以这些农作物为原料的饮食品。然而，耐热的菌类与通常的其他菌类相比具有高的耐热性。例如即使对酸性饮料进行加热灭菌处理，耐热菌类也可以生存、繁殖，从而成为造成发霉的原因。因此，耐热菌类被作为引起重大事故的重要有害菌而被戒备。[0004]作为从加热灭菌处理后的饮食品中检测出来的污染事故的原因菌的主要的耐热菌类，已知有属于丝衣霉(Byssochlamys)属、篮状菌(Talaromyces)属、新萨托菌(Neosartorya)属、以及半内果菌(Hamigera)属的耐热菌类。与形成子囊孢子的其他耐热菌类相比，属于上述4个属的菌类具有非常高的耐热性，加热灭菌后的生存可能性也较高。另一方面，上述4个属之外的耐热菌类，由于可以在通常的灭菌条件下被杀灭，所以只要不出现灭菌不良等的情况，造成污染事故的可能性是很低的。因此，为了防止饮食品以及这些原材料中的耐热菌类引起的事故，检测和鉴别属于这4个属的耐热菌类是特别重要的。
[0005]此外，在调查危害事故发生时的事故原因以及对策上，事故的原因菌的鉴定也是必要的。因此，如果可以鉴别上述4个属的耐热菌类的话，就可以更加迅速地检测和鉴别事故的原因菌。
[0006]另一方面，作为现有的耐热菌类的检测和鉴别方法，有将被检测体在PDA培养基等上培养然后进行检测和鉴别的方法。但是，此方法直到能够确认菌落需要大约7天。而且，由于菌种的鉴定是基于菌的特征器官的形态进行的，所以直到能够确认形态学上的特征又需要大约7天的培养。因此，如果用此方法，耐热菌类的检测和鉴别需要约14天。这样的耐热菌类的检测和鉴别需要长时间，这从饮食品的卫生管理、原材料的鲜度保证、流通上的限制等观点来看，肯定无法得到满足。因此，需要确立更迅速的耐热菌类的检测和鉴别方法。
[0007]作为菌类的迅速的检测和鉴别方法，已知有利用PCR (聚合酶链式反应)法进行的检测方法(例如，参考专利文献I~4)。但是，在这些方法中，有难于特异并且迅速检测特定的耐热菌类的问题。
[0008]专利文献1:特表平11-505728号公报
[0009]专利文献2:特开2006-61152号公报
[0010]专利文献3:特开2006-304763号公报
[0011]专利文献4:特开2007-174903号公报
【发明内容】

[0012]本发明的课题在于提供一种特异并且迅速检测、鉴别作为饮食品污染的主要原因的菌耐热菌类的方法。
[0013]作为如上所述难于检测出耐热菌类的原因之一，可列举通过利用现有公知引物的PCR法而出现假阳性或者假阴性的结果。
[0014]本发明人等对于克服此问题，并能够特异检测和鉴别出特定耐热菌类的新的DNA区域进行了探索和深入的研究。其结果发现:在耐热菌类的β_微管蛋白基因或者28SrDNA的D1/D2区域以及ITS区域中，存在着与其他菌类有明显区别的具有特异的碱基序列的区域(以下，称其为“可变区”)，以此可变区为靶点，就可以对上述耐热菌类进行特异且迅速的检测和鉴别。基于此知识从而完成了本发明。
[0015]根据本发明，提供了以下方法:
[0016]本发明涉及一种属于篮状菌(Talaromyces)属的耐热菌类的检测方法,其包括下述2)的工序，
[0017]2)用下述(B-1)或者(B-2)的寡核苷酸作为引物对属于篮状菌(Talaromyces)属的菌类进行鉴定的工序，
[0018](B-1)序列号7~9和73~78中任一个记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸；
[0019](B-2)在序列号7~9和73~78中任一个记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
[0020]此外,本发明涉及一种属于篮状菌(Talaromyces)属耐热菌类的检测用寡核苷酸,其特征在于，
[0021]所述检测用寡核苷酸是序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸，或者是在序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
[0022]另外,本发明涉及一种属于篮状菌(Talaromyces)属耐热菌类的检测用试剂盒,其含有选自下述(1-1)或者(1-2)的寡核苷酸中的至少一种作为核酸探针或者核酸引物，
[0023](1-1)序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸；
[0024](1-2)在序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测耐热菌类的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
[0025]根据本发明，可以提供一种特异并且迅速地检测、鉴别作为饮食品污染事故的主要原因菌的耐热菌类的方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0026]图1 是烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、费希尔新萨托菌(Neosartoryafischeri var.fischeri),刺抱新萨托菌(Neosartorya fischeri var.spinosa)的 β-微管蛋白基因的碱基序列的一部分的比较图。
[0027]图2是表示榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)以及芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporoides)的β _微管蛋白基因的碱基序列图。
[0028]图3是表示实施例1 (A-1)的属于丝衣霉属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0029]图4是使用实施例1 (Α-2)的纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva)的各菌株的电泳图。
[0030]图5是使用实施例1 (A-2)的雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)的各菌株的电泳图。
[0031]图6是实施例1 (B-1)的属于篮状菌属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0032]图7是实施例1 (B-2)的属于篮状菌属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0033]图8是表示实施例1 (B-2)的属于篮状菌属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0034]图9-1是实施例1 (B-3)的电泳图。
[0035]图9-2是实施例1 (B-4)的电泳图。
[0036]图10是使用实 施例1 (B-5)的黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的各菌株的电泳图。
[0037]图11是使用实施例1 (B-5)的大孢篮状菌(Talaromyces macrosporus)的各菌株的电泳图。
[0038]图12是表示实施例1 (C-1)的属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的鉴别结果的电泳图。
[0039]图13是表示实施例1 (C-2)的属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的鉴别结果的电泳图。
[0040]图14是表示实施例1 (C-3)的属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的鉴别结果的电泳图。
[0041]图15是表示实施例1 (C-3)的属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的鉴别结果的电泳图。
[0042]图16是使用实施例1 (C-4)的费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri var.fischeri)的各菌株的电泳图。
[0043]图17是使用实施例1 (C-4)的光滑新萨托菌(Neosartorya fischeri var.glabra)的各菌株的电泳图。
[0044]图18是使用实施例1 (C-4)的平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae)的各菌株的电泳图。
[0045]图19是使用实施例1 (C-4)的Neosartorya paulistensis的各菌株的电泳图。
[0046]图20是使用实施例1 (C-4)的刺抱新萨托菌(Neosartorya fischeri var.spinosa)的各菌株的电泳图。
[0047]图21是表示实施例1 (D-1)的属于半内果菌属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0048]图22是表示实施例1 (D-2)的属于半内果菌属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0049]图23是表示实施例1 (D-3)的属于半内果菌属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0050]图24-1是使用实施例1 (D-4)的条纹钩囊菌(Hamigera striata)的各菌株的电泳图。[0051]图24-2是使用实施例1 (D-5)的榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)的各菌株的电泳图。
[0052]图25-1是使用实施例1 (D-6)的属于半内果菌属以及丝衣霉属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0053]图25-2是使用实施例1 (D-6)的属于半内果菌属以及丝衣霉属的菌类的鉴别结果的电泳图。
[0054]图26是显示在丝衣霉属的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列中，识别为丝衣霉属检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0055]图27是显示在新萨托菌属的β -微管蛋白基因的碱基序列中，识别为新萨托菌属检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0056]图28是显示在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的β -微管蛋白基因的碱基序列中，识别为烟曲霉(Aspergillus fumigatus)检测用引物的碱基序列的位置关系。[0057]图29是显示在半内果菌属的β -微管蛋白基因的碱基序列中，识别为半内果菌属检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0058]图30是显不在黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的碱基序列中，识别为黄色篮状菌(Talaromyces flavus)检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0059]图31是显示在沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的β_微管蛋白基因的碱基序列中，识别为沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)检测用引物的碱基序列的位
置关系。
[0060]图32是显示在藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的β-微管蛋白基因的碱基序列中，识别为藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0061]图33是显示在黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列中，识别为黄色篮状菌(Talaromyces flavus)检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0062]图34是显示在糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)以及黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列中，识别为糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)以及黄色篮状菌(Talaromyces flavus)检测用引物的碱基序列的位置关系。
[0063]图34-1是显示在糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)以及黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列中，识别为糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)以及黄色篮状菌(Talaromyces flavus)检测用引物的碱基序列的位置关系(续图34)。
[0064]图35是表示实施例2中用实时浊度法测定的丝衣霉属的菌类的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的检测灵敏度的图。I表示使用来自纯黄丝衣菌(Byssochlamysfulva)IFM48421菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea) IFM51244菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，4表示使用来自藤黄篮状菌(Talaromyces luteus) IFM53241菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，6表示使用来自沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii) IFM52262菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自Neosartorya ficheri IFM46945菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0065]图36是表示实施例3中用实时浊度法测定的的新萨托菌属的β -微管蛋白基因的检测灵敏度的图。I表示使用来自费希尔新萨托菌(Neosartorya ficheri) IFM46945菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自刺孢新萨托菌(Neosartorya邓1110%)正146967菌株的基因组0嫩的样品的检测灵敏度，3表示使用来自光滑新萨托菌(Neosartorya glabra) IFM46949菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，4表示使用来自平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae) IFM47036菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，5表示使用来自黄色篮状菌(Talaromyces flavus) IFM42243菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，6表示使用来自藤黄篮状菌(Talaromyces luteus) IFM53242菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus) IFM42247菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，9表示使用来自纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva) IFM48421菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，11表示使用来自链格孢(Alternaria alternate) IFM41348菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，14表示使用来自尖孢镰孢(Fusarium oxysporium) IFM50002菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0066]图36-1是表示实施例3中用实时浊度法测定的新萨托菌属以及烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的菌类的β _微管蛋白基因的检测灵敏度的图。
[0067]图37是表示实施例4中用实时浊度法测定的半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因的检测灵敏度的图。I表示使用来自榛色钩囊菌(Hamigera avellanea) IFM42323菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度,2表示使用来自榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)IFM52241菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，3表示使用来自榛色钩囊菌(Hamigeraavellanea) IFM52957菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，4表示使用来自纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva) IFM51213菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，5表示使用来自雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea) IFM51245菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，6表示使用来自宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) IFM40913菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自宛氏拟青霉(Paecilomyces variotii) IFM40915菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0068]图38是表示实施例5中用实时池度法测定的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的β -微管蛋白基因的检测灵敏度的图。I表示使用来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)A209菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自烟曲霉(Aspergillusfumigatus) A213菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，3表示使用来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus) A215菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度,6表示使用来自刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa) IFM46967菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0069]图39是表示实施例6中用实时池度法测定的黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的检测灵敏度的图。I表示使用来自黄色篮状菌(Talaromycesflavus) IFM42243菌 株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自黄色篮状菌(Talaromyces flavus) IFM52233菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，6表示使用来自糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus) IFM52252菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii) IFM52255菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，9表示使用来自纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva) IFM48421菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0070]图40是表示实施例7中用实时池度法测定的沃特曼篮状菌(Talaromyceswortmannii)的β _微管蛋白基因的检测灵敏度的图。I表示使用来自沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii) IFM52255菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度,2表示使用来自沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii) IFM52262菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，3表示使用来自黄色篮状菌(Talaromyces flavus) IFM42243菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，4表示使用来自藤黄篮状菌(Talaromyces luteus) IFM53241菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，5表示使用来自糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus) IFM42247菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea) IFM51244菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，8表示使用来自榛色钩囊菌(Hamigera avellanea) IFM42323菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0071]图41是表示实施例8中用实时池度法测定的藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的β_微管蛋白基因的检测灵敏度的图。I表示使用来自藤黄篮状菌(Talaromycesluteus) IFM53242菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自藤黄篮状菌(Talaromyces luteus) IFM53241菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，5表示使用来自沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii) IFM52262菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，8表示使用来自刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa) IFM46967菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度。
[0072]图42是表示实施例9中用实时池度法检测的黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糖抱篮状菌(Talar omyces trachyspermus)的28SrDNA的ITS区域以及D1/D2区域的检测灵敏度的图。I表示使用来自黄色篮状菌(Talaromyces flavus) IFM42243菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，2表示使用来自黄色篮状菌(Talaromycesflavus) IFM52233菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，3表示使用来自黄色篮状菌(Talaromyces flavus) T38菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度,6表示使用来自糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus) IFM42247菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，7表示使用来自糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus) IFM52252菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，9表示使用来自沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii) IFM52255菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，10表示使用来自纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva)IFM48421菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，12表示使用来自荨麻青霉(Penicilliumgriseofulvum) IFM54313菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，13表示使用来自桔青霉(Penicillium citirinum) IFM54314菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，15表示使用来自费希尔新萨托菌(Neosartorya ficheri) IFM46945菌株的基因组DNA的样品的检测灵敏度，16表示使用DW作为阴性对照的样品的检测灵敏度。本发明的上述以及其他特征和优点，通过参考适当的附图并从下述记载中更为明确。
【具体实施方式】
[0073]以下，对本发明进行详细说明。
[0074]本发明是利用含有耐热菌类的β_微管蛋白基因的部分碱基序列或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列，即耐热菌类的β-微管蛋白基因区域或者28SrDNA的D1/D2区域以及ITS区域中耐热菌类的各属的特异的区域或者种特异的区域(可变区)的碱基序列的核酸，进行耐热菌类的鉴定，对耐热菌类进行特异地鉴别、检测的方法。
[0075]根据本发明，可以鉴别、检测属于丝衣霉(Byssochlamys)属的菌类、属于篮状菌(Talaromyces)属的菌类、属于新萨托菌(Neosartorya)属的菌类、属于半内果菌(Hamigera)属的菌类、以及烟曲霉(Aspergillus fumigatus)等的耐热菌类。
[0076]更详细的说，本发明是包括下述I)~4)的鉴定、检测工序中至少一步的耐热菌类的检测方法。
[0077]I)利用含有属于丝衣霉(Byssochlamys)属的菌类的β_微管蛋白基因区域以及/或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域中丝衣霉属特异区域(可变区)的碱基序列的核酸，进行属于丝衣霉属的菌类的鉴定，对属于丝衣霉属的菌类进行特异地鉴别、检测的工序。
[0078]2)利用含有属于篮状菌(Talaromyces)属的菌类的β -微管蛋白基因区域以及/或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域中篮状菌属特异区域或者种特异区域(可变区)的碱基序列的核酸，进行属于篮状菌属的菌类的鉴定，对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、检测的工序。
[0079]3)利用含有属于新萨托菌(Neosartorya)属的菌类或者烟曲霉(AsperRillusfumigatus)的β_微管蛋白基因区域中新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉特异区域或者种特异区域(可变区)的碱基序列的核酸，进行属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉的鉴定，对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉进行特异地鉴别、检测的工序。
[0080]4)利用含有属于半内果菌(Hamigera)属的菌类的β _微管蛋白基因区域中半内果菌属特异区域或者种特异区域(可变区)的碱基序列的核酸，进行属于半内果菌属的菌类的鉴定，对属于半内果菌属的菌类进行特异地鉴别、检测的工序。
[0081]本发明的检测方法，优选包括上述I)~4)的鉴定、检测工序中的至少2个工序，更优选包括上述I)~4)的鉴定、检测工序中的至少3个工序，最优选包括上述I)~4)的鉴定、检测工序中的全部工序。本发明的检测方法，通过包括数个上述I)~4)的工序，就可以全面检测出作为饮食品污染的主要原因菌的耐热菌。
[0082] 本发明中的属于丝衣霉属的菌类、属于篮状菌属的菌类、属于新萨托菌属的菌类、烟曲霉以及属于半内果菌属的菌类等的“耐热菌类”，是指属于发菌科(Trichocomaceae)的不整子囊菌类(Plectomycetes),是即使在75°C、30分钟的加热处理后形成可以生存的子囊孢子的耐热菌类。作为属于丝衣霉属的菌类的例子，可列举纯黄丝衣菌(Byssochlamysfulva),雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)。作为属于篮状菌属的菌类的例子，可列举黄色篮状菌(Talaromyces flavus),藤黄篮状菌(Talaromyces luteus),糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)，沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)，杆抱篮状菌(Talaromyces bacillisporus)，大抱篮状菌(Talaromyces macrosporus)。作为属于新萨托菌属的菌类的例子，可列举刺孢新萨托菌(Neosartorya fischeri var.spinosa)(以下称为 Neosartorya spinosa)，费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri var.fischeri)(以下称为 Neosartorya fischeri),光滑新萨托菌(Neosartorya fischeri var.glabra)(以下称为Neosartorya glabra),平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae) ,Neosartoryapaulistensis,假费希尔新萨托菌(Neosartorya peudofischeri)。作为属于半内果菌属的菌类的例子，可列举榛色钩囊菌(Hamigera avellanea),条纹钩囊菌(Hamigera striata)。
[0083]本发明中的“烟曲霉”是指,与费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri)的无性型(无性世代)在形态学上极其类似但是没有有性型(有性世代)的半知菌类的一种。
[0084]在本发明中，“可变区”是指，微管蛋白基因中或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS (内转录间隔区，internal transcribed spacer)区域中易于积累碱基变异的区域。
[0085]“ β -微管蛋白”是指与α -微管蛋白一起构成真核细胞的微管的蛋白质，“ β -微管蛋白基因”是指编码β_微管蛋白的基因。另外，“28S rDNA”是指编码作为向蛋白质转化场所的核糖体的遗传信息的DNA。本发明人着眼于β_微管蛋白基因和28S rDNA所共同编码的蛋白质本身在真菌内普遍存在这一事实。而且，发现:在此基因或者rDNA序列中，由于碱基的变异比较容易积累，且此变异在属或种的水平上被保存，因此在该基因或者rDNA序列内的特定区域内存在着可以用于与其他属其他种区别的碱基序列的可能性高的共通点。基于这些知识，对于以上述的耐热菌类为首的各种真菌类，鉴定?分析β_微管蛋白基因或者28S rDNA的碱基序列，从而得到了本发明中的“可变区”。
[0086]因此，该可变区的碱基序列在真菌的属或者种之间差别较大，这些菌类的微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的可变区是这些菌类固有的碱基序列，因此可以和其他属或者其他种的菌类明显区别。
[0087]本发明的检测方法中使用的耐热菌类的β-微管蛋白基因中或者28S rDNA的Dl/D2区域以及ITS区域中的 特定区域(可变区)的碱基序列所对应的核酸，是下述(I)或者
(II)的核酸。
[0088](I)含有序列号24~35或者83~86中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的核酸；
[0089](II)含有在序列号24~35或者83~86中任一个所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于鉴定耐热菌类的碱基序列或者其互补序列的核酸。
[0090]更具体而言，为了检测属于丝衣霉属的菌类而利用下述(A-1)或者(A-1I)的核酸，即属于丝衣霉属的菌类的微管蛋白基因中或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域中的特定区域(可变区)的碱基序列所对应的核酸。
[0091](A-1)含有序列号24或者25记载的碱基序列或者其互补序列的核酸；
[0092](A-1I)含有在序列号24或者25记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于丝衣霉属的菌类的碱基序列或者其互补序列的核酸。
[0093]发明人鉴定了来自属于丝衣霉属的菌类以及与属于丝衣霉属的菌类近缘的菌类的各种微管蛋白基因以及28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列，进行了在与丝衣霉属近缘的属和丝衣霉属之间、以及丝衣霉属内的遗传距离的解析。此外，还进行了所鉴定的各种微管蛋白基因序列以及28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列的同源性解析。其结果是，找到了该序列中具有属于丝衣霉属的菌类中固有的碱基序列的可变区。在此可变区中，由于属于丝衣霉属的菌类具有固有的碱基序列，就可能进行属于丝衣霉属的菌类的鉴别、鉴定。[0094]在本发明的检测方法中，为检测属于篮状菌属的菌类而利用下述(B-1)或者(B-1I)的核酸，即属于篮状菌属的菌类的β_微管蛋白基因中以及/或者28S rDNA的Dl/D2区域以及ITS区域中的特定区域(可变区)的碱基序列所对应的核酸。
[0095](B-1)含有序列号26~31中任一个记载的碱基序列或者其互补序列的核酸；
[0096](B-1I)含有在序列号26~31中任一个记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的核酸。
[0097]发明人鉴定了来自属于篮状菌属的菌类以及与属于篮状菌属的菌类近缘的菌类的各种微管蛋白基因以及28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列，进行了在与篮状菌属近缘的属以及篮状菌属之间、以及篮状菌属内的遗传距离的解析。此外，还进行了所鉴定的各种微管蛋白基因序列以及28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列的同源性解析。其结果是，找到了该序列中具有属于篮状菌属的菌类的固有的碱基序列的可变区。在此可变区中，由于属于篮状菌属的菌类具有固有的碱基序列，就可能进行属于篮状菌属的菌类的鉴别、鉴定。
[0098]在本发明的检测方法中，为检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉而利用下述(C-1)或者(C-1I)的核酸，即属于新萨托菌属的菌类或者烟曲霉的β -微管蛋白基因中的特定区域(可变区)的碱基序列所对应的核酸。
[0099](C-1)含有序列号32~34或者83~86中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的核酸；
[0100](C-1I)含有在序列号32~34或者83~86中任一个所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉的碱基序列或者其互补序列的核酸。
[0101]发明人鉴定了来自属于新萨托菌属的菌类、烟曲霉以及与属于新萨托菌属的菌类近缘的菌类的各种β-微管蛋白基因的碱基序列，进行了与新萨托菌属近缘的属与新萨托菌属之间、新萨托菌属内、以及与新萨托菌属近缘的属或新萨托菌属与烟曲霉之间的遗传距离的解析。此外，还进行了所鉴定的各种β -微管蛋白基因的碱基序列的同源性解析。其结果是，找到了该序列中具有属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉中固有的碱基序列的可变区。在此可变区中，由于属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉具有固有的碱基序列，就可能进行属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的鉴别、鉴定。
[0102]在本发明的检测方法中，其特征在于:为检测属于半内果菌属的菌类而利用下述(D-1)或者(D-1I)的核酸，即属于半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因中的特定区域(可变区)的碱基序列所对应的核酸。
[0103](D-1)含有序列号35记载的碱基序列或者其互补序列的核酸；
[0104](D-1I)含有在序列号35记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于半内果菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的核酸。
[0105]发明人鉴定了来自属于半内果菌属的菌类以及与属于半内果菌属的菌类近缘的菌类的各种β_微管蛋白基因的碱基序列，进行了在与半内果菌属近缘的属和半内果菌属之间、以及半内果菌属内的遗传距离的解析。此外，还进行了所鉴定的各种β_微管蛋白基因序列的同源性解析。其结果是，找到了该序列中具有属于半内果菌属的菌类中固有的碱基序列的可变区。在此可变区中，由于属于半内果菌属的菌类具有固有的碱基序列，就可能进行属于半内果菌属的菌类的鉴别、鉴定。
[0106]本发明以这些可变区以及来自可变区的核酸、寡核苷酸作为靶点。
[0107]本发明的检测方法中使用的上述(A-1)或者(A-1I)的碱基序列，对应于属于丝衣霉属的菌类的β -微管蛋白基因的部分碱基序列或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列。
[0108]序列号24所记载的碱基序列以及其互补序列，是从雪白丝衣菌(Byssochlamysnivea)中分离、鉴定的β _微管蛋白基因的可变区的碱基序列。序列号25所记载的碱基序列以及其互补序列，是纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva)中分离、鉴定的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列。该序列是属于丝衣霉属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于丝衣霉属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号24或者25所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于丝衣霉属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于丝衣霉属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。含有这些碱基序列的核酸，特别适用于检测雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)以及纯黄丝衣菌(Byssochlamys fulva)。
[0109]本发明的检测方法中使用 的上述(B-1)或者(B-1I)的碱基序列，对应于属于篮状菌属的菌类的β -微管蛋白基因的部分碱基序列或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列。
[0110]序列号26所记载的碱基序列以及其互补序列，是从黄色篮状菌(Talaromycesflavus)中分离、鉴定的β_微管蛋白基因的可变区的碱基序列。该序列是属于篮状菌属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号26所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。含有这些碱基序列的核酸,特别适用于检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)。
[0111]序列号27所记载的碱基序列以及其互补序列，是从藤黄篮状菌(Talaromycesluteus)中分离、鉴定的β_微管蛋白基因的可变区的碱基序列。该序列是属于篮状菌属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号27所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。含有这些碱基序列的核酸,特别适用于检测藤黄篮状菌(Talaromyces luteus),杆孢篮状菌(Talaromyces bacillisporus)，沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)。
[0112]序列号28所记载的碱基序列以及其互补序列，是从沃特曼篮状菌(Talaromyceswortmannii)中分离、鉴定的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列。该序列是属于篮状菌属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号28所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。含有这些碱基序列的核酸，特别适用于检测沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus),大抱篮状菌(Talaromyces macrosporus)。
[0113]序列号29所记载的碱基序列以及其互补序列，是从沃特曼篮状菌(Talaromyceswortmannii)中分离、鉴定的β _微管蛋白基因的可变区的碱基序列。该序列是属于篮状菌属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号29所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。含有这些碱基序列的核酸，特别适用于检测沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)。[0114]序列号30所记载的碱基序列以及其互补序列，是从黄色篮状菌(Talaromycesflavus)中分离、鉴定的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列。序列号31所记载的碱基序列以及其互补序列,是从糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)中分离、鉴定的28SrDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列。该序列是属于篮状菌属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号30或者31所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于篮状菌属的菌类进行特异地鉴另1J、鉴定。含有这些碱基序列的核酸，特别适用于检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)。
[0115]本发明的检测方法中使用的上述(C-1)或者(C-1I)的碱基序列，对应于属于新萨托菌属的菌类或者烟曲霉的β-微管蛋白基因的部分碱基序列。
[0116]序列号32所记载的碱基序列以及其互补序列，是从光滑新萨托菌(Neosartoryaglabra)中分离、鉴定的β _微管蛋白基因的可变区的碱基序列。序列号83或者84所记载的碱基序列以及其互补序列，是从费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri)中分离、鉴定的β _微管蛋白基因的可变区的部分喊基序列。序列号85或者86所记载的喊基序列以及其互补序列，是从刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa)中分离、鉴定的β-微管蛋白基因的可变区的部分碱基序列。此外，序列号33或者34所记载的碱基序列以及其互补序列，是从烟曲霉中分离、鉴定的β_微管蛋白基因的可变区的碱基序列。该序列是属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号32~34或者83~86中任一个所记载碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉进行特异地鉴别、鉴定。含有这些碱基序列的核酸，特别适用于检测光滑新萨托菌(Neosartorya glabra),费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri),刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa)，平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae), Neosartoryapaulistensis,假费希尔新萨托菌(Neosartorya peudofischeri),烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。
[0117]本发明的检测方法中使用的上述(D-1)或者(D-1I)的碱基序列，对应于属于半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因的部分碱基序列。
[0118]序列号35所记载的碱基序列以及其互补序列，是从榛色钩囊菌(Hamigeraavellanea)中分离、鉴定的β _微管蛋白基因的可变区的碱基序列。该序列是属于半内果菌属的菌类的特异性序列，通过确认被检测体中是否含有此碱基序列，就可能对属于半内果菌属的菌类进行特异地鉴别、鉴定。此外，利用含有在序列号35所记载的碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于半内果菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列的碱基序列，也可以同样对属于半内果菌属的菌类进行特异地鉴另1J、鉴定。含有这些碱基序列的核酸，特别适用于检测榛色钩囊菌(Hamigera avellanea),条纹钩囊菌(Hamigera striata)。
[0119]下面，将上述(A-1)~(D-1I)中任一个碱基序列总称为“本发明的可变区的碱基序列”。
[0120]作为使用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸来鉴定耐热菌类的方法，没有特别限制，可以用基因工程中通常使用的方法如测序法、杂交法、PCR法、LAMP法等进行。
[0121]在本发明的检测方法中，为了利用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸进行对耐热菌类的鉴定，优选测定被检测体的β_微管蛋白基因区域或者28S rDNA的Dl/D2区域以及ITS区域的碱基序列，然后确认在该区域的碱基序列中是否含有上述(A-1)~(D-1I)中任一个碱基序列。
[0122]更为详细的，利用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸来进行对属于丝衣霉属的菌类的鉴定，优选为测定被检测体的β_微管蛋白基因区域或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列，然后确认在该区域的碱基序列中是否含有上述(A-1)或者(A-1I)的碱基序列。即，本发明的检测方法包含的优选形式是，解析、测定被检测体所具有的微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列，将测定出来的碱基序列与本发明上述的(A-1)或者(A-1I)的β-微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列进行比较，根据其是否一致或者不同来鉴定属于丝衣霉属的菌类。
[0123]利用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸来进行对属于篮状菌属的菌类的鉴定，优选为测定被检测体的β_微管蛋白基因区域或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列，然后确认在该区域的碱基序列中是否含有上述(B-1)或者(B-1I)的碱基序列。即，本发明的检测方法包含的优选形式是，解析、测定被检测体所具有的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的碱基序列，将测定出来的碱基序列与本发明上述的(B-1)或者(B-1I)的β-微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的可变区的碱基序列进行比较，根据其是否一致或者不同来鉴定属于篮状菌属的菌类。
[0124]利用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸来进行对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉的鉴定，优选为测定被检测体的β_微管蛋白基因区域的碱基序列，然后确认在该区域的碱基序列中是否含有上述(C-1)或者(C-1I)的碱基序列。即，本发明的检测方法包含的优选形式是，解析、测定被检测体所具有的β-微管蛋白基因的碱基序列，将测定出来的碱基序列与本发明上述的(C-1)或者(C-1I)的β-微管蛋白基因的可变区的碱基序列进行比较，根据其是否一致或者不同来鉴定属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉。
[0125]利用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸来进行对属于半内果菌属的菌类的鉴定，优选为测定被检测体的β_微管蛋白基因区域的碱基序列，然后确认在该区域的碱基序列中是否含有上述(D-1)或者(D-1I)的碱基序列。即，本发明的检测方法包含的优选形式是，解析、测定被检测体所具有的β_微管蛋白基因的碱基序列，将测定出来的碱基序列与本发明上述的(D-1)或者(D-1I)的β_微管蛋白基因的可变区的碱基序列进行比较，根据其是否一致或者不同来鉴定属于半内果菌属的菌类。
[0126]作为碱基序列的解析、测定方法，并没有特别限定，可以利用通常进行的RNA或者DNA测序的方法。
[0127]具体地,可以列举Maxam - Gilbert法、Sanger法等的电泳法、质谱法、杂交法等。在Sanger法中，可以列举用放射性标记法、荧光标记法等来标记引物或者终止子的方法。
[0128]在本发明中，为了利用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸来对耐热菌类进行检测、鉴定，可以利用与上述本发明的可变区的碱基序列，即上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸进行杂交，并且作为对耐热菌类进行特异性检测的检测用寡核苷酸而发挥功能的检测用寡核苷酸。
[0129]更详细地，为了进行对属于丝衣霉属的菌类的检测、鉴定，可以利用与上述本发明的可变区的碱基序列，即上述(A-1)或者(A-1I)的核酸杂交，并且作为能够用于对属于丝衣霉属的菌类进行特异性检测的检测用寡核苷酸而发挥功能的检测用寡核苷酸。
[0130]为了进行对属于篮状菌属的菌类的检测、鉴定，可以利用与上述本发明的可变区的碱基序列，即上述(B-1)或者(B-1I)的核酸杂交，并且作为能够用于对属于篮状菌属的菌类进行特异性检测的检测用寡核苷酸而发挥功能的检测用寡核苷酸。
[0131]为了进行对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉的检测、鉴定，可以利用与上述本发明的可变区的碱基序列，即上述(C-1)或者(C-1I)的核酸杂交，并且作为能够用于对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉进行特异性检测的检测用寡核苷酸而发挥功能的检测用寡核苷酸。
[0132]为了进行对属于半内果菌属的菌类的检测、鉴定，可以利用与上述本发明的可变区的碱基序列，即上述(D-1)或者(D-1I)的核酸杂交，并且作为能够用于对属于半内果菌属的菌类进行特异性检测的检测用寡核苷酸而发挥功能的检测用寡核苷酸。
[0133]本发明的检测用寡核苷酸，只要是能够用于上述耐热菌类的检测即可。即，可以是作为用于耐热菌类检测的核酸引物或者核酸探针来使用，或者也可以是在严格条件下可以和耐热菌类的微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的可变区的碱基序列进行杂交的寡核苷酸。另外，这里，作为“严格条件”，例如可以列举 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook, Davidff.Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]所记载的方法,例如,在含有6XSSC(I XSSC 的组成:0.15M 氯化钠，0.015M 柠檬酸钠，pH7.0),0.5%SDS，5XDenhardt’ s 溶液以及100mg/ml鲱鱼精DNA的溶液中与探针一起在65°C保温8~16小时下进行杂交的条件。[0134]作为本发明上述的检测用寡核苷酸，优选使用可以与以下区域进行杂交的寡核苷酸，该区域为上述本发明的微管蛋白基因或者28SrDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列中选出的区域，即上述(I)或者(II)的核酸中的区域，且满足(I)含有上述耐热菌类的各属所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值(解链温度:melting temperature)大约在55°C~65°C这4个条件。
[0135]更详细地，在检测属于丝衣霉属的菌类时，优选使用可以与以下区域进行杂交的寡核苷酸，该区域为上述(A-1)或者(A-1I)的核酸中的区域，且满足(I)含有属于丝衣霉属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65 °C这4个条件。
[0136]在检测属于篮状菌属的菌类时，优选使用可以与以下区域进行杂交的寡核苷酸，该区域为上述(B-1)或者(B-1I)的核酸中的区域，且满足(I)含有属于篮状菌属的菌类所固有的基因的碱基序列 以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65°C这4个条件。
[0137]在检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉时，优选使用可以与以下区域进行杂交的寡核苷酸，该区域为上述(C-1)或者(C-1I)的核酸中的区域，且满足(I)含有属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65°C这4个条件。
[0138]在检测属于半内果菌属的菌类时，优选使用可以与以下区域进行杂交的寡核苷酸，该区域为上述(D-1)或者(D-1I)的核酸中的区域，且满足(I)含有属于半内果菌属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65 °C这4个条件。
[0139]上述(I)中的“含有上述耐热菌类的各属所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在上述本发明的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区中，不同属之间的碱基序列的保守性特别低(即，耐热菌类的每个属的特异性特别高)，10个碱基左右的耐热菌类所固有的碱基序列连续出现的区域。具体地，“含有属于丝衣霉属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在上述本发明的β_微管蛋白基因的可变区中，不同属之间的碱基序列的保守性特别低(即，属于丝衣霉属的菌类的特异性特别高)，10个碱基左右的属于丝衣霉属的菌类所固有的碱基序列连续出现的区域。另外，“含有属于篮状菌属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在上述本发明的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区中，不同属之间的碱基序列的保守性特别低(即，属于篮状菌属的菌类的特异性特别高)，10个碱基左右的属于篮状菌属的菌类所固有的碱基序列连续出现的区域。另外，“含有属于新萨托菌属的菌类或者烟曲霉所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在上述本发明的β_微管蛋白基因的可变区中，不同属之间的碱基序列的保守性特别低(即，属于新萨托菌属的菌类或者烟曲霉的特异性特别高)，10个碱基左右的属于新萨托菌属的菌类或者烟曲霉所固有的碱基序列连续出现的区域。另外，“含有属于半内果菌属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域”是指，即使在上述本发明的β-微管蛋白基因的可变区中，不同属之间的碱基序列的保守性特别低(即，属于半内果菌属的菌类的特异性特别高)，10个碱基左右的属于半内果菌属的菌类所固有的碱基序列连续出现的区域。
[0140]此外，上述(3)中的“寡核苷酸的自退火的可能性低”是指，从引物的碱基序列预测引物之间不会互相结合。
[0141]本发明的检测用寡核苷酸的碱基数目，并没有特别限定，但优选为13个碱基~30个碱基，更优选为18个碱基~23个碱基。杂交时的寡核苷酸的Tm值，优选为在55°C~65°C的范围内，更优选为在59°C~62°C的范围内。寡核苷酸的GC含量，优选为30%~80%，更优选为45%~65%。最优选为55%左右。
[0142]本发明的上述检测用寡核苷酸，优选为含有序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有相对于序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上同源性的碱基序列的寡核苷酸，并能够用于耐热菌类的检测(具有检测用寡核苷酸的功能)。能够用于耐热菌类的检测是指，作为和序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列具有70%以上同源性，并作为用于耐热菌类的检测的核酸引物或者核酸探针而能够用于耐热菌类的检测的碱基序列，或者也可以是在严格条件下，可能与各耐热菌类的β_微管蛋白基因或者28SrDNA的ITS区域以及D1/D2区域杂交的碱基序列。此外，这里“严格条件”是指，例如可以列举 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, Davidff.Russell., Cold Sp ring Harbor Laboratory Press]所记载的方法,例如,在含有6XSSC(I XSSC 的组成:0.15M 氯化钠，0.015M 柠檬酸钠，pH7.0),0.5%SDS，5 X Denhardt ’ s 溶液以及100mg/ml鲱鱼精DNA的溶液中与探针一起在65°C下保温8~16小时下进行杂交的条件。这样的本发明的寡核苷酸，只要是如上所述的能够用于耐热菌类检测的寡核苷酸，优选为同源性在75%以上，更优选为同源性在80%以上，更优选为同源性在85%以上，更优选为同源性在90%以上，特别优选为同源性在95%以上。此外，关于碱基序列的同源性，是由Lipman-Pearson法(Science, 227, 1435, 1985)等计算的。具体地，可以使用基因信息处理软件Genetyx-Win (Software开发制)的同源解析(Search homology)程序,将参数Unitsize to compare (ktup)设定为2进行解析而算出来的。
[0143]另外，本发明的检测用寡核苷酸，只要是能够用于耐热菌类检测的，包括对含有序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸进行碱基缺失、插入或者置换的变异或修饰而成的寡核苷酸。另外，本发明的寡核苷酸可以是对序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列进行碱基的缺失、插入或者置换的变异或修饰而成的碱基序列所表示的寡核苷酸，也可以是作为用于耐热菌类检测的引物或者探针而能够用于检测耐热菌类的寡核苷酸，或者是在严格条件下，可能与各耐热菌类的β -微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域杂交的碱基序列所表示的寡核苷酸。另外，这里，“严格条件”是指，例如可以列举 Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRDEDITION[Joseph Sambrook, David ff.Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]所记载的方法，例如，可以列举在含有6 X SSC (I XSSC的组成:0.15M氯化钠，0.015M柠檬酸钠，pH7.0),0.5%SDS，5 XDenhardt’ s溶液以及100mg/ml鲱鱼精DNA的溶液中与探针一起在65°C下保温8~16小时下进行的杂交条件。作为如此经过碱基缺失、插入或者置换的变异或者修饰的寡核苷酸，包括在含有序列号从I到23或者36~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸中，经过I个或数个、优选为I到5个、更优选为I到4个、更优选为I到3个、更优选为I到2个、最优选为I个碱基的缺失、插入或者置换的变异或者修饰而成的寡核苷酸。另外，在序列号从I到23或者36~78中任一个所记载的碱基序列中，也可以添加适当的碱基序列。
[0144]在本发明中，在上述检测用寡核苷酸中，优选为使用含有序列号从I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。更优选为使用含有序列号从I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0145]此外，在鉴定、检测耐热菌类中属于丝衣霉属的菌类时，上述的本发明的检测用寡核苷酸中，优选为使用含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。更优选为使用含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0146]在鉴定、检测属于篮状菌属的菌类时，优选为使用含有序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序 列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。更优选为使用含有序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0147]在鉴定、检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉时，优选为使用含有序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。更优选为使用含有序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0148]在鉴定、检测属于半内果菌属的菌类时，优选为使用含有序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。更优选为使用含有序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0149]如后所述，在本发明的检测方法中，上述本发明的检测用寡核苷酸可以作为核酸探针或者核酸引物而适当地使用。
[0150]上述的检测用寡核苷酸的键合方式，不仅可以是天然核酸中存在的磷酸二酯键，还可以是例如磷酰胺键、硫代磷酸酯键等。
[0151]本发明中所用的寡核苷酸，可以用公认的方法合成。例如可以根据设计的序列进行化学合成，也可以从试剂制造商处购入。具体地，可以用寡核苷酸合成装置合成。此外，可以使用在合成后用吸附柱、高相液相色谱、或者电泳法纯化的产物。另外，对于含有一个或者数个碱基置换、缺失、插入或者添加的碱基序列的寡核苷酸，也可以用公认的方法合成。
[0152]在本发明的检测方法中，为了用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸对耐热菌类进行鉴定，优选为标记和上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸在严格条件下杂交的检测用寡核苷酸，将得到的检测用寡核苷酸与从检测对象物中提取的核酸在严谨的条件下杂交，测定经杂交的检测用寡核苷酸的标记。
[0153]这种情况下，作为与上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸在严格条件下杂交的检测用寡核苷酸，可以使用上述的本发明的检测用寡核苷酸，优选范围也同样。其中，优选为含有序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性的碱基序 列的寡核苷酸，并可以用于耐热菌类检测的，更优选为使用含有序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者与该碱基序列有70%以上的同源性并可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0154]此外，在耐热菌类中，在鉴定、检测属于丝衣霉属的菌类时，优选为使用含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，更优选为使用含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者与该碱基序列有70%以上的同源性并可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0155]在鉴定、检测属于篮状菌属的菌类时，优选为使用含有序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，更优选为使用含有序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者与该碱基序列有70%以上的同源性并可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号3~11或者57~78中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0156]在鉴定、检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉时，优选为使用含有序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，更优选为使用含有序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者与该碱基序列有70%以上的同源性并可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号12~15、22、23或者40~50中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0157]在鉴定、检测属于半内果菌属的菌类时，优选为使用含有序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有与序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，更优选为使用含有序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者与该碱基序列有70%以上的同源性并可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸，最优选为使用含有序列号16~21或者51~56中任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸。
[0158]这些检测用寡核苷酸可以作为核酸探针使用。核酸探针可以通过用标记物标记上述寡核苷酸而制备。上述标记物没有特别的限定，可以使用放射性物质、酶、荧光物质、发光物质、抗原、半抗原、酶底物、不溶性载体等通常的标记物。标记方法，既可以是末端标记，也可以是在序列的途中标记，此外，也可以是在糖、磷酸基、碱基部分上的标记。上述核酸探针与耐热菌类的 β_微管蛋白基因或者28S rDNA的可变区的一部分进行特异性杂交，因此可以迅速并简便地检测出被检测体中的耐热菌类。所涉及的标记的检测方法，可以列举例如在用放射性同位素对核酸探针进行标记时放射自显影等，用荧光物质标记时用荧光显微镜等，用化学发光物质标记时使用感光胶卷解析或者使用CCD照相机的数码解析等。
[0159]用通常的方法将经过这样标记化的本发明的检测用寡核苷酸与从检测对象物中提取的核酸在严格条件下杂交之后，可以通过测定经杂交的检测用寡核苷酸的标记来检测耐热菌类。这里，作为严格条件，可以列举上述的条件。此外，作为测定经过与核酸杂交的核酸探针的标记的方法，可以使用通常的方法(FISH法、点杂交(dot blot)法、DNA杂交(southern blot)法、RNA 杂交(northern blot)法等)。
[0160]另外，本发明中所用的检测用寡核苷酸，可以和固相载体结合而作为捕捉探针使用。此时，可以通过联合捕捉探针和标记核酸探针来进行夹心杂交(sandwich assay),也可以对目标核酸进行标记并捕捉。
[0161]举一个本发明的检测用寡核苷酸用于核酸探针时的检测方法的例子。
[0162]例如在检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉时，可以标记下述(I)~(W)的寡核苷酸并作为核酸探针。如下所述的由下述(I)~(O)的寡核苷酸所组成的核酸探针与属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的β_微管蛋白基因的可变区的一部分特异性杂交，因此可以迅速且简便地检测出属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉。此外，由下述(V)以及/或者(w)的寡核苷酸组成的核酸探针，虽然可以与烟曲霉的β_微管蛋白基因的可变区的一部分特异性杂交，但是不能和属于新萨托菌属的菌类的DNA以及RNA杂交。因此，通过确认这些寡核苷酸是否进行杂交，就可以迅速且简便地鉴别被检测体的菌类是属于新萨托菌属的菌类还是烟曲霉。
[0163]在本发明的检测方法中，为了使用含有上述本发明的可变区的碱基序列的核酸对耐热菌类进行鉴定，其优选形式是对由上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸中的一部分或者全部区域组成的核酸进行基因扩增，确认是否存在扩增产物。此时，上述本发明的检测用寡核苷酸，可以作为核酸引物以及核酸引物对使用，优选范围也同样。其中，优选为可以与下述区域进行杂交的寡核苷酸作为核酸引物使用，其中，该区域为上述(I)或者(II)的核酸中的区域，并且满足(I)含有上述耐热菌类的各属所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值(解链温度:melting temperature)大约在55°C~65°C这4个条件。进一步，优选为含有序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有相对于序列号I~23或者36~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性的碱基序列的寡核苷酸，并且能够用于耐热菌类检测的作为核酸引物使用，更优选为含有序列号I~23或者36~78任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有相对于该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序 列的寡核苷酸作为核酸引物使用，最优选为含有序列号I~23或者36~78任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用。
[0164]更详细地，在鉴定、检测属于丝衣霉属的菌类时，优选为对由上述(A-1)或者(A-1I)的核酸中的一部分或者全部区域组成的核酸进行基因扩增，确认是否存在扩增产物。此时，优选为可以与下述区域进行杂交的寡核苷酸作为核酸引物使用，其中，该区域为上述(A-1)或者(A-1I)的核酸中的区域，并且满足(I)含有属于丝衣霉属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65°C这4个条件。其中，优选为含有序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有相对于序列号1、2或者36~39中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，更优选为含有序列号1、2或者36~39任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者相对于该碱基序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，最优选为含有序列号1、2或者36~39任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用。
[0165]在鉴定、检测属于篮状菌属的菌类时，优选为对由上述(B-1)或者(B-1I)的核酸中的一部分或者全部区域组成的核酸进行基因扩增，确认是否存在扩增产物。此时，优选为可以与下述区域进行杂交的寡核苷酸作为核酸引物，其中，该区域为上述(B-1)或者(B-1I)的核酸中的区域，并且满足(I)含有属于篮状菌属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65°C这4个条件。其中，优选为含有序列号3~11或者57~78任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有相对于序列号3~11或者57~78任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，更优选为含有序列号3~11或者57~78任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸,或者相对于该碱基序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，最优选为含有序列号3~11或者57~78任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用。
[0166]在鉴定、检测属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉时，优选为对由上述(C-1)或者(C-1I)的核酸中的一部分或者全部区域组成的核酸进行基因扩增，确认是否存在扩增产物。此时，优选为可以与下述区域进行杂交的寡核苷酸作为核酸引物使用，其中，该区域为上述(C-1)或者(C-1I)的核酸中的区域，并且满足(I)含有属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65°C这4个条件。其中，优选为含有序列号12~15、22、23或者40~50任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有相对于序列号12~15、22、23或者40~50任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，更优选为含有序列号12~15、22,23或者40~50任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者相对于该碱基序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，最优选为含有序列号12~15、22、23或者40~50任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用。
[0167]在鉴定、检测属于半内果菌属的菌类时，优选为对由上述(D-1)或者(D-1I)的核酸中的一部分或者全部区域组成的核酸进行基因扩增，确认是否存在扩增产物。此时，优选为可以与下述区域进行杂交的寡核苷酸作为核酸引物使用，其中，该区域为上述(D-1)或者(D-1I)的核酸中的区域，并且满足(I)含有属于半内果菌属的菌类所固有的基因的碱基序列以大约10个碱基连续出现的区域，(2)寡核苷酸的GC含量大约在30%~80%，(3)寡核苷酸的自退火的可能性低，(4)寡核苷酸的Tm值大约在55°C~65°C这4个条件。其中，优选为含有序列号16~21或者51~56任一个所记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，或者含有相对于序 列号16~21或者51~56任一个所记载的碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，更优选为含有序列号16~21或者51~56任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者相对于该碱基序列具有70%以上的同源性并且作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用，最优选为含有序列号16~21或者51~56任一个所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物使用。
[0168]作为含有本发明的可变区的碱基序列的核酸的扩增方法，没有特别限制，可以使用 PCR (Polymerase Chain Reaction)法、LCR (Ligase Chain Reaction)法、SDA (StrandDisplacement Amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification)法、RCA (Rolling-circle amplification) 法、LAMP (Loop mediated isothermalamplification)法等通常的方法。但是，本发明中，从迅速性以及简便性的观点来看，优选使用如后所述的PCR法或者LAMP法。
[0169]本发明的核酸引物，既可以将上述的本发明的检测用寡核苷酸直接作为核酸引物使用，也可以用标记物将上述寡核苷酸标记后作为核酸引物使用。标记物以及标记方法的例子，可以列举与核酸探针时同样的例子。
[0170]本发明的检测方法中，上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸的扩增反应，优选为用聚合酶链反应(PCR)法进行。[0171]以下，对使用PCR法的本发明的检测方法进行详细的说明。
[0172]利用PCR法对属于丝衣霉属的菌类进行鉴定、检测时，优选为使用下述(a)~(b)的寡核苷酸作为核酸引物，更优选为使用下述(al)~(bl)的寡核苷酸作为核酸引物，最优选为使用含有序列号I以及2所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物。此外，优选为使用下述(a)以及(b)的寡核苷酸作为核酸引物对，更优选为使用下述(al)以及(bl)的寡核苷酸作为核酸引物对，最优选为使用含有序列号I以及2所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物对。
[0173](a)含有序列号I所记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列有70%以上同源性且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0174](b)含有序列号2所记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列有70%以上同源性且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0175](al)含有序列号I所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列有70%以上同源性且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0176](bl)含有序列号2所记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列有70%以上同源性且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。
[0177]上述(a)以及(b)的寡核苷酸是可以和属于丝衣霉属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区特异地杂交的寡核苷酸。因此，通过使用上述的寡核苷酸，就可以特异地迅速且简便地检测出上述属于丝衣霉属的菌类。
[0178]序列号I以及序列号2所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸是与存在于β -微管蛋白基因区域并属于丝衣霉属的菌类的特异的碱基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。含有序列号I以及序列号2所记载的碱基序列的寡核苷酸，可以和属于丝衣霉属的菌类的DNA以及RNA的一部分进行特异地杂交。
[0179]以雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)为例,对属于丝衣霉属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区的进行详细地说明。如上所述，Byssochlamys nivea的β_微管蛋白基因的部分碱基序列用序列号24表示。其中，本发明人发现，属于丝衣霉属的菌类的β_微管蛋白基因的部分碱基序列的从第20位到第175位的区域在真菌的属之间，碱基序列的保守性特别低，是具有属固有的碱基序列的区域。
[0180]上述(a)以及(b)的寡核苷酸是序列号24所记载的碱基序列中，分别对应于第33位到第52位、第159位到第178位的区域。因此，通过将上述寡核苷酸与属于丝衣霉属的菌类的β_微管蛋白基因进行杂交，就可以特异地检测出属于丝衣霉属的菌类。
[0181] 在利用PCR法进行属于篮状菌属的菌类的鉴定、检测时，优选为使用下述(C)~(k)中任一个寡核苷酸作为核酸引物，更优选为使用下述(Cl)~(kl)中任一个寡核苷酸作为核酸引物，最优选为使用含有序列号3~11所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物。此外，优选为使用下述(c)以及(d)的寡核苷酸对、下述(e)以及(f)的寡核苷酸对、下述(g)以及(h)的寡核苷酸对、下述(i)以及(h)的寡核苷酸对、或者下述(j)以及(k)的寡核苷酸对作为核酸引物对，更优选为使用下述(Cl)以及(dl)的寡核苷酸对、下述(el)以及(fl)的寡核苷酸对、下述(gl)以及(hi)的寡核苷酸对、下述(il)以及(hi)的寡核苷酸对、或者下述(jl)以及(kl)的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为使用含有序列号3以及序列号4记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号5以及序列号6记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号7以及序列号8记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号9以及序列号8记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号10以及序列号11记载的碱基序列的寡核苷酸对作为核酸引物对。
[0182]此外，从检测特异性以及检测灵敏度的角度来看，优选为使用下述(i)以及(h)所示的寡核苷酸对、或者下述(j)以及(k)所示的寡核苷酸对作为核酸引物对，优选为使用下述(il)以及(hi)所示的寡核苷酸对、或者下述(jl)以及(kl)所示的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为使用序列号9以及序列号8所记载的碱基序列表示的寡核苷酸对、或者序列号10以及序列号11所记载的碱基序列表示的寡核苷酸对作为核酸引物对。
[0183](c)含有序列号3中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0184](d)含有序列号4中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；[0185](e)含有序列号5中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0186](f)含有序列号6中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0187](g)含有序列号7中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0188](h)含有序列号8中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0189](i)含有序列号9中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0190](j)含有序列号10中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0191](k)含有序列号11中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0192](Cl)含有序列号3中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0193](dl)含有序列号4中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；[0194](el)含有序列号5中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0195](fl)含有序列号6中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0196](gl)含有序列号7中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0197](hi)含有序列号8中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0198](il)含有序列号9中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0199]( jl)含有序列号10中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0200](kl)含有序列号11中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。
[0201]通过利用上述(C)以及(d)的寡核苷酸对，可以特异地检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)。此外，通过利用上述(e)以及(f)的寡核苷酸对或者上述 (j)以及(k)的寡核苷酸对，可以特异地检测出藤黄篮状菌(Talaromyces luteus),沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),杆孢篮状菌(Talaromyces bacillisporus)。另外，通过利用上述(g)以及(h)的寡核苷酸对，可以特异地检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus),沃特曼篮状菌(Talaromyceswortmannii)，糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)，大抱篮状菌(Talaromycesmacrosporus)。另外，通过利用上述(i)以及(h)的寡核苷酸对,可以特异地检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus),大抱篮状菌(Talaromyces macrosporus)。
[0202]上述(C)~(k)的寡核苷酸是与属于篮状菌属的菌类的β_微管蛋白基因或者28SrDNA的D1/D2区域以及ITS区域的可变区特异性杂交的寡核苷酸。因此，通过利用上述寡核苷酸对，可以特异地迅速并且简便地检测出上述属于篮状菌属的菌类。
[0203]序列号3以及序列号4所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸，是与存在于β -微管蛋白基因区域，属于篮状菌属的菌类内的黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)特异的碱基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。序列号5~6以及序列号10~11所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸,是与存在于β_微管蛋白基因区域，属于篮状菌属的菌类内的藤黄篮状菌(Talaromyces luteus),沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),杆抱篮状菌(Talaromyces bacillisporus)特异的喊基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。序列号7~8以及序列号9所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸，是与存在于28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域，属于篮状菌属的菌类内的黄色篮状菌(Talaromyces flavus),沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),糙抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus),大抱篮状菌(Talaromyces macrosporus)特异的碱基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。因此，含有序列号3~11中所记载的碱基序列的寡核苷酸，可以和属于篮状菌属的菌类的DNA以及RNA的一部分特异性地杂交。[0204]对属于篮状菌属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区域以黄色篮状菌(Talaromyces flavus)和藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)为例进行详细说明。如上所述，黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的β _微管蛋白基因的部分碱基序列用序列号26表示,藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的β _微管蛋白基因的部分碱基序列用序列号27表示。其中，本发明人发现,黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的部分碱基序列的可变区在从第10位到第40位的区域，以及从第70位到第100位的区域是与黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)有特别高的保守性的序列，与其他真菌没有类似序列的区域。另外，本发明人发现，藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的β _微管蛋白基因的部分碱基序列的可变区在从第120位到第160位的区域以及从第295位到第325位的区域是与在基因上近缘的藤黄篮状菌(Talaromyces luteus),沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),杆抱篮状菌(Talaromyces bacillisporus)有特别高的保守性的序列，与其他真菌没有类似序列的区域。
[0205]上述(C)以及(d)的寡核苷酸，在序列号26所记载的碱基序列中，分别对应于从第15位到第34位、从第76位到第98位的可变区。上述(e)以及(f)和上述(j)以及(k)的寡核苷酸，在序列号第27所记载的碱基序列中，分别对应于从第133位到第153位、从第304位到第325位的可变区。因此，通过将上述寡核苷酸与属于篮状菌属的菌类的β_微管蛋白基因进行杂交，就可以检测出属于篮状菌属的菌类。
[0206]对属于篮状菌属的菌类的28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的可变区域以沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)为例进行详细说明。如上所述，沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的部分喊基序列用序列号28表示。其中，本发明人发现属于篮状菌属的菌类的28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的部分碱基序列的从第300位到第350位，以及从第450位到第510位的区域是与沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)，糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)，黄色篮状菌(Talaromyces flavus),大孢篮状菌(Talaromyces macrosporus)有特别高的保守性的序列，与其他真菌没有类似序列的区域。
[0207]上述(g)、(h)以及(i)的寡核苷酸，在序列号28所记载的碱基序列中，分别对应于从第326位到第345位、从第460位到第478位的可变区。因此，通过将上述寡核苷酸与属于篮状菌属的菌类的28SrDNA的D1/D2区域以及ITS区域杂交，就可以检测出属于篮状菌属的菌类。
[0208]在用PCR法对属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉进行鉴定、检测时，优选为使用下述(I)~(O)以及(V)~(W)的寡核苷酸作为核酸引物，更优选为使用下述(11)~(ol)以及(vl)~(wl)的寡核苷酸作为核酸引物,最优选为使用含有序列号12~15以及22~23所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物。此外，优选为使用下述(I)以及(m)的寡核苷酸对、下述(η)以及(ο)的寡核苷酸对、或者下述(V)以及(w)的寡核苷酸对作为核酸引物对，更优选为使用下述(11)以及(ml)的寡核苷酸对、下述(nl)以及(ol)的寡核苷酸对、或者下述(vl) 以及(《1)的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为使用含有序列号12以及序列号13记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号14以及序列号15记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号22以及序列号23记载的碱基序列的寡核苷酸对作为核酸引物对。
[0209]其中，为了检测出属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉，优选为利用下述(I)以及(m)的寡核苷酸对或者下述(η)以及(ο)的寡核苷酸对作为核酸引物对，更优选为利用下述
(11)以及(ml)的寡核苷酸对或者下述(nl)以及(ol)的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为利用含有序列号12以及序列号13记载的碱基序列的寡核苷酸对和含有序列号14以及序列号15记载的碱基序列的寡核苷酸对作为核酸引物对。特别是，在检测属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉时，从检测特异性以及检测灵敏度的角度来看，优选为使用下述的(η)以及(ο)所表示的寡核苷酸对为核酸引物对，更优选为使用下述的(nl)以及(ol)所表示的寡核苷酸对为核酸引物对，最优选为使用含有序列号14以及序列号15记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对为核酸引物对。
[0210]此外，为了检测出烟曲霉，优选为使用下述的(V)以及(W)所表示的寡核苷酸对为核酸引物对，更优选为使用下述的(vl)以及(《1)所表示的寡核苷酸对为核酸引物对，最优选为使用含有序列号22以及序列号23记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对为核酸引物对。
[0211](I)含有序列号12中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0212](m)含有序列号13中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0213](η)含有序列号14中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0214](ο)含有序列号15中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0215](V)含有序列号22中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0216](w)含有序列号23中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0217](11)含有序列号12中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0218](ml)含有序列号13中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0219](nl)含有序列号14中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0220](ol)含有序列号15中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0221](vl)含有序列号22中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0222](wl)含有序列号23中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。
[0223]上述(I)以及(m)的寡核苷酸对和上述(η)以及(O)的寡核苷酸对，特别适用于检测费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri),刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa),光滑新萨托菌(Neosartorya glabra),平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae) ,Neosartoryapaulistensis,假费希尔新萨托菌(Neosartorya peudofischeri)等属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉。此外，上述(V)以及(W)的寡核苷酸对，适用于检测烟曲霉。
[0224]上述(I)~(O)的寡核苷酸是与属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的β_微管蛋白基因的可变区特异地 杂交的寡核苷酸。因此，通过利用上述(I)~(O)的寡核苷酸，就可以特异地迅速并且简便地检测出上述属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉。
[0225]序列号12~15记载的碱基序列所表示的寡核苷酸，是与存在于β -微管蛋白基因区域，费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri),刺抱新萨托菌(Neosartorya spinosa),光滑新萨托菌(Neosartorya glabra),平塚新萨托菌(Neosartorya hiratsukae),Neosartorya paulistensis,假费希尔新萨托菌(Neosartorya peudofischeri)等属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的特异性碱基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。这些寡核苷酸，可以和属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的DNA以及RNA的一部分进行特定地杂父。
[0226]对属于新萨托菌属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区域以光滑新萨托菌(Neosartorya glabra)为例进行详细说明。如上所述，光滑新萨托菌(Neosartoryaglabra)的β _微管蛋白基因的部分碱基序列用序列号32表示。其中，本发明人发现，属于新萨托菌属的菌类的β_微管蛋白基因的部分碱基序列的从第I位到第110位的区域、从第140位到第210位的区域、以及从第350位到第380位的区域在真菌之间碱基序列的保守性特别低，具有取决于属间所固有的碱基序列。此外，烟曲霉的β_微管蛋白基因的部分碱基序列用序列号33表示。其中，本发明人发现，烟曲霉的β_微管蛋白基因的部分碱基序列的从第I位到第110位的区域、从第140位到第210位的区域、以及从第350位到第380位的区域在真菌之间喊基序列的保守性特别低，具有取决于种间固有的喊基序列。
[0227]上述(I)以及(m)的寡核苷酸，在序列号32记载的碱基序列中，分别对应于从第84位到第103位、从第169位到第188位的区域，在序列号33记载的碱基序列中，分别对应于从第83位到第102位、从第166位到第186位的区域。上述(η)以及(ο)的寡核苷酸，在序列号32记载的碱基序列中，分别对应于从第144位到第163位、从第358位到第377位的区域，在序列号33记载的碱基序列中，分别对应于从第141位到第160位、从第356位到第376位的区域。因此，通过将上述寡核苷酸与属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的β_微管蛋白基因杂交，就可以特异地检测出属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉。
[0228]上述(V)以及(W)的寡核苷酸是与烟曲霉的微管蛋白基因的可变区特异地杂交的寡核苷酸。
[0229]序列号22以及序列号23记载的碱基序列所表示的寡核苷酸，是与存在于β -微管蛋白基因区域，烟曲霉的特异的碱基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。因此，含有序列号22~23记载的碱基序列的寡核苷酸，可以和烟曲霉的DNA以及RNA的一部分进行特定的杂交，但是不能和属于新萨托菌属的菌类的DNA以及RNA进行杂交。
[0230]对于烟曲霉的β -微管蛋白基因的其他的可变区进行说明。本发明人发现序列号33中记载的烟曲霉的β_微管蛋白基因的部分碱基序列的从第20位到第50位的区域、以及从第200位到第230位的区域在真菌，特别是属于新萨托菌属的菌类之间的碱基序列的保守性很低。
[0231]上述(V)以及(W)的寡核苷酸，在序列号33记载的碱基序列中，分别与从第23位到第44位、从第200位到第222位的区域对应。上述寡核苷酸可以和烟曲霉的β-微管蛋白基因进行杂交，但是不能和属于新萨托菌属的菌类的DNA以及RNA杂交。基于图1对此进行详细说明。图1是序列号33以及83~86所记载的烟曲霉，费希尔新萨托菌(Neosartoryafischeri)以及刺孢新萨托菌(Neosartorya spinosa)的β _微管蛋白基因的碱基序列的一部分的比较图。如图1所示，将烟曲霉的β_微管蛋白基因中序列号22以及23的寡核苷酸所识别的区域，和此区域相对应的属于新萨托菌属的菌类的β_微管蛋白基因的区域进行比较，就可以明白碱基序列的同源性与其他区域相比非常低。因此，通过利用上述(V)以及(w)的寡核苷酸，就可以识别被检测体中含有的菌类是属于新萨托菌属的菌类还是烟曲霉。
[0232]例如，将上述(I)以及(m)的寡核苷酸对或者上述(η)以及(O)的寡核苷酸对作为核酸引物使用进行核酸扩增处理，通过确认扩增，就可以检测出属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉。为了检测出食品事故中特别造成问题的属于新萨托菌属的菌类，对通过利用上述方法检测出这些菌的试样，再将上述(V)以及(W)的寡核苷酸对用作核酸引物进行核酸扩增处理，通过确认扩增 ，就可以检测出是属于新萨托菌属的菌类还是烟曲霉。
[0233]此外，在本发明中，在用上述(I)~(O)的寡核苷酸的检测方法呈阳性反应的试样中，可以通过利用属于新萨托菌属的菌类和烟曲霉的可以生长温度带的不同，或者通过利用上述(V)以及/或者(W)的寡核苷酸，对该试样中含有的菌种进行识别、检测。
[0234]属于新萨托菌属的菌类的可以生长温度的上限约为45°C。相对于此，烟曲霉在50°C以上也可以生长。利用可以生长温度带的不同，例如通过进行以下的操作就可以进行菌种检测。但是，本发明并不限定于此。
[0235]对于用本发明的上述(I)~(O)的寡核苷酸的检测方法呈阳性反应的试样，从单菌落将菌丝体接种到PDA培养基或者PDB培养基(马铃薯葡萄糖液体培养基)，在48~52°C进行培养。培养I~2天后，确认菌丝体的伸长。接着，根据上述可以生长温度带的不同，被确认为增殖的情况可以鉴定为烟曲霉，不能被确认增殖的情况可以鉴定为属于新萨托菌属的菌类。此外，增殖的确认方法并没有特别限制，可以列举通过实体显微镜确认菌丝体的伸长、液体培养基中菌丝体的伸长、菌块的形成、分生孢子的形成。
[0236]在利用PCR法进行属于半内果菌属的菌类的鉴定、检测时，优选为使用下述(P)~(U)的寡核苷酸作为核酸引物，更优选为使用下述(pi)~(ul)的寡核苷酸作为核酸引物，最优选为使用含有序列号16~21所记载的碱基序列的寡核苷酸作为核酸引物。此外，优选为使用下述(P)以及(q)的寡核苷酸对、下述(r)以及(S)的寡核苷酸对、或者下述(t)以及U)的寡核苷酸对作为核酸引物对，更优选为使用下述(pi)以及(ql)的寡核苷酸对、下述(rl)以及(Si)的寡核苷酸对、或者下述(tl)以及(ul)的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为使用含有序列号16以及序列号17记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号18以及序列号19记载的碱基序列的寡核苷酸对、含有序列号20以及序列号21记载的碱基序列的寡核苷酸对作为核酸引物对。
[0237]特别地，从检测特异性的角度来看，优选为使用下述的(r)以及(S)所表示的寡核苷酸对、或者下述的(t)以及(U)所表示的寡核苷酸对作为核酸引物对，更优选为使用下述的(rl)以及(Si)所表示的寡核苷酸对、或者下述的(tl)以及(ul)所表示的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为使用序列号18以及序列号19记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对、或者序列号20以及序列号21记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对为核酸引物对。从检测灵敏度的角度来看，优选为使用下述的(t)以及(U)所表示的寡核苷酸对作为核酸引物对，更优选为使用下述的(tl)以及(ul)所表示的寡核苷酸对作为核酸引物对，最优选为使用序列号20以及序列号21记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对为核酸引物对。
[0238](P)含有序列号16中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0239](q)含有序列号17中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0240](r)含有序列号18中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0241](s)含有序列号19中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0242](t)含有序列号20中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0243](u)含有序列号21中记载的碱基序列或者其互补序列，或者与该碱基序列或者其互补序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0244](pi)含有序列号16中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0245](ql)含有序列号17中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0246](rl)含有序列号18中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0247](Si)含有序列号19中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0248] (tl)含有序列号20中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸；
[0249](Ul)含有序列号21中记载的碱基序列的寡核苷酸，或者含有与该碱基序列具有70%以上的同源性并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列的寡核苷酸。
[0250]通过使用上述(P)以及(q)所表示的寡核苷酸对、上述(r)以及(S)所表示的寡核苷酸对、以及上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸对，就可以特异地检测出榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)，条纹钩囊菌(Hamigera striata)。
[0251]上述(P)~(U)的寡核苷酸，是与属于半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区进行特异性杂交的寡核苷酸。因此，通过使用上述的寡核苷酸，就可以特异地迅速并且简便地检测出上述属于半内果菌属的菌类。
[0252]序列号16~21记载的碱基序列所表示的寡核苷酸，是与存在于β -微管蛋白基因区域，属于半内果菌属的菌类内的特异的碱基序列，即可变区的一部分互补的寡核苷酸。因此，含有序列号16~21所记载的碱基序列的寡核苷酸，可以与属于半内果菌属的菌类的DNA以及RNA的一部分进行特异性杂交。
[0253]以属于半内果菌属的菌类的β -微管蛋白基因的可变区的榛色钩囊菌(Hamigeraavellanea)为例进行详细地说明。如上所述榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)的β-微管蛋白基因的部分碱基序列用序列号35表示。其中，本发明人发现，属于半内果菌属的菌类的β -微管蛋白基因的部分碱基序列的从第350位到第480位的区域、从第I位到第25位的区域、以及从第180位到第200位的区域，在真菌的属之间碱基序列的保守性特别低，具有取决于属间固有的喊基序列 。
[0254]上述(P)以及(q)的寡核苷酸，在序列号35所记载的碱基序列中，分别对应于从第358位到第377位、从第440位到第459位的区域。上述(r)以及(s)的寡核苷酸，在序列号35所记载的碱基序列中，分别对应于从第2位到第22位、从第181位到第200位的区域。另外，上述(t)以及(U)的寡核苷酸，在序列号35所记载的碱基序列中，分别对应于从第172位到第191位、从第397位到第416位的区域。因此，通过将上述的寡核苷酸与属于半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因进行杂交，就可以特异地检测出属于半内果菌属的菌类。
[0255]此外，如图2所示,与榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)的β_微管蛋白基因的从第358位到第377位以及从第440位到第459位的区域同源性高的区域在芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides)等的属于枝抱霉(Cladosporium)属的菌类的 β -微管蛋白基因中也存在。但是，与榛色钩囊菌(Hamigera avellanea)的β_微管蛋白基因的从第181位到第200位的区域同源性高的区域在属于枝孢霉属的菌的β_微管蛋白基因中不存在。因此，通过使用上述(P)~(U)的寡核苷酸的组合，就可以检测出属于半内果菌属的菌类和属于枝孢霉属的菌类。
[0256]即，上述(s)、(t)、以及(U)的寡核苷酸，可以和属于半内果菌属的菌类的微管蛋白基因的可变区杂交，但是不能和属于枝孢霉属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区杂交。因此，例如在用上述(P)以及(q)的寡核苷酸的检测方法中呈阳性反应的试样，通过利用上述(r)以及(S)的寡核苷酸以及/或者上述(t)以及(U)的寡核苷酸就可以鉴别该试样中所含的菌种是属于半内果菌属还是属于枝孢霉属。
[0257]此外，“属于枝孢霉属的菌类”是丝状半知菌类，不形成耐热性高的子囊孢子。而且，广泛分布于居住环境或者食品加工厂等地，由于合成黑色素，是黑色污染的原因菌。属于枝孢霉属的菌类的例子，可以列举芽枝状枝孢(Cladosporium cladosporioides),球孢枝抱(Cladosporium sphaerospermum)。
[0258]PCR反应的条件，只要能够将目标DNA片段扩增至能够检出的程度，就没有特别的限制。作为PCR的反应条件的优选的一个例子，在检测属于丝衣霉属的菌类时，例如，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95~98°C进行10~60秒，引物对与单链DNA杂交的退火反应在59~61°C进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C进行约60秒，这些构成的一个循环进行约30~35次。在检测属于篮状菌属的菌类时，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95~97°C进行10~60秒，引物对与单链DNA杂交的退火反应在55~61°C进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C进行约60秒，这些构成的一个循环进行约30~35次。在用上述的(I)以及(m)的寡核苷酸或者上述的(η)以及(ο)的寡核苷酸对属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉进行检测时，例如，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95~98°C进行10~60秒，引物对与单链DNA杂交的退火反应在59~61°C进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C进行约60秒，这些构成的一个循环进行约30~35次。在用上述的(V)以及(w)的寡核苷酸对检测是属于新萨托菌属的菌类还是烟曲霉时，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95~98°C进行10~60秒，引物对与单链DNA杂交的退火反应在59~61°C进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C进行约60秒，这些构成的一个循环进行约30~35次。在用上述的(P)以及(q)的寡核 苷酸对属于半内果菌属的菌类进行检测时，例如，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95~98°C进行10~60秒，引物对与单链DNA杂交的退火反应在59~63°C进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C进行约60秒，这些构成的一个循环进行约30~35次。在用上述的(r)以及(s)的寡核苷酸或者上述的(t)以及(U)的寡核苷酸对属于半内果菌属的菌类进行检测时，例如，使双链DNA变成单链DNA的热变性反应在95~98°C进行10~60秒，引物对与单链DNA杂交的退火反应在59~63°C进行约60秒，在DNA聚合酶的作用下的延伸反应在约72°C进行约60秒，这些构成的一个循环进行约30~35次。
[0259]在本发明中，基因片段的扩增的确认可以用通常的方法进行。例如可以列举在基因扩增反应时将结合有放射性物质等标记的核苷酸加入的方法，将PCR反应产物进行电泳以确认是否具有与经扩增的基因产物的大小相对应的条带的方法，解读PCR反应产物的碱基序列的方法，在经扩增的DNA双链之间加入荧光物质使其发光的方法等，但本发明并不限定于这些方法。在本发明中，优选为基因扩增处理后进行电泳，以确认是否具有与经扩增的基因的大小相对应的条带的方法。
[0260]序列号24所记载的碱基序列中，从第33位到第178位的碱基数为146个碱基。因此，在被检测体中含有属于丝衣霉属的菌类时，用上述(a)以及(b)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出属于丝衣霉属的菌类的特异的约150bp的DNA片段的扩增。通过此操作，就可以检测、鉴别属于丝衣霉属的菌类。
[0261]序列号26所记载的碱基序列中，从第15位到第98位的碱基数是83个碱基，序列号27所记载的碱基序列中从第133位到第325位的碱基数是192个碱基。此外，序列号28所记载的碱基序列中，从第326位到第478位的碱基数是152个碱基。因此，在被检测体中含有属于黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及/或者糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus)时,用上述(C)以及(d)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应,将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约SObp的DNA片段的扩增。另外，在被检测体中含有藤黄篮状菌(Talaromyces Iuteus),沃特曼篮状菌(Talaromyceswortmannii)以及/或者杆孢篮状菌(Talaromyces baciIIisporus)时，用上述(e)以及CO的寡核苷酸对或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约200bp的DNA片段的扩增。此外，在被检测体中含有大孢篮状菌(Talaromyces macrosporus),沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及 / 或者糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)时,用上述(g)以及(h)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约150bp的DNA片段的扩增。在被检测体中含有大孢篮状菌(Talaromyces macrosporus),黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及 / 或者糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)时，用上述(i )以及(h)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约150bp的DNA片段的扩增。通过此操作，就可以检测、鉴别属于篮状菌属的菌类。此外，在被检测体中含有沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)时，同时用上述(e)以及(f)的寡核苷酸对或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸对，以及上述(g)以及(h)的寡核苷酸对，就可以确认出约200bp和约150bp的2条条带。
[0262]被检测体中含有属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉时，用上述(I)以及(m)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约IOObp的DNA片段的扩增。另外，用上述(η)以及(ο)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约200bp的DNA片段的 扩增。通过此操作，就可以检测、鉴别属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉。
[0263]另外，被检测体中含有烟曲霉时，用上述(V)以及(W)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约200bp的DNA片段的扩增。但是，在含有属于新萨托菌属的菌类时，即使用上述(V)以及(w)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，也确认不了 DNA片段的扩增。因此，利用上述(V)以及(w)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，就可以唯一地检测出烟曲霉。
[0264]有关基因扩增的确认，在用上述(P)以及(q)所表示的寡核苷酸对时，在序列号35所记载的碱基序列中，从第358位到第459位的碱基数是约100个碱基。因此，被检测体中含有属于半内果菌属的菌类时，用上述(P)以及(q)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出这些菌类的特异的约IOObp的DNA片段的扩增。
[0265]在序列号35所记载的碱基序列中，从第2位到第200位的碱基数是约200个碱基。此外，用上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸对时，在序列号35所记载的碱基序列中，从第172位到第416位的碱基数是245个碱基。因此，在被检测体中含有属于半内果菌属的菌类时，用上述(r)以及(s)的寡核苷酸对或者上述(t)以及(U)的寡核苷酸对作为引物组合进行PCR反应，将得到的PCR反应产物进行电泳，就可以确认出此菌类的特异的约200bp或者约240bp的DNA片段的扩增。通过此操作，就可以检测、鉴别属于半内果菌属的菌类。
[0266]在本发明的检测方法中，优选形式为同时使用:利用上述(c)以及(d)的寡核苷酸对、上述(g)以及(h)的寡核苷酸对、或者上述(i)以及(h)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(e)以及(f)的寡核苷酸对或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸对的检测方法，来进行属于篮状菌属的菌类的检测。通过组合使用多个寡核苷酸对，可以全面的检测出属于篮状菌属的菌类。其中，更优选为组合使用:利用上述(Cl)以及(dl)的寡核苷酸对、上述(gl)以及(hi)的寡核苷酸对、或者上述(il)以及(hi)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(el)以及(fl)的寡核苷酸对或者上述(jl)以及(kl)的寡核苷酸对的检测方法。最优选为组合使用:利用序列号3以及4记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对、序列号7以及8记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对、或者序列号9以及8记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法；和序列号5以及6记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对、或者序列号10以及11记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法。[0267]具体地，如上所述通过利用(C)以及(d)的寡核苷酸对，就可以特异地检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)。另外，通过利用(e)以及(f)、或者(j)以及(k)的寡核苷酸对，就可以特异地检测出沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),藤黄篮状菌(Talaromyces Iuteus),杆孢篮状菌(Talaromyces bacillisporus)。此外,通过利用(g)以及(h)的寡核苷酸对,就可以特异地检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus),沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)，大抱篮状菌(Talaromyces macrosporus)。另外，通过利用(i)以及(h)的寡核苷酸对,就可以特异地检测出黄色篮状菌(Talaromycesflavus),糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus),大抱篮状菌(Talaromycesmacrosporus)。因此,通过组合使用:上述(c)以及(d)的寡核苷酸对、上述(g)以及(h)的寡核苷酸对、或者上述(i)以及(h)的寡核苷酸对；和上述(e)以及(f)的寡核苷酸对或者上述(j)以及(k)的寡核苷酸，就可以全面检测出食品事故中特别引起问题的属于篮状菌属的菌类。
[0268]特别是，从检测灵敏度的角度，优选为组合使用:利用上述(i)以及(h)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(j)以及(k)的寡核苷酸对的检测方法，更优选为组合使用:利用上述(il)以及(hi)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(jl)以及(kl)的寡核苷酸对的检测方法，最优选为组合使用:利用序列号9以及8记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法；和利用序列号10以及11记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法。
[0269]另外，在本发明中，“同时使用进行基因扩增处理工序”是指，将2组寡核苷酸对混合，混合后作为引物添加到I个反应体系中进行上述的基因扩增处理工序。通过同时使用2组寡核苷酸对，可以更加迅速并且全面的检测出属于篮状菌属的菌类。2组寡核苷酸对的混合比例没有特别限定，优选为1:1~1:2。
[0270]在本发明的检测方法中，组合使用:利用上述(I)以及(m)所表示的寡核苷酸对以及/或者上述(η)以及(O)所表示的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(V)以及(W)所表示的寡核苷酸对的检测方法也是一种优选形式。如上所述，由于利用上述(I)以及(m)所表示的寡核苷酸对、上述(η)以及(ο)所表示的寡核苷酸对的检测方法可以检测出属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉，利用上述(V)以及(w)所表示的寡核苷酸对的检测方法可以检测出烟曲霉，通过组合这些方法就可以鉴别出从被检测体中检测的菌类是属于新萨托菌属的菌类还是烟曲霉。其中，更优选为组合使用:利用上述(11)以及(ml)所表示的寡核苷酸对以及/或者上述(nl)以及(ol)所表示的寡核苷酸对的检测方法；和上述(Vl)以及(wl)所表示的寡核苷酸对的检测方法，最优选为组合使用:利用序列号12以及13记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对以及/或者序列号14以及15记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法；和序列号22以及23记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法。
[0271]特别是，从检测灵敏度的角度，优选为组合使用:利用上述(η)以及(O)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(V)以及(W)的寡核苷酸对的检测方法，更优选为组合使用:利用上述(nl)以及(ol)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(Vl)以及(wl)的寡核苷酸对的检测方法，最优选为组合使用:利用序列号14以及15记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法；和利用序列号22以及23记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法。
[0272]在本发明的检测方法中，组合使用:利用上述(P)以及(q)所表示的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(r)以及(s)所表示的寡核苷酸对或者利用上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸对的检测方法也是一种优选形式。通过这些方法的组合可以从被检测体中特异地检测出仅属于半内果菌属的菌类。即，通过组合这些方法就可以鉴别出从被检测体中检测的菌类是属于半内果菌属还是属于枝孢霉属。由于属于半内果菌属的菌类不产生真菌毒素(霉菌毒素)，根据检测出属于两个属中的哪个就可能预测真菌毒素的危险性。此外，两个属的耐热性不同，通过检测出属的不同，可以预测出菌体的混入是否在加热前，从而就可以用于进行重新进行灭菌工序或者确认容器的密封性等的原因调查。其中，更优选为组合使用:利用上述(Pl)以及(ql)的寡核苷酸对的检测方法；和利用上述(rl)以及(Si)的寡核苷酸对或者上述(tl)以及(Ul)所表示的寡核苷酸对的检测方法，最优选为组合使用:利用序列号16以及17记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法；和利用序列号18以及19记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对或者序列号20以及其21记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法。
[0273]特别是，从检测灵敏度的角度，优选为组合使用:利用上述(P)以及(q)的寡核苷酸对的检测方法；与利用上述(t)以及(U)所表示的寡核苷酸对的检测方法，更优选为组合使用:利用上述(Pl)以及(ql)的寡核苷酸对的检测方法与利用上述(tl)以及(Ul)所表示的寡核苷酸对的检测方法，最优选为组合使用:利用序列号16以及17记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法；与利用序列号20以及21记载的碱基序列所表示的寡核苷酸对的检测方法。
[0274]此外，在本发明的检测方法中，上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸的一部分或者全部的扩增用LAMP (Loop mediated isothermal amplification)法进行也是一种优选形式。
[0275]使用LAMP法，由于不需要周期的温度变化控制，可以在恒温下进行互补链合成反应。因此，有简便且迅速检测出检测体中所含有的特定菌类的优点。
[0276]以下，对于使用LAMP法的本发明的检测方法进行详细说明。
[0277]LAMP法是不需要周期温度变化控制的环介导等温扩增法(国际公开第00/28082号小册子)，使引物的3’端在作为模板的核苷酸处退火，成为互补链合成的起点，同时将退火的引物与此时形成的环组合，从而就可能在等温下进行互补链合成反应。在该LAMP法中，至少需要4个识别作为模板的核酸的6个碱基序列区域的引物。这些引物，由于通常被设计成其3’端在作为模板的核酸处退火，通过碱基序列的互补结合而使得校正机理反复起作用，从而可以进行高灵敏度且高特异性的核酸扩增反应。
[0278]LAMP法所用的引物识别的6个碱基序列区域，从作为模板的核苷酸的5’端顺次叫做F3、F2、F1，从3’端顺次叫做B3c、B2c、Blc，此外，F1、F2、F3的互补碱基序列分别叫做Flc, F2c、F3c，Blc、B2c、B3c的互补碱基序列分别叫做B1、B2、B3。
[0279]上述6个碱基序列区域，具体而言，可以用以下方法选择，但是本发明并不限于此。
[0280]首先，用作为检测对象的菌种的碱基序列进行比对(alignment)。为了比对，例如，可以使用Clustal X等的软件。接着，基于得到的比对信息，用Primer Explorer V4(荣研化学株式会社社制)等软件选择上述6个碱基序列区域，设计LAMP法的引物。
[0281]LAMP法所用的引物设计，首先，从要扩增的区域(目的区域)的碱基序列中选定上述6个碱基序列区域，之后，设计下述的内引物F以及B和外引物F以及B。
[0282]LAMP法所用的“内引物”是指，识别目的碱基序列上特定核苷酸序列区域，且在3’端具有提供合成起点的碱基序列，同时在5’端具有相对于以此引物为起点的核酸合成反应产物的任意区域互补的碱基序列的寡核苷酸。其中，含有在3’端具有上述F2区域并且在5’端具有上述Flc区域的喊基序列的引物叫做内引物F (以下，叫做FIP),含有在3’端具有上述B2区域并且在5’端具有上述Blc区域的碱基序列的引物叫做内引物B (以下，叫做BIP)。此内引物，在F2区 域和Flc区域之间，或者在B2区域和Blc区域之间，也可以含有碱基数O~50的任一长度的任意碱基序列。
[0283]另一方面“外引物”是指，具有识别目的碱基序列上的【“某个特定核苷酸序列区域”(例如上述F2区域或者B2区域)的5’末端存在的某个特定的核苷酸碱基序列】且提供合成起点的碱基序列的寡核苷酸，可以列举含有从F3区域选出的碱基序列的引物以及含有从B3区域选出的碱基序列的引物。此处，含有从F3区域选出的碱基序列的引物叫做外引物F (以下，叫做F3引物)，含有从B3区域选出的碱基序列的引物叫做外引物B (以下，叫做B3引物)。
[0284]这里，各个引物中的F是表示，与目标碱基序列的反义链互补结合，并提供合成起点的引物的意思，各个引物中的B是表示，与目标碱基序列的正义链互补结合，并提供合成起点的引物的意思。
[0285]LAMP法中的核酸的扩增，优选为除内引物以及外引物之外，还可以使用环状引物(loop primer)(以下，称为LF，LB)。环状引物是指，在用LAMP法扩增的产物的同一条链上的互补序列互相退火形成环状时，在其3’端含有与这个环内的序列互补的碱基序列的引物(关于构成双链的各条链的每一个)。即，具有与哑铃结构的5’端的环状结构的单链部分的碱基序列互补的碱基序列的引物。用此引物，由于增加了核酸合成的起点，就可以缩短反应时间和提高检测灵敏度(国际公开第02/24902号小册子)。
[0286]环状引物的碱基序列，与上述哑铃结构的5’端的环状结构的单链部分的碱基序列互补的话，可以从目的区域的碱基序列或者其互补链中选择，也可以从其他碱基序列中选择。此外，环状引物可以是I种，也可以是2种。[0287]如果利用上述至少4种以上的引物，扩增目的区域的DNA片段的话，就可能特异地且高效地扩增该DNA片段至可能检测出的量。因此，通过确认扩增产物的有无，就可以检测出特定的菌种。
[0288]在通过用LAMP法的本发明的检测方法来检测耐热菌类时，作为检测用寡核苷酸，在从耐热菌类的β -微管蛋白基因或者28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区的碱基序列所选出的目的区域的5’端，作为碱基序列区域选择F3、F2以及F1，从上述目的区域的3’端，作为碱基序列区域选择B3c、B2c以及Blc，并且将上述B3c、B2c以及Blc的互补碱基序列分别作为B3、B2以及BI，将上述F3、F2以及Fl的互补碱基序列分别作为F3c、F2c以及Flc时，优选为由与下述(i)~(vi)中任一个相当的碱基序列所组成的寡核苷酸。
[0289](i)3’端有上述B2区域，5’端有上述Blc区域的碱基序列；
[0290](ii)含有上述B3区域的喊基序列；
[0291](iii)3’端有上述F2区域，5’端有上述Flc区域的碱基序列；
[0292]( iv)含有上述F3区域的喊基序列；
[0293](V)具有与上述BI区域和上述B2区域之间的部分互补的序列的碱基序列；
[0294](Vi)具有与上述Fl区域和上述F 2区域之间的部分互补的序列的碱基序列。
[0295]上述寡核苷酸，不仅可以作为LAMP法所用的引物，而且还可以作为PCR法的引物、核酸检测用探针等使用。
[0296]本发明可以使用的引物优选为15碱基以上，更优选为20个碱基以上。此外，各引物可以是单一的碱基序列的寡核苷酸，也可以是多个碱基序列的寡核苷酸的混合物。
[0297]本发明中，在用LAMP法检测耐热菌类时，上述的耐热菌类的β_微管蛋白基因或者28S rDNA的D1/D2区域以及ITS区域的可变区，即将上述(A-1)~(D-1I)中任一个核酸的一部分或者全部作为目的区域，扩增含有该需要的DNA片段，然后确认扩增产物的有无。
[0298]通过LAMP法扩增的区域，优选为含有序列号25记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第400~600位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号32记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第10~250位以及/或者第350~559位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号34记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第10~250位以及/或者第350~559位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号35记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第300~550位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号26记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第200~450位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号29记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第150~420位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号27记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第150~450位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号30记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第250~550位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，含有序列号31记载的碱基序列的一部分也就是含有该碱基序列的第250~550位的碱基序列的全部或者一部分的碱基序列，或者含有在这些碱基序列中使一个或者数个碱基缺失、置换或者添加而得到而成的碱基序列。
[0299]接着，对用LAMP法检测上述各个耐热菌类时优选使用的引物以及引物组合进行说明。[0300]为了设计特异检测属于丝衣霉属的菌类的引物，优选为在序列号25记载的碱基序列之中，从序列表的碱基号400~600所包含的范围中选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号36记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号37记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号38记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号39记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0301]用于检测属于丝衣霉属的菌类的引物组合(LBl引物组合)
[0302]LB1F3 引物:CGGTCCTCGAGCGTATGG (序列号 36)
[0303]LB1B3 引物:CCGTTACTGGGGCAATCC (序列号 37)
[0304]LBlFIP 引物:AGTTAGGTGACCGTGAGGTCGTCTTTGTCACGCGCTCTGG (序列号 38)
[0305]LBlBIP 引物:GGATCAGGTAGGGATACCCGCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC (序列号 39)
[0306]在图26中，表示了在丝衣霉属的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的碱基序列中，识别为上述引物的碱基序列的位置关系。
[0307]通过使用这些引物以及引物组合，就可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增属于丝衣霉属的菌类的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检 测体中存在属于丝衣霉属的菌类。
[0308]为了设计特异检测属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的引物，在序列号32以及序列号34记载的碱基序列之中，优选为分别从序列表的碱基号350~559以及序列表的碱基号10~250所包含的范围里选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号40记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、由含有序列号41记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、由含有序列号42记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、由含有序列号43记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0309]用于检测属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的引物组合(LNl引物组合)
[0310]LN1F3 引物:GGCAACATCTCACGATCTGA (序列号 40)
[0311]LN1B3 引物:CCCTCAGTGTAGTGACCCTT (序列号 41)
[0312]LNlFIP 引物:ATGGTACCAGGCTCGAGATCGATACTAGGCCAACGGTGACA (序列号 42)
[0313]LNlBIP 引物:GTCCCTTCGGCGAGCTCTTCGTTGTTACCAGCACCAGACT (序列号 43)
[0314]为了检测属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉，优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合，更优选为含有序列号44以及序列号45记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0315]用于检测属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的环状引物(LNl环状引物)
[0316]LNlLF 环状引物:ACGGCACGAGGAACATACT (序列号 44)
[0317]LNlLB 环状引物:CGATAACTTCGTCTTCGGCC (序列号 45)
[0318]在图27中，表示了在与光滑新萨托菌(Neosartorya glabra)同属于新萨托菌属的费希尔新萨托菌(Neosartorya fischeri)的β _微管蛋白基因的碱基序列中，识别为上述引物的碱基序列的位置关系。
[0319]利用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的微管蛋白基因的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检测体中存在属于新萨托菌属的菌类以及/或者烟曲霉。
[0320]为了检测出烟曲霉，除了上述引物组合之外，优选为使用由含有序列号46记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、由含有序列号47记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、由含有序列号48记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、由含有序列号49记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物、以及含有这些引物的引物组合，最优选为使用以下的引物组合。[0321]用于检测烟曲霉的引物组合(LAf2引物组合)
[0322]LAf2F3 引物:GCCGCTTTCTGGTATGTCT (序列号 46)
[0323]LAf 2B3 引物:CGCTTCTTCCTTGTTTTCCG (序列号 47)
[0324]LAf2FIP 引物:CCATGACAGTGAGGCTGAACCCCGGGTGATTGGGATCTCTCA (序列号 48)
[0325]LAf2BIP 引物:ACCATCTCTGGTGAGCATGGCTTTCCGCCGCTTTCTCAA (序列号 49)
[0326]为了检测出烟曲霉，优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合，更优选为由含有序列号50记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0327]用于检测烟曲霉的环状引物(LAf2环状引物)
[0328]LAf2LB 环状引物:AGTAAGTTCGACCTATATCCTCCC (序列号 50)
[0329]在图28中，表示了烟曲霉的β -微管蛋白基因的碱基序列中，识别为上述引物的碱基序列的位置关系。通过使用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增烟曲霉的β_微管蛋白基因的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检测体中存在烟曲霉。
[0330]此外，在用上述引物组合时，虽然可以特异地检测出烟曲霉，但是不能检测出属于新萨托菌属的菌类。因此，通过组合使用上述用于检测属于新萨托菌属的菌类以及烟曲霉的引物组合(LNl引物组合)以及用于检测烟曲霉的引物组合(LAf2引物组合)，就可以鉴别新萨托菌属的菌类和烟曲霉。
[0331]为了设计特异检测属于半内果菌属的菌类的引物，在序列号35记载的碱基序列之中，优选为从序列表的碱基号300~550所包含的范围里选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号51记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号52记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号53记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号54记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0332]用于检测属于半内果菌属的菌类的引物组合(LH2引物组合)
[0333]LH2F3 引物:GGATCCGAATACGACGTGTC (序列号 51)
[0334]LH2B3 引物:CCCTCAGTGTAGTGACCCTT (序列号 52)
[0335]LH2FIP 引物:CATGGTGCCAGGCTCGAGATCCAGGCCAGCGGTAACAAG (序列号 53)
[0336]LH2BIP 引物:CCGGTCCTTTTGGCCAGCTCTGTTACCGGCACCAGACT (序列号 54)
[0337]为了检测出属于半内果菌属的菌类，优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合，更优选为由含有序列号55以及序列号56记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0338]用于检测属于半内果菌属的菌类的环状引物(LH2环状引物)[0339]LH2LF 环状引物:ACGGCACGGGGGACATA (序列号 55)
[0340]LH2LB 环状引物:TTCCGCCCAGACAACTTCG (序列号 56)
[0341]在图29中，表示了属于半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因的碱基序列中，识别为上述引物的碱基序列的位置关系。
[0342]通过使用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增属于半内果菌属的菌类的β_微管蛋白基因的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检测体中存在属于半内果菌属的菌类。
[0343]为了设计特异检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的引物,优选为在序列号26记载的碱基序列之中，从序列表的碱基号200~450所包含的范围里选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号57记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号58记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号59记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号60记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0344]用于检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的引物组合(LTf2引物组合)
[0345]LTf2F3 引物:CCAGTTGGAGCGTATGAACG (序列号 57)
[0346]LTf2B3 引物:CCCAGTTGTTACCAGCACCG (序列号 58)
[0347]LTf2FIP 引物:TTGTTGCCGGAGGCCTACACTTTACTTCAACGAGGTGCGT (序列号 59)
[0348]LTf2BIP 引物:CGACTTGGAGCCCGGTACCAAAAGTTGTCGGGACGGAAGA (序列号 60)
[0349]为了检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus)，优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合，更优选为由含有序列号61记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0350]用于检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的环状引物(LTf2环状引物)
[0351]LTf2LB 环状引物:GCTGGTCCCTTTGGTCAGC (序列号 61)
[0352]在图30中，表不了黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的β_微管蛋白基因的碱基序列中，识别为上述引物的喊基序列的位置关系。
[0353]通过使用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增黄色篮状菌(Talaromyces flavus)的β _微管蛋白基因的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检测体中存在黄色篮状菌(Talaromyces flavus)。
[0354]为了设计特异检测沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的引物,优选为在序列号29记载的碱基序列之中，从序列表的碱基号150~420所包含的范围里选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号62记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号63记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号64记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号65记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0355]用于检测沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的引物组合(LTw4_3引物组合)
[0356]LTw4F3 引物:TGGCTCCGGAATGTGAGTT (序列号 62)
[0357]LTw3B3 引物:CAAATCGACGAGGACGGC (序列号 63) [0358]LTw4FIP 引物:CGCTCCAACTGGAGGTCGGAAAAITTCGACATCCCACCCT (序列号 64)[0359]LTw3BIP 引物:GGAATCTGCCCCGCGACATTCCGGGGGACGTACTTGTTG (序列号 65)
[0360]为了检测出沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii),优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合更优选为由含有序列号66以及序列号67记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0361]用于检测沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的环状引物(LTw4_3环状引物)
[0362]LTw4LF 环状引物:GGTGCCATTGTAACTGGAAATGA (序列号 66)
[0363]LTw3LB 环状引物:ACTCATATCGTATAGGCTAGCGG (序列号 67)
[0364]在图31中，表示了沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的β_微管蛋白基因的喊基序列中，识别为上述引物的喊基序列的位置关系。
[0365]通过使用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)的β -微管蛋白基因的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时,可以判断检测体中存在沃特曼篮状菌(Talaromyces wortmannii)。
[0366]为了设计特 异检测藤黄篮状菌(Talaromyces Iuteus)的引物,优选为在序列号27记载的碱基序列之中，从序列表的碱基号150~450所包含的范围里选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号68记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号69记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号70记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号71记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0367]用于检测藤黄篮状菌(Talaromyces Iuteus)的引物组合(LTl I引物组合)
[0368]LT11F3 引物:CGAATCACCACTGATGGGAA (序列号 68)
[0369]LTl 1B3 引物:GAAGAGCTGACCGAAAGGAC (序列号 69)
[0370]LT11FIP 引物:TTCGTGCTGTCGGTCGGTAATGTTCCGACCTCCAGTTAGAGC (序列号了0)
[0371]LT11BIP 引物:TAGGCTAGCGGCAACAAGTACGATAGTACCGGGCTCCAGATC (序列号 71)
[0372]为了检测出藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)，优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合，更优选为由含有序列号72记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0373]用于检测藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的环状弓丨物(LTlI环状引物)
[0374]LTllLF 环状引物:ACCTCGTTGAAATAGACGTTCA (序列号 72)
[0375]在图32中，表示了藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的β-微管蛋白基因的碱基序列中，识别为上述引物的喊基序列的位置关系。
[0376]通过使用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)的β _微管蛋白基因的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检测体中存在藤黄篮状菌(Talaromyces luteus)。
[0377]为了设计特异检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糙孢篮状菌(Talaromyces trachyspermus)的引物,优选为在序列号30以及序列号31记载的碱基序列之中，从序列表的碱基号250~550所包含的范围里选定上述6个碱基序列区域。具体地，优选为使用由含有序列号73记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号74记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号75记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及由含有序列号76记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物，以及含有这些引物的引物组合，更优选为使用以下的引物组合。
[0378]用于检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus)的引物组合(LTl引物组合)
[0379]LT1F3 引物:GCGTCATTTCTGCCCTCAA (序列号 73)
[0380]LT1B3 引物:AGTTCAGCGGGTAACTCCT (序列号 74)
[0381]LTlFIP 引物:TACGCTCGAGGACCAGACGGCGGCTTGTGTGTTGGGTG (序列号 75)
[0382]LTlBIP 引物:TCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGATCCGAGGTCAACC (序列号 76)
[0383]为了检测出黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus)，优选为除上述引物以外使用环状引物。作为环状引物，优选为使用以下的引物。此外，上述引物组合更优选为由含有序列号77以及序列号78记载的碱基序列的寡核苷酸组成的引物。
[0384]用于检测黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus)的环状引物(LTl环状引物)
[0385]LTlLF 环状引物:GCTGCCTTTTGGGCAGGTC (序列号 77)
[0386]LTlLB 环 状引物:TGGTCACACCACTATATTTTACCAC (序列号 78)
[0387]在图33、图34以及图34-1中，表示了黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糙抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)的28S rDNA的ITS区域以及D1/D2区域的喊基序列中，识别为上述引物的碱基序列的位置关系。
[0388]通过使用这些引物以及引物组合，可以用LAMP法特异地迅速且高灵敏度地扩增黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及糖抱篮状菌(Talaromyces trachyspermus)的 28SrDNA的ITS区域以及D1/D2区域的可变区。因此，在确认了该DNA片段的扩增时，可以判断检测体中存在黄色篮状菌(Talaromyces flavus)以及/或者糙孢篮状菌(Talaromycestrachyspermus)。
[0389]构成上述引物组合的各个外引物，不仅在LAMP法中，在PCR法中也可以使用。在PCR法中，使用上述引物，以被检测体的微管蛋白基或者28S rDNA的ITS区域以及Dl/D2区域为模板用耐热DNA聚合酶进行PCR，就可以扩增作为目的的DNA片段。
[0390]核酸扩增反应所用的酶，只要是通常所用的并没有特别限制，优选为具有链置换活性的模板依存性核酸合成酶。作为这样的酶，可以列举Bst DNA聚合酶(大片段(largefragment))、Bca (exo_) DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，优选为BstDNA聚合酶(大片段)。本发明中可以用的酶可以是从病毒或者细菌等纯化而成，也可以是利用基因重组技术制造而成。另外，这些酶也可以是片段化或者氨基酸置换等改变而成。
[0391 ] 利用LAMP法进行扩增反应时的温度没有特别限制，优选在60~65°C。
[0392]利用LAMP法扩增的核酸片段的确认可以用通常的方法进行。例如，利用特异性识别经扩增的碱基序列的标记寡核苷酸作为探针进行杂交，用荧光嵌入染料法(特开2001-242169号公报)检测，或者，也可以将反应结束后的反应液直接在琼脂糖凝胶上进行电泳以检测其条带。在琼脂糖凝胶电泳中，LAMP法扩增产物，其碱基长度不同的众多条带呈阶梯(梯子)状被检测出来。
[0393]此外，在LAMP法中由于核酸的合成造成底物被大量消耗，作为副产物的焦磷酸离子与共存的镁离子反应生成焦磷酸镁。焦磷酸镁一旦生成，反应液就会出现直到肉眼可以确认程度的白色浑浊。以此白色浑浊为指标，用可以对反应结束后或者反应中的浊度上升进行实时的光学观测的测定仪器就可以进行检测。例如，用分光光度计确认400nm的吸光度的变化，就可以检测出核酸的扩增反应(国际公开第01/83817号小册子)。
[0394]根据用LAMP法的本发明的检测方法,在约60~120分钟的短时间内可以进行从检测体的制备工序到菌类的检测工序。
[0395]接着，具体说明本发明的耐热菌类的检测方法的一个实施方式，然而本发明并不限定于此。
[0396]I)事故原因菌解析
[0397]作为具有由耐热菌类引起污染事故可能性的饮食品，可以列举由于含有糖类或蛋白质而不能在强烈的条件下灭菌的饮食品。这样的饮食品，可以列举以果实、果汁等农产品或者以乳等畜产品为原料等的饮食品。
[0398]从引起事故过的饮料等检测出来的菌丝中回收DNA。之后，用上述的本发明的寡核苷酸作为核酸引物进行PCR反应或者LAMP法等的基因扩增处理。
[0399]用PCR法进行基因扩增时，作为丝衣霉属检测用引物对，使用上述(a)以及(b)的寡核苷酸对；作为篮状菌属检测用引物，使用上述(C)以及(d)的寡核苷酸对、上述(e)以及Cf)的寡核苷酸对、上述(g)以及(h)的寡核苷酸对、上述(i)以及(h)的寡核苷酸对、以及上述(j)以及(k)的寡核苷酸对中的任意一对以上；作为新萨托菌属以及烟曲霉检测用引物，使用上述(I)以及(m)的寡核苷酸对以及上述(η)以及(ο)的寡核苷酸对中的任意一对以上；作为半内果菌 属检测用引物，使用上述(P)以及(q)的寡核苷酸对、上述(r)以及(S)的寡核苷酸对、以及上述(t)以及(U)的寡核苷酸对中的任意一对以上。
[0400]用LAMP法进行基因扩增时，作为丝衣霉属检测用引物，使用序列号36~39记载的碱基序列所表示的寡核苷酸组合；作为篮状菌属检测用引物，使用序列号57~61记载的碱基序列所表示的寡核苷酸组合、序列号62~67记载的碱基序列所表示的寡核苷酸组合、序列号68~72记载的碱基序列所表示的寡核苷酸组合、序列号73~78记载的碱基序列所表示的寡核苷酸组合之中任意一组以上；作为新萨托菌属以及烟曲霉检测用引物，使用序列号40~45记载的碱基序列所表示的寡核苷酸组合；作为半内果菌属检测用引物，使用序列号51~56记载的碱基序列所表不的寡核苷酸组合。
[0401]通过使用这些引物对，可以分别检测出上述4个属的耐热菌类的各个属。另外，通过适当组合使用各属的检测用引物，可以全面的检测出上述4属中多个属的菌种。本发明的引物是各属特异性的，所以可以全面的检测出上述4个属的耐热菌类，并且从使用的引物的种类，还可能在属水平上进行鉴定(在耐热菌类的上述4个属内的检测)。
[0402]用上述引物进行基因扩增处理后，用PCR法时进行电泳以确认反应产物的有无，用LAMP法时通过测定反应液的浊度以确认反应产物的有无。与此同时，收集的菌体的一部分接种到添加氯霉素PDA上，于50°C培养。
[0403]在属于新萨托菌属的菌类检测用引物以外的引物的PCR基因扩增产物得到确认的情况，以及/或者属于新萨托菌属的菌类检测引物的基因扩增产物得到确认并且在50°C菌丝没有生长，或者在用新萨托菌和烟曲霉检测用引物的PCR反应或者LAMP反应中反应产物没有得到确认的情况下，认为是“耐热菌类阳性”(检测出属于新萨托菌属的菌类)。[0404]作为一个例子，对于组合使用上述(a)以及(b)所示的寡核苷酸对、上述(t)以及(U)所示的寡核苷酸对、上述(η)以及(ο)所示的寡核苷酸对、上述(i)以及(h)所示的寡核苷酸对、上述(j )以及(k)所示的寡核苷酸对，通过PCR法进行基因扩增处理进行详细说明。在使用属于新萨托菌属的菌类检测用引物(上述(η)以及(O)所示的寡核苷酸对)的体系中确认了反应产物的情况下，确认在50°C经培养的菌丝的生长，从而确认属于新萨托菌或者属于烟曲霉。或者，使用以新萨托菌和烟曲霉的检测用寡核苷酸作为核酸引物进行检测。例如，用上述(V)以及(W)的寡核苷酸作为引物进行PCR反应，在确认了约200bp的反应产物的情况下判定为烟曲霉，在确认没有反应产物的情况下，判定为属于新萨托菌属的菌类呈阳性。
[0405]在使用属于丝衣霉属的菌类检测用引物(上述(a)以及(b)所示的寡核苷酸对)的体系中确认了反应产物的情况下，判定为属于丝衣霉属的菌类呈阳性。
[0406]在使用属于半内果菌属的菌类检测用引物(上述(t)以及(U)所示的寡核苷酸对)的体系中确认了反应产物的情况下，判定为属于半内果菌属的菌类呈阳性。 [0407]在使用属于篮状菌属的菌类检测用引物(上述(j)以及(k)所示的寡核苷酸对以及/或者上述(i)以及(h)所示的寡核苷酸对)的体系中确认了反应产物的情况下，判定为属于篮状菌属的菌类呈阳性。
[0408]由于耐热菌类在热灭菌条件下也可以生存，所以从原料以及工序耐热菌类混入的可能性非常高。因此，在耐热菌类呈阳性的情况下，必须仔细检查原料以及制造环境的清洁度。相反，在耐热菌类呈阴性的情况下，原因是灭菌不充分或者灭菌后的混入，必须重新进行灭菌工序或者进行容器的密封性确认(原因调查)。
[0409]2)原料的微生物检查
[0410]通常的原料的菌类检查，需要一般菌类(被检测体不进行热激处理)和耐热菌类(被检测体进行热激处理)2个实验。然而，根据本发明，不需要对被检测体进行热激处理。即，只进行一般菌类的检查，在确认菌丝的情况下可以用此菌丝用上述I)的方法进行判断是否为耐热菌类。在过去的方法中，通常耐热菌类的检测需要7天左右，但是根据本发明，在通常3天左右的菌丝确认之后，可能在2天之内检测出来，也可能提前于2天检测出来。此外，在过去的方法中，耐热菌类检测出来后菌种的鉴定还需要约7天时间，而本发明的方法，可以在检测出来的同时进行属水平上的鉴定。
[0411]在本发明的耐热菌类的检测方法中，被检测体没有特别限制，可以使用饮食品自身、饮食品的原材料、分离的菌体、培养的菌体等。
[0412]作为从被检测体中制备DNA方法，只要能够得到足够于进行耐热菌类的检测的纯度和量的DNA，就没有特别限制，可以用通常的方法进行。可以使用从被检测体的RNA逆转录得到的DNA。此外，也可以使用没有纯化的状态，也可以使用经过进一步分离、提取、浓缩、纯化等前处理。例如，可以进行苯酚和氯仿的提取来纯化，用市售的纯化试剂盒来纯化，提高核酸的纯度后使用。
[0413]据本发明的耐热菌类的检测方法，可以在约5~12小时的短时间内进行从被检测体的制备工序到菌类的检测工序。
[0414]本发明的耐热菌类检测试剂盒是含有上述本发明的检测用寡核苷酸作为核酸探针或者核酸引物的试剂盒。具体地，本发明的耐热菌类检测试剂盒含有从可以和上述(I)或者(II)的核酸进行杂交并且作为特异地检测出耐热菌类的检测用寡核苷酸而发挥功能的寡核苷酸中选出的至少一种作为核酸探针或者核酸引物。特别是，优选为从含有序列号I~23或者36~78中任一个记载的碱基序列或者其互补序列的寡核苷酸，以及含有与该碱基序列或者其互补序列有70%以上同源性并且可以作为检测用寡核苷酸的碱基序列的寡核苷酸中选出的至少一种作为核酸探针或者核酸引物。此试剂盒可以用于检测耐热菌类。本发明的试剂盒，除了上述核酸探针或者核酸引物以外，根据目的，也可以含有标记检测物质、缓冲液、核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)、酶底物(dNTP，rNTP等)等菌类检测中常用的物质。
[0415]例如，用LAMP法的耐热菌类检测用试剂盒，优选为含有作为上述的引物、环状引物所必要的各种寡核苷酸，成为核酸合成底物的4种dNTP (dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，具有链置换活性的模板依存性核酸合成酶等DNA聚合酶，以及作为提供给酶反应适合条件的缓冲液，作为辅助因子的盐类(镁盐或者锰盐等)，稳定酶或者模板的保护剂，进一步根据需要还含有检测反应产物所必要的试剂类。在此试剂盒中，也可以含有为了确认利用本发明检测用寡核苷酸对的基因扩增反应正常进行的阳性对照(positive control).作为阳性对照，例如，可以列举含有本发明的检测用寡核苷酸所扩增的区域的DNA。
[0416]实施例
[0417]以下，基于实施例详细说明本发明，但是本发明不受它们限制。
[0418]实施例1
[0419](A-1)属于丝衣霉 属的菌类的检测、识别
[0420]1.β微管蛋白部分长度的碱基序列的确定
[0421]通过下述方法确定丝衣霉属各种的β_微管蛋白基因的碱基序列。使用Gen i ^ ? (Takara Bio (株)社生产)，从用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基在30°C、暗处培养7天的丝衣霉属菌体，提取DNA。作为目的部位的PCR扩增，使用PuReTaqTM Ready-To-Go PCR Beads (GE Health Care UK LTD 生产)，作为引物使用 Bt2a(5，-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，:序列号 79)、Bt2b(5，-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3，:序列号 80) (Glass and Donaldson,Appl Environ Microbiol61:1323-1330,1995)。扩增条件为β微管蛋白部分长度的变性温度为95°C，退火温度为59°C，延伸温度为72°C，实施35 次循环。PCR 产物使用 Auto SegTM G-50 (Amersham Pharmacia Biotech 社生产)进行纯化。PCR 产物使用 BigDye terminator Ver.1.1 (商品名:Applied Biosystems 社生产)标记，以 ABI PRISM3130Genetic Analyzer (Applied Biosystems 社生产)实施电泳。在从电泳时的荧光信号来确定碱基序列时，使用软件“ATGC Ver.4" (Genetyx社生产)。
[0422]基于利用测序法确定的雪白丝衣菌(Byssochlamys nivea)和各种菌类的公知的β-微管蛋白基因的碱基序列信息，使用DNA解析软件(商品名:DNAsis pro,日立软件社生产)进行比对解析，确定含有属于丝衣霉属的菌类的特异性碱基序列的β -微管蛋白基因中的特定区域(序列号24)。
[0423]2.属于丝衣霉属的菌类的检测和属水平的鉴定
[0424](I)引物的设计
[0425]上述得到的属于丝衣霉属的菌类的特异性碱基序列区域中，从在’末端属于丝衣霉属的菌类的特异性特别高的区域，进行满足如下4个条件的部分区域的研究:1)属固有的碱基序列在数碱基前后存在，2) GC含量大概为30%~80%，3)自退火的可能性低，4) Tm值大概为55~65°C左右。基于该碱基序列设计一组引物对，使用从各种菌体提取的DNA作为模板，利用PCR反应研究丝衣霉属检测和属鉴定的有效性。即，进行的研究为:在以丝衣霉属DNA作为模板的反应中，确认约150bp的DNA扩增反应，在以其它霉菌的基因组DNA作为模板的反应中，不能确认扩增产物。根据该结果，确认丝衣霉属的完全检出，即能够进行丝衣霉属的属水平的鉴定。确认了有效性的引物对为由以序列号I和2记载的碱基序列表示的寡核苷酸构成的引物对。另外，使用的引物是委托Sigma Aldrich Japan公司合成(脱盐纯化品，0.02 μ mo I等级)而购入的。
[0426](2)被检测体的制备
[0427]作为在经设计的引物的有效性的评价中使用的真菌类，即丝衣霉属、其它的耐热霉菌和一般霉菌，使用表1和表2中记载的菌。对这些菌类，购入千叶大学医学部真菌医学研究中心所保管并利用IFM序号管理的菌类而使用。
[0428]在最适条件下培养各菌体。培养条件为:使用马铃薯葡萄糖培养基(商品名:〃一 > - 7马铃薯葡萄糖琼脂培养基，荣研化学株式会社生产)，以指定温度，即一般霉菌为25°C、耐热霉菌和烟曲霉为30°C，培养7天。
[0429]表1
[0430]
【权利要求】
1.一种属于篮状菌(Talaromyces)属的耐热菌类的检测方法,其包括下述2)的工序， 2)用下述(B-1)或者(B-2)的寡核苷酸作为引物对属于篮状菌(Talaromyces)属的菌类进行鉴定的工序， (B-1)序列号7~9和73~78中任一个记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸； (B-2)在序列号7~9和73~78中任一个记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列所表不的寡核苷酸。
2.如权利要求1所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 为了进行鉴定，标记从所述(B-1)~(B-2)中选出的至少一种寡核苷酸，使得到的寡核苷酸与从检测对象物中提取的核酸进行杂交，测定经杂交的寡核苷酸的标记。
3.如权利要求1所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 包括下述2-1)的工序: 2-1)用下述(B-3 )或者(B-4 )的寡核苷酸作为引物通过聚合酶链反应(PCR)法对属于篮状菌(Talaromyces)属的菌类进行鉴定的工序， (B-3)序列号7~9中任一个记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸；(B-4)在序列号7~9中任一个记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
4.如权利要求1所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 包括下述2-2)的工序: 2)用下述(B-5)或者(B-6)的寡核苷酸作为引物通过环介导等温扩增(LAMP)法对属于篮状菌(Talaromyces)属的菌类进行鉴定的工序， (B-5)序列号73~78中任一个记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸；(B-6)在序列号73~78中任一个记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测属于篮状菌属的菌类的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
5.如权利要求1所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 为了进行鉴定，使用所述(B-1)~(B-2)的寡核苷酸中的至少一种来进行基因扩增，并确认有无扩增产物。
6.如权利要求5所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 采用聚合酶链反应(PCR)法进行所述扩增反应。
7.如权利要求5所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 采用环介导等温扩增(LAMP)法进行所述扩增反应。
8.如权利要求6所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 在所述2)的工序中，使用下述(B-7)的至少一种寡核苷酸对: (B-7)由序列号7所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸和序列号8所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸构成的寡核苷酸对、或者 由序列号9所记载的碱 基序列所表示的寡核苷酸和序列号8所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸构成的寡核苷酸对。
9.如权利要求7所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 在所述2)的工序中，使用下述(B-8)的寡核苷酸中的至少一种: (B-8)序列号73~78中任一个所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸。
10.如权利要求9所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 在所述2)的工序中，使用下述(B-12)的寡核苷酸组合: (B-12)寡核苷酸组合，其包含:序列号73所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸、序列号74所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸、序列号75所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸、以及序列号76所记载的碱基序列所表示的寡核苷酸。
11.如权利要求10所述的耐热菌类的检测方法，其特征在于， 所述(B-12)的寡核苷酸组合是下述(B-12’)的寡核苷酸组合: (B-12’)寡核苷酸组合，其在所述(B-12)中，进一步包含:序列号77所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸和/或序列号78所记载的碱基序列所表不的寡核苷酸。
12.一种属于篮状菌(Talaromyces)属耐热菌类的检测用寡核苷酸,其特征在于， 所述检测用寡核苷酸是序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸，或者是在序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且可以作为检测用寡核苷酸使用的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
13.—种属于篮状菌(Talaromyces)属耐热菌类的检测用试剂盒,其含有选自下述(1-1)或者(1-2)的寡核苷酸中的至少一种作为核酸探针或者核酸引物， (1-1)序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸； (1-2)在序列号7~9和73~78中任一个所记载的碱基序列中使I~3个碱基缺失、置换或者添加而得到并且能够用于检测耐热菌类的碱基序列或者其互补序列所表示的寡核苷酸。
【文档编号】C12R1/645GK103923992SQ201410141182
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2009年5月28日 优先权日:2008年5月28日
【发明者】细谷幸一, 中山素一, 德田一, 矢口贵志, 弘佑介 申请人:花王株式会社