专利名称：山羊关节炎－脑炎病毒提供抗hiv－1感染的免疫保护的制作方法
本项工作部分地得到了由美国国家卫生研究院提供的编号5-U01-HD32632基金的资助。美国政府在本发明中享有一定的权利。
背景技术：
发明领域本发明一般涉及免疫学和医学领域，特别是涉及提供抵抗HIV-1感染的免疫保护的方法。
背景信息获得性免疫缺损综合症(艾滋病，AIDS)的影响范围已经达到了流行病水平，尤其是在非洲、亚洲和加勒比地区的第三世界国家。尽管上亿的经费用于寻找治疗此疾病的药物的研究上，但是在确定药物以用于延迟疾病进程的方面仅仅取得了很有限的进展。
AIDS的致病原因是人免疫缺损病毒(HIV-1)。HIV-1感染免疫系统的特定的一种细胞类型，T细胞。通过进入T细胞，HIV-1基因组DNA整合到T细胞的基因组中，在那里T细胞的基因组指导病毒的蛋白合成。然后新的HIV-1病毒的拷贝从被感染的T细胞中释放出来，并进一步感染其他的T细胞。最终，被感染的T细胞死亡而受HIV-1感染的个体的免疫系统衰竭，不能防御随后的感染。其结果，艾滋病患者常典型地死于在健康个体上通常并不会发生的，至多也就是导致轻微疾病的感染。
起初，对艾滋病的治疗仅局限于因免疫应答衰竭引起的感染的治疗。后来，如AZT和ddI作为核苷类似物的药物被确认能够干扰HIV-1 DNA的复制。最近，一类称作蛋白酶抑制剂的药物据报道能够更有效地抑制HIV-1的复制。人们期望蛋白酶抑制剂结合核苷类似物能够进一步延长艾滋病患者的生命，甚至能够治愈艾滋病。
虽然施用上述方法中的药物提供了杀死HIV-1感染个体中的病毒的方法，但这些药物只能在一个人已经受到感染后使用；它们对免疫系统没有任何的增强作用。显然，更优选的抑制AIDS传染病方法应当是在第一地点防治HIV-1的感染。疫苗能够刺激人抗免疫接种药剂的免疫应答，疫苗也是防止HIV-1感染的合乎逻辑的选择。例如，疫苗已经用于防止或降低许多病毒疾病的严重性，包括小儿麻痹症、麻疹、天花和流行性感冒。此外，疫苗可以在已经受感染的个体上刺激免疫系统。
已有许多的方法用于开发能够增强人对艾滋病病毒感染抗性的疫苗。然而，虽然设计了各种类型的HIV-1疫苗，并且进行了临床试验检测，但是每种疫苗多有严格的局限。例如，由部分HIV-1蛋白组成的亚单位疫苗，只能提供短暂的或低效的保护。疫苗开发的障碍之一是HIV-1繁殖时的快速突变。结果，对一种HIV-1蛋白或HIV-1病毒株而刺激起的免疫应答，对病毒另一种的变体却无效。甚至，HIV-1表面的一部分所产生的抗体，虽可能是疫苗中最有效的部分，实际上却能刺激HIV-1的感染。
减毒疫苗，由活的繁殖缺陷的病毒组成，也曾被建议过。但是对给人尤其是给别的健康人注射这种HIV-1病毒存在是否合法性的问题。因此，需要一种疫苗，它能够提供对HIV-1广泛的免疫应答，但并不伴随有使用HIV-1作为免疫试剂而涉及的危险和限制。本发明正能够满足这种需要，并能够提供其他的优越性。
山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)是一种逆转录病毒，和能够导致人AIDS的人免疫缺损病毒(HIV-1)密切相关。已知CAEV感染山羊，导致一系列病理情况，包括关节炎和脑炎。CAEV感染发生在全世界范围内，可导致山羊饲养业的严重损失。
在世界的许多地方消费山羊奶，尤其是在欠发达国家，山羊奶是一种重要的营养来源。然而在这些国家里，山羊奶在人们消费前很少加热杀菌。并且，由于能够在健康食品市场中买到，在美国的生山羊奶消费量在上升。根据本发明，现已认为CAEV类的病毒结构可感染人(HIV-1-CAEV)，尤其是那些职业接触山羊或消费生山羊奶的人。虽然还没有确定CAEV是否可导致人的病理反应，但是CAEV与HIV-1的密切关系提示，最好将CAEV对人的感染事件减到最小。
虽然制乳业努力防止CAEV在山羊中的传播，但迄今无法知道人是否被人适应性的结构感染。因此，一种可应用于人的诊断方法是必要的。这种诊断受CAEV感染的人的方法应能够鉴定CAEV感染的血制品。尤其重要的是要有一种方法，检测CAEV在血制品中的感染，因为与CAEV感染相关的脑炎能在幼儿在进行受感染血液输血时发生。不幸的是没有方便的方法可以鉴定CAEV对人的感染。因此，需要一种简单便宜的方法，能够诊断CAEV感染的情况。本发明正能够满足这种需要，并能够提供其他的优越性。
本发明概述本发明提供一种含有山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)免疫原，优选地为人CAEV，和制药上可接受的载体的疫苗。本发明的疫苗可以用于，例如，刺激抗CAEV的免疫应答或在人体中刺激抗人免疫缺损病毒-1(HIV-1)交叉保护免疫应答，以及用于对人，或对其他非山羊哺乳动物抗CAEV感染的免疫接种。
本发明还提供一种方法，通过对个体施用CAEV免疫原而在该个体中刺激抗CAEV或HIV-1的免疫应答。此方法可以用于，例如，增强未接触HIV-1或CAEV的个体对HIV-1感染的抗性或CAEV感染的抗性，或分别相应地减轻受HIV-1感染个体中HIV-1导致的病理反应的严重程度或CAEV感染个体中CAEV所导致的病理反应的严重程度。另外，本发明还提供了一种通过将淋巴细胞与CAEV免疫原接触而体外刺激免疫应答的方法。
本发明还提供了一种对一怀疑受CAEV感染的样本诊断其受山羊关节炎-脑炎病毒感染的方法。例如，本发明提供了一种酶联免疫吸附试验(ELISA)，其中CAEV gp135结合于一固体支持物，并且在其中将CAEV gp135与例如来自一怀疑受CAEV感染个体的血浆样品接触，通过检测结合CAEV gp135的血浆中的抗体作为对该个体感染CAEV的诊断。其他方法还包括基于PCR的试验。本发明还提供了进行例如基于ELISA或核酸的诊断操作的试剂盒。
附图的简要描述
图1表示将CAEV gag序列与其他慢病毒属的gag序列相比较的系统进化树分析。PCR和RT-PCR，以及PCR产物的克隆和测序按实施例1D.所述操作。各种分析的序列，以及它们的入藏号，如实施例1D.所述。所有的CAEV相关序列在图1中用一方框所框。所有其他的序列，除了JSR，即Jaagsiekte绵羊逆转录病毒，均为慢病毒属，在图1中设作为祖先序列。通过PAUP3.1.1节俭算法分析173个对比的gag位点，其中图1中的157个和图2中的65个有变化。使用了序列输入的随机性和MULPARS两个操作选项。图1中列出的反向计算的节俭性，如实施例1D.中所述，得出的分支长度不是和单个核苷酸变化相对应的，而是提供相关的上层分支序列的高层相关距离。一个最为节俭的系统树在图1中表示，其分支次序通过“相邻-接合分析”(neighbor-joining)和“bootstrapping”，以及利用pol基因片段的系统树分析中得到进一步支持。
图2表示将CAEV gag序列与实施例1D.中所述的其他序列一一相比较而作的系统进化树分析。普通的节俭性如图2所示(这些序列都是密切相关的)，而相应的分支长度以最小的核苷酸变化为单位给出。Maedi-visna序列设为祖先序列。图2中得到两个节俭性相同的系统树，它们没有本质的不同。
图3对PCR扩增的Hmc4衍生的人-CAEV gag克隆与实施例2所述的感染山羊的CAEV的相应区域作了比较。所分析的克隆为Hmc4基因组克隆g-30,g-39,g-40,g-46和g-50；Hmc4血浆克隆p-254和p-256；来自感染实验i-238和i-239的克隆。“i”克隆衍生自感染的培养物的细胞质。“p”克隆衍生自感染个体的血浆。
图4对PCR扩增的Hmc4-衍生的人-CAEV pol克隆的核苷酸序列与实施例2所述的两个感染山羊的CAEV的相应区域作了比较。
图5表示了对来自山羊的CAEV病毒株CAEV-CO与gWa19(即，CAEV-79-63)和来自人的h-CAEV病毒株Hmc1与Hmc4的直接序列比较。
本发明的详细描述本发明提供了一种含有山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)免疫原，优选地为人适应株的CAEV，和制药上可接受的载体的疫苗。如本文所公开的，本发明的疫苗可以用于在人体中刺激抗HIV-1的免疫保护应答。此外，本发明的疫苗可用于对人，或对其他非山羊哺乳动物抗CAEV感染的免疫接种。
本文中所使用的“CAEV免疫原”是指一个CAEV病毒颗粒，它可以是活的，减毒的或已灭活的CAEV，或者是一个CAEV病毒颗粒的免疫原性部分，即它可以是CAEV病毒颗粒的一部分，或是一个例如象gp135包膜糖蛋白的肽片段(见表1；env)这样的CAEV蛋白的肽片段。CAEV免疫原的特征是它在体内或在体外可以刺激免疫应答。特别的是，一个CAEV免疫原当它对人施用时可以刺激抗CAEV的免疫应答并可以刺激抗HIV-1交叉反应的免疫应答。通过CAEV感染所产生的抗HIV-1的交叉反应的免疫应答可使人联想到通过牛痘感染而产生的抗天花的交叉反应免疫应答。表1
-env，pol和gag分别表示CAEV的包膜，多聚酶和核衣壳核心蛋白编码区。各个序列前面的数字表示各个肽所示的第一个氨基酸在相应的各个CAEV蛋白的氨基酸的位置。
存在于U1核糖核蛋白复合物中的一个70K的蛋白的肽片段，与存在于HIV-1中的一个氨基酸序列同源，它可以作为一个代用免疫原，能刺激与HIV-1交叉反应的免疫应答(Douvas and Takehlana,AIDS Res.Hum.Retrovir.10:253-262(1994)，在此引入作参考)如本文所公开的，CAEV蛋白的许多肽片段与70K和HIV-1序列相同源，因此可用作CAEV免疫原来在一个体中刺激与HIV-1交叉反应的免疫应答。
与70K和HIV-1中存在的氨基酸序列相同源的CAEV肽片段的实例在表1中有提供。本文中涉及的具有HIV-1(HIV-1→CAEV)相应结构特征的其他举例性CAEV肽片段，包括例如220-FAILKC→200-FAILKC(枢纽区)；99-DMVEQM→415DMVEHM(α螺旋1)；129-LKCTDL→203-LKCTKW(保守转角)；300-NNNTRT→480-NNNTIT(保守转角)等。其他可用于CAEV免疫原的这种CAEV肽，可以通过查找CAEV DNA或氨基酸序列来确定与70K和HIV-1的免疫学同源序列具同源性的CAEV肽而确定(见Douvas和Takehana，同上，1994)。进一步，本文在此还公开了用于确定与70K和HIV-1肽同源的CAEV肽作为CAEV免疫原的方法，包括ELISA或western印迹或病毒中和试验(实施例1)，或者其他本领域所知道的方法(例如可见Harlow和Lane，抗体实验手册(Cold Spring Harbor Labortor Press 1998)，在此引入本文作参考)。
本文所使用的术语“疫苗”是指一种含有免疫原的组合物，当其对一个体通常是非山羊的哺乳动物如人施用时，可在个体中刺激免疫应答。尤其是，本发明的疫苗含有CAEV免疫原，能施用于例如人，刺激与抗HIV-1交叉反应的抗CAEV的免疫应答。因此，CAEV免疫原可用于刺激抗HIV-1免疫应答的代用免疫原。一个优选的疫苗是减毒的人CAEV，如图3和图4中所示的那些。
虽然本文中可考虑使用任何一种CAEV感染药剂，但在本文尤为优选使用的是新的CAEV人适应型病毒株，在此记为“人-CAEV”，如实施例2中所述从病人Hmc1和Hmc4获得的人病毒株，其部分基因组序列如图3和图4中所示。我们发现人-CAEV区别于可感染山羊的CAEV。例如，在相应于由SEQ ID Nos:16和17所述引物扩增的173个核苷酸片段的基因组区域中，发现人-CAEV病毒的该特定区域至少有两个突变是人源特定的。这些突变是在173 gag区域扩增产物上对应于56位的鸟嘌呤和77位的胞嘧啶。
因此，本发明的另一个实施方案是，提供了新分离的人-CAEV。本发明的人-CAEV可以通过如实施例2中所述的方法或利用其他本领域所知道的方法分离。
应理解的是本发明的疫苗可以给予一个未感染HIV-1的个体，这样该疫苗刺激免疫应答以保护个体在以后接触HIV-1时不受感染，或者给予一个已感染HIV-1的个体，这样刺激免疫应答抵抗HIV-1的免疫病理反应(例如可见，Cease and Berzofsky,Ann.Rev.Immunol.12:923-989(1994))。因此，本发明的疫苗可用于增强个体对HIV-1感染的抗性或者对感染HIV-1的个体减轻HIV-1造成的病理反应的严重程度。
在本发明公开之前，尚不知道CAEV能够感染人。如本文所公开的，人的CAEV感染是普遍的，尤其是在普遍消费生山羊奶的人群中和那些接触山羊的人群中(见实施例1C.)。虽然还不能确定CAEV感染是否象在山羊中那样导致人的关节炎和脑炎的病理反应，但如果CAEV诱导的病理反应存在，那么对那些涉及山羊产业的人员进行免疫接种以抗CAEV感染是很重要的。本发明的疫苗可用于此目的。此外，本文所公开的ELISA诊断试验可以用于确定CAEV的感染个体，并可特别用于例如扫描血液制品以确定CAEV感染的血液，因而能够防止CAEV感染通过施用被CAEV污染的血液进行传播。
因为现已确定CAEV可感染人，所以可见类似地CAEV也能感染其他“非山羊”哺乳动物，包括例如人之外的灵长类(如，猴等)，牛，马，绵羊，狗，猫或其他动物。因此，本发明的ELISA也可用于对任何这些非山羊哺乳动物的CAEV感染的诊断。进而，如果确定了CAEV感染其他动物，本发明的疫苗也可以用于防止或限制CAEV在这些非山羊动物中的传播。
如本文所公开的，人与CAEV的接触也可刺激与HIV-1交叉反应的对CAEV的免疫应答(实施例1E.)。CAEV是逆转录病毒，慢病毒亚型，与人免疫缺损病毒-1(HIV-1)相关。CAEV感染山羊并导致被感染动物的关节炎和免疫系统的异常(例如可见，Banks等，Arthrit.Rheum.30:1046-1053(1987):Carwford等，Science 207:997-999(1980))。
Visna maedi病毒(VMV)是另一种慢病毒，与CAEV和HIV-1密切相关，并能够导致绵羊象CAEV对山羊一样的疾病。因此，在此可以考虑将VMV或VMV的免疫原性片段作为CAEV免疫原的替代物或，如果需要的话，与CAEV免疫原结合用于本发明疫苗。含有VMV免疫原的疫苗可用于刺激人抗HIV-1交叉反应的免疫应答。
CAEV导致山羊的持续感染并涉及有三种症状，包括关节炎--有20-30％的被感染动物发生；脑白质炎--在幼小动物中发生；偶发性神经疾病--在成年动物中发生。CAEV感染在全世界范围内被发现，1980年被确定为山羊关节炎和脑炎的致病原因。1985年和1986年描述了CAEV与HIV-1(那时称作HTLV-Ⅲ)核苷酸和氨基酸序列的关系。CAEV与HIV-1在系统进化上是密切相关的并具有高度的同源性，包括例如，在它们的RNA依赖性DNA多聚酶(pol)之间和HIV-1的gpl20/41与CAEV的gp135/38之间(例如可见Gonda等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 83:40007-4111(1986)；Gonda等，Retroviridae3:83-109(1994)；Garry等，Retroviridae 4:491-603(1995)；各文献在此引入作参考)。
CAEV在山羊中通过被感染的奶，特另是初乳传染，且感染通过库集初乳喂养幼羊的农业习惯而传播。CAEV在单细胞/巨噬细胞谱系和成纤维细胞系中繁殖，但不感染T细胞。表达CAEV的巨噬细胞分布于被感染山羊的关节滑液、肺、中央神经系统、淋巴结、脾、胃肠道和乳腺中。
在本发明公开之前，不知道CAEV可感染人。然而，通过ELISA进行血清转化现象的检测和用人血样品所作的western印迹分析(实施例1C.)，以及通过多聚酶链反应(PCR)分析来自MCTD病人的基因组DNA检测到相应于CAEV的gag和pol基因的前病毒DNA，提供了明显证据表明CAEV可感染人。病毒DNA序列掺入到宿主细胞DNA中是被包括CAEV和HIV-1在内的慢病毒感染的明确标志。
基于本文所公开的结果，CAEV可能感染半数的墨西哥和中美洲人群，尤其那些消费生山羊奶(这在当地很普遍)的人群或那些接触山羊的人群(见实施例1C.)。虽然没有证据表明CAEV可导致人的病理状态，但是，确定CAEV在人群中的感染范围仍然很重要，这可以确定是否存在，例如，某种未知病理反应与CAEV感染间的病原学关系。本发明在此提供的ELISA试验可用于常规扫描人的CAEV感染，并且也便于扫描其他非山羊哺乳动物以确定CAEV感染的存在。
对三组不同地理区域山羊的以及受CAEV感染的人的基因组DNA的进行了PCR分析(实施例1D.)。人的和山羊的基因组PCR分析确定出至少两个可能的CAEV病毒株，它们不同于参照CAEV病毒株的DNA序列(所参照的CAEV DNA序列可从GenBank获得，登记号M33677，引入本文作参考)。值得注意的是，来自三组CAEV感染的山羊中的两组以及几个感染人的CAEV所产生的免疫应答对HIV-1有交叉反应，这表明这些病毒株中的任何一个都可用作本发明疫苗的免疫原的来源。
CAEV感染的山羊用作人风湿性关节炎的动物模型，风湿性关节炎是关节炎/自身免疫失调、系统风湿症失调家族中最常见和最流行的症候。系统风湿症失调在女性中的普遍性是男性中的三倍。
混合结缔组织病(MCTD)是另一种系统风湿失调。MCTD的特征是抗U1 snRNP剪切复合物的自身抗体。MCTD被认为是一种重叠综合症，它包含了在其他三种系统风湿失调--红斑狼疮(SLE)、硬皮症和多肌炎中共有的临床上和血清学的特征。MCTD的临床特征包括关节炎、淋巴结病、脉管炎、肌炎、Sjogren综合症(唾液和泪腺的淋巴渗透)和免疫调节异常。
MCTD个体中的临床特征的表现也发生在HIV-1感染的个体中。但在HIV-1感染患者中这些临床表现更为严重且更难于治疗。例如，MCTD个体的Sjogren综合症的特征是局部的淋巴渗透，然而发生在相应的HIV-1相关的综合症中，则是扩散的腺体渗透，即弥散型淋巴细胞增多综合症。
严重的坏死性脉管炎伴随着神经病、与药物治疗无关的发炎性多肌症以及其他形式的与风湿病相关的脉管和神经肌肉疾病也发生在HIV-1感染的个体上。在MCTD、SLE和HIV-1感染中会发生坏死性淋巴结疾病，可导致大规模的淋巴结结构被破坏。两种典型的风湿病，牛皮癣性关节炎和Reiter综合症，是HIV-1感染的早期表现，并且当与HIV-1感染有关时更难进行化学疗法的治疗。
HIV-1感染和系统风湿病如MCTD的临床相似性提示，HIV-1可能是风湿病理的一个极端或是在系统发生上相关的，而较为临床良性的慢病毒是风湿病的一个发病因素。血清学上，MCTD的特征是存在抗RNP(核糖核蛋白)的抗体，该抗体对在核RNA剪切时位于内含子5’-端的U1 snRNP颗粒特异。抗RNP抗体也存在于一些SLE和硬皮症患者中。U1 snRNP颗粒由一个U1 RNA核心和一簇RNA结合蛋白包括70K、A和C蛋白组成。抗RNP抗体通过结合U1 snRNP抑制RNA的剪切。
虽然体液的抗RNP自身抗体应答是MCTD的症候，但，例如70K蛋白，同时含有T细胞和B细胞表位，并且体液和细胞的自身免疫表现是相互关联的。对70K表位应答的T细胞克隆已经得到分离，且包括具有细胞毒T淋巴细胞活性的CD8+T细胞和具有辅助T细胞活性的CD4+T细胞。70KT细胞的一些表位与HIV-1的T细胞表位具有同源性(见Souvas和Takehana，同上，1994)。如本文所公开的，CAEV蛋白，包括CAEV gp135，也含有与70K和HIV-1T细胞表位同源的表位(见表1，同上)。因此，含有这样的表位的一个CAEV免疫原可以诱导广泛的抗HIV-1的交叉反应免疫应答。
考虑到HIV-1感染与MCTD的临床相似性以及MCTD患者中与其他健康个体中CAEV感染的鉴定，确定感染CAEV的个体是否发生了与HIV-1交叉反应的免疫应答是很重要的。从CAEV感染的个体所获得的血液中对HIV-1蛋白gp120的免疫水平通过ELISA和western印迹分析(见实施例1E.)进行测定。除了揭示了CAEV感染和对HIV-1的免疫应答的发生之间的关系，我们对CAEV感染和MCTD之间的关系也进行了调查。因为一些来自墨西哥和中美洲的MCTD患者带有与HIV-1 gp120反应的抗体并能体外抑制HIV-1感染，所以仍需确定未患MCTD的CAEV感染者是否也产生了对HIV-1的免疫。
如本文所公开的，人的CAEV感染，不论是患MCTD或是健康的，刺激了对HIV-1 gp 120或p24病毒抗原交叉反应的体液免疫应答(见实施例1E.)。明显地，通过使用临床认可的试验确定没有一个被检测的人受HIV-1感染。此结果表明带CAEV免疫原的个体的免疫可以产生对HIV-1的交叉反应免疫，因而在未受感染的个体中增强了对HIV-1感染的抗性或在HIV-1感染的个体中减轻了HIV-1导致的病理反应的程度。进而，CAEV感染患者的系统风湿病如MCTD继而增强了对HIV-1交叉反应的水平。因此CAEV免疫原的施用，优选地结合一个与MCTD相关的自身抗体，如70K免疫原，它能够产生对HIV-1交叉反应的免疫应答(Douvas和Takehana，同上，1994)，可以更为有效地刺激人体中对HIV-1交叉反应的免疫应答。
一个CAEV免疫原可以自己产生免疫原性或者附着于一个载体分子如小牛血清白蛋白或惰性载体，如此的CAEV免疫原-载体复合物可刺激免疫应答(见例如，Harlow和Lane，同上，1988)。例如，当一个疫苗含有完整的CAEV病毒时，病毒具有免疫原性并可刺激接种个体的免疫应答。CAEV可方便地从美国典型培养物保藏中心获得(ATCCVR-905)。
本发明的疫苗也可以含有CAEV蛋白的一个肽片段如gp135(见表1，同上)。表1中列举的或者本发明所用的每种肽本身可能不具有免疫原性，但是众所周知，这种半抗原可以附着在一个载体分子上，从而呈现出免疫原性(例如见，Harlow和Lane，同上，1988)。可在体内或体外刺激免疫应答。例如，包括T细胞和B细胞的免疫细胞可从个体中取得后置于组织培养基中。然后使细胞接触CAEV免疫原，它可以刺激这些免疫细胞并诱导T辅助细胞和细胞毒T细胞的免疫应答。
本发明的疫苗除CAEV免疫原外，还含有制药学上可接受的载体，所述载体是为本领域所熟知的，包括水溶液如生理缓冲盐水或其他溶剂或介质如乙二醇、甘油、油脂如橄榄油或可注射的有机酯。如愿意，本发明的疫苗可含有作为佐剂的制药学上可接受的载体。佐剂如明矾或弗氏完全或非完全佐剂，或者其他适当的佐剂是本领域所熟知的，并可以商业购得的(Ribi Immunochem Research,Inc.:Hamilton MT)。添加佐剂通常能降低刺激免疫应答所需的CAEV免疫原的用量。
制药学上可接受的载体还可以含有生理学可接受的化合物，其作用能够，例如，稳定CAEV免疫原或增强它的吸收。生理学可接受化合物包括，例如，碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖；抗氧化物，如维生素C或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白，或者其他稳定剂或赋型剂。本领域中的熟练技术人员会根据例如该疫苗的施用常规和CAEV免疫原特定的物理化学性质，选择这些制药学上可接受的载体，包括生理学可接受的化合物。刺激免疫应答的疫苗施用的各种途径为本领域所熟知，它们包括，例如，静脉的、真皮的或皮下注射，口服和经皮肤给药。
如果需要，本发明的疫苗也可以含有一个70K免疫原，或者其肽片段，它能够作为代用免疫原刺激对HIV-1交叉反应的免疫应答(Douvas和Takehana，同上，1994)。疫苗中添加70K免疫原是有益的，因为它是一个自身免疫蛋白，代表富集了能够刺激早期的共享克隆的序列，这些克隆是抗70K的潜在的T细胞和B细胞，能够迅速被激活以与HIV-1反应或可以产生交叉反应的抗gp120/41抗体从而中和HIV-1。添加70K免疫原的益处还在于它可以产生带有gp120/41的共享克隆的共同扩增或协同扩增。此外，可以筛选不含有刺激抗体的氨基酸序列的70K免疫原性片段(Douvas和Takehana，同上，1994)，这些刺激的抗体能够调节与HIV-1感染有关的毒性作用的。
CAEV免疫原可以通过许多方法产生，例如，通过重组DNA的方法或通过化学合成的方法。例如，如果需要一个CAEV蛋白或其肽片段，可以通过将适当的CAEV编码序列克隆到一个杆状病毒载体上，在适当的宿主细胞中表达该蛋白或肽，再分离出，从而获得该蛋白或肽片段。CAEV的核酸序列可从GenBank获得，编号M33677(也可见，Saltarelli等，Virology 179:347-364(1990)；Knowles等，J.Virol.65:5744-5750(1991)，各文献在此引入作参考)。此外，也可设计在哺乳动物细胞中产生重组蛋白，这样可继续所需的翻译后修饰。适当的表达载体和宿主细胞为本领域所熟知并可商业购得，熟练的技术人员将根据特定的需要知道选择适当的载体/宿主细胞系统。
当所选择的CAEV免疫原是一个肽免疫原时，例如，表1中所列举的CAEV免疫原，该肽可以通过所熟知的化学合成方法合成，方法包括，例如，自动固相方法。CAEV的化学合成可能是特别需要的，因为该方法可以将氨基酸类似物引入肽中。例如，可设计合成一个含有一个或多个D型氨基酸替代相应的天然存在的L型氨基酸的CAEV免疫原。D型氨基酸的使用可提供所需的CAEV免疫原特性，包括例如，增加肽的稳定性从而可特别用于制备不依赖冷冻设备的或在世界不常使用冷冻设备的地区应用的疫苗。此外如果希望，可以合成一个含有额外的半胱氨酸残基的CAEV多肽，这样利于在适当的氧化条件下肽与基质或载体分子如匙孔嘁血蓝蛋白的特异附着。
本发明还提供了一种方法，通过对接受者施用治疗有效量的CAEV免疫原，从而刺激个体抗CAEV的免疫应答，或刺激与抗HIV-1交叉反应的免疫应答。如果希望，VMV或VMV的一个免疫原性片段可以用来替代CAEV免疫原。此外，有益的是对一个体可施用70K免疫原，既可结合使用CAEV或VMV免疫原也可作单独处理。
虽然在此所述的是对一个个体施用CAEV免疫原或者对一个个体作免疫接种，但是我们知道可以在体内或来自体内刺激抗HIV-1的免疫应答。所有这些方法均包括在本发明之中。例如，当待治疗的个体患有AIDS时，可设计来自体内刺激抗HIV-1的免疫应答。在这种情况下，从个体中取出淋巴细胞并在培养中免疫。同时，可扩增淋巴细胞数量。经刺激的扩充的免疫细胞再输入进个体，从而对该个体提供治疗效果。进一步，即使本发明的方法如来自体内免疫和再输入方法不能治愈，这种治疗也可起减轻作用，从而延长AIDS患者的生命。
如本文所公开的，以CAEV免疫原对个体的免疫可刺激与抗HIV-1交叉反应的免疫应答。利用CAEV免疫原的抗HIV-1免疫接种，既可单独也可结合70K免疫原进行，具有显著的优点，例如，与应用灭活的或减毒的HIV-1结构或HIV-1蛋白抗体作为疫苗相比，CAEV据知不是人的致病原，它也不感染T细胞。此外，CAEV感染，尤其是MCTD患者中，提供了对HIV-1广泛的基于免疫原性的抗性，包括抗各种HIV-1病毒株的B细胞应答和T细胞应答。例如，在实施例1中公开的研究中所检测的拉丁美洲人群内，大于60％的个体感染有CAEV(实施例1D.)。此外，22％的CAEV感染的MCTD患者表现出对HIV-1交叉反应(实施例1E.)。CAEV免疫原免疫接种的对照方法，单独或结合70K免疫原，可增强个体建立对HIV-1交叉反应免疫性的几率(实施例2)。
为了刺激抗HIV-1的免疫应答，对个体施用治疗有效量的CAEV免疫原。如本文所使用的，“治疗有效量”是指刺激免疫应答所需的免疫原量。免疫原如CAEV免疫原的用量提供出的有效量是变化的，它取决于，例如，是在体内还是来自体内刺激免疫应答；是首次使用还是加强施用；是否结合免疫原的施用而使用佐剂；以及当体内施用时的途径。通常，CAEV免疫原的有效量约为50μg至50mg，优选地为500μg至5mg。例如当施用CAEV病毒时，颗粒状CAEV免疫原的有效量可为100μg至2mg，而当施用可溶性CAEV免疫原时，有效量可约为1mg至5mg。确定免疫原的有效量的方法是常规的且为本领域所熟知(见实施例2；也可见，Powell和Newman,Vaccine Design:The subunitand adjuvant approach(Plenum Publ.Corp.；1994)，在此引入作参考)。
对个体免疫接种以刺激免疫应答的方法是熟知的(Harlow和Lane,同上，1988)。例如，免疫原可以皮内、肌内注射或静脉内施用。此外，更有益处的施用是进行一次或多次加强免疫接种，这种加强接种的时间可通过，例如利用本文所公开的方法测量抗HIV-1的抗体在被接种者血清中的量来实验确定。
本发明的方法可用于增强以前未接触HIV-1的个体对HIV-1感染的抗性。类似地，本发明的方法可用于增强以前未接触CAEV的人或其他易感的非山羊哺乳动物对CAEV感染的抗性。如本文所使用的，“增强抗性”在用于对HIV-1或CAEV感染的抗性时，是指因抗病毒免疫应答的刺激，继而产生记忆免疫细胞，这些细胞迅速地动员抵抗和隔绝后来的病毒感染，从而使得被病毒感染的可能性降低。在CAEV的情况下，抗性的增强是由于用CAEV或VMV免疫原接种，而在HIV-1的情况下，抗性的增强是由于接种刺激对HIV-1交叉反应的免疫应答的CAEV或VMV免疫原。
此外，本发明的方法可用于已感染病毒并由于感染导致病理反应的个体，包括人或非山羊哺乳动物。尤其是，对HIV-1感染的人施用CAEV免疫原以刺激个体中与HIV-1交叉反应的免疫应答，从而可用于降低HIV-1的免疫病理反应。特别地，这种在HIV-1感染个体中的应答的刺激可以防止HIV-1感染在该个体中的进一步扩散，从而降低该个体的T细胞消耗。HIV-1感染个体观测到的许多病理反应是由于免疫系统的消耗引起的，所以免疫系统消耗降低的处理能够提供有益治疗效果。
基于本文所公开的研究，大量的，特别是墨西哥和中美洲的人群，可能感染CAEV。因此，重要的是要有一种简单便宜的试验以诊断CAEV感染的个体。
故，本发明进而提供了一种方法，可对怀疑受CAEV感染的非山羊哺乳动物，优选地是人，进行CAEV感染的诊断。举例性的诊断CAEV感染方法包括ELISA试验、PCR扩增试验、核酸探针试验和其他等。
在一个实施方案中，例如，本发明提供了一种酶联免疫吸附试验(ELISA)，可用于诊断怀疑具有CAEV感染个体中的CAEV感染，通过从该个体身上获得如血液样品，将样品与一个CAEV抗原接触，并检测样品中抗CAEV抗体与该CAEV抗原的结合，这种结合的检出即是CAEV感染的诊断。因此，本发明进行诊断试验的方法和试剂为在此公开的或为本领域所熟知的(例如见，Litt,U.S.专利4,092,408,1978年5月30日授权，在此引入作参考)。
本发明所列举的ELISA方法(实施例1C.)，其中的CAEV gp135用作CAEV抗原。但是，本发明的方法所用的CAEV抗原可选自基本上任何抗原性的CAEV片段或者可以是整个CAEV病毒颗粒。为了便于描述本发明的方法，“CAEV抗原”意为上面所述的“CAEV免疫原”的同义词。
竞争性ELISA可特别用于对从一个体获得的样品进行CAEV感染的诊断。竞争性ELISA的操作类似于标准ELISA，除了在反应中加入了一个或多个单克隆抗体与样品中的抗CAEV抗体竞争，每个单克隆抗体特异于一个CAEV表位，如那些表1所示的CAEV免疫原确定的表位。使用竞争性ELISA可以提高检测样品中抗CAEV抗体存在的灵敏度。竞争性ELISA的操作方法如Buechler等的阈值配体受体试验(U.S.专利5.089,391,1992年2月18日授权，在此引入作参考)为本领域所熟知。
对特定的CAEV表位特异的单克隆抗体的制备可利用熟知的方法(见，例如，Harlow和Lane，同上，1988)。例如，可用CAEV免疫原(见，例如，表1)免疫小鼠，然后从具有高滴度的针对特定CAEV免疫原的抗体的小鼠上获取脾脏细胞。确定具有合适的特异性的和亲和性的抗CAEV免疫原抗体的方法，可按照本发明所公开的或其他本领域所熟知的方法进行，包括，例如，酶联免疫吸附试验、放射性免疫试验和沉淀试验(见实施例1；也可见，Harlow和Lane，同上，1988，第14章)。小鼠的脾脏细胞与适当的骨髓瘤细胞系如SP/02或P3x653.Ag8骨髓瘤细胞融合，以产生杂交瘤细胞。克隆的杂交瘤细胞系可利用标记的CAEV免疫原扫描，以确定分泌特异于CAEV免疫原的单克隆抗体的克隆。将表达具有所需特异性和亲和性的抗体的杂交瘤分离出来，作为在竞争性ELISA中使用的单克隆抗体的连续来源。
作为本文所使用的“样品”一词，当用于本发明的诊断方法中时是指，一个组织标本或液体标本，比如血液，可以是全血、血浆或血清、或者是小便标本，可以从用于检测CAEV感染的人或其他非山羊哺乳动物个体中获得。获取这种样品，包括合适的组织样品的方法，是本领域中所熟知的和常规的。
本发明的一个方法可以部分地根据从一个个体获取的样品中存在抗CAEV抗体，而诊断该个体的CAEV感染。从怀疑受CAEV感染的个体中获取的样品，在适当的条件下与CAEV抗原接触，如果样品中存在抗体的话，该条件可使CAEV抗原与抗CAEV的抗体结合。因此，本发明的一个方法可以是在此列举的ELISA，或者可以是放射性免疫试验、western印迹或其他此类基于检测特异抗原-抗体反应的试验(见，例如，Harlow和Lane，同上，1988；也可见，Gribnau等，U.S.专利4,373,932,1983年2月15日授权，在此引入作参考)。
抗原-抗体反应如CAEV抗原与抗CAEV的抗体的反应的检测方法为本领域所熟知的，包括例如，使用一个可检测的标记的抗原或使用一个可检测的标记的第二抗体，该第二抗体可与一特定类别的抗体如某种哺乳动物的IgG,IgA,IgM,IgA,IgD或IgE特异结合(见，例如，Greene和David,U.S.专利4,376,110,1983年8月授权，在此引入作参考)。例如，如果样品是人的血清或血浆样品，第二抗体可以是山羊抗人IgG(见实施例1C.)。这种第二抗体可以通过所熟知的方法制备或者从商业来源购得。用于标记CAEV抗原或抗体的方法为本领域所熟知的和常规的。
在举例性的ELISA中CAEVgp135被选作抗原，因为在从一个人个体上收集的抗血清中抗gp135抗体的存在，除了表明该个体被CAEV感染，也表明该个体可能带有与HIV-1交叉反应的抗体。实际上，被CAEV ELISA鉴别为CAEV感染的人个体中有22％也具有与HIV-1交叉反应的抗体，如由HIV-1 ELISA和Western印迹分析所确定(实施例1E.)。此外，通过CAEV ELISA确定的感染CAEV的MCTD个体中，有55％也带有与HIV-1交叉反应的抗体。本发明的ELISA也可用于扫描人之外的非山羊哺乳动物，包括例如，其他的怀疑受CAEV感染的哺乳动物，从而确定CAEV感染的个体。
本发明的方法如ELISA在以试剂盒形式提供时显得尤为方便。这种ELISA试剂盒，例如，可含有附着于固体支持物如塑料支持物上的CAEV抗原如gp135。例如，该试剂盒可含有一个微量滴定板如96孔板，在板上的一些或所有孔内附有一种CAEV抗原。其他可用于ELISA的固体支持物为本领域所熟知的。在ELISA中利用例如一个96孔板还有其他的优点，通过选择适当的检测标记如放射性、荧光或发光标记，试验可以自动化，从而能够快速检测大量的样品，如果愿意也可包括标准或对照样品。
试剂盒如ELISA试剂盒，如果希望还可含有一个标准试剂如预定量的抗gp135抗体。这种试剂可以提供确定在样品中如来自个体的血液样品或血清样品中是否含有一定量的循环的抗CAEV抗体的手段。因而，本发明的试剂盒可含有，例如，一种适当的缓冲液，它能提供适当的条件，使得样品中存在的抗CAEV的抗体与附着在固体支持物上的CAEV抗原结合。通过以这种试剂盒形式提供的试剂，ELISA试验可以标准化，这样在不同时间不同地点进行的试验能够相互比较。可见，对于一个所选的CAEV抗原，应分析一定数量的来自非感染个体(对照)的血清样品，从而确定对该特定的CAEV抗原反应的基线水平。
本发明的方法如所列举的CAEV ELISA可以用于检测循环的抗CAEV抗体的存在或跟踪免疫应答的发展。例如，个体可用本发明的疫苗免疫接种，并利用本发明的ELISA跟踪其免疫应答的发展。这种方法可用于确定是否需要加强免疫，以及如果需要，确定加强免疫的最佳时间。此外，CAEV试验如所列举的ELISA可用于扫描献血者提供的血液样品，以鉴定和去除血库中受CAEV污染的血液。
在本发明的另一个实施方案中，还提供了基于核酸的方法，用于在非山羊哺乳动物个体中，优选地在人中，检测CAEV感染。一个这种方法包括在所说的个体中检测相应于CAEV核酸的基因组或转录mRNA序列。
在一个实施方案中，检测的CAEV核酸序列包括特有的CAEV人分离物(即人-CAEV)。例如，在相应于经SEQ ID Nos:16和17所述引物扩增的173核苷酸片段的基因组区域中，发现人-CAEV病毒的该特定区域至少有两个突变是人源特定的。这些突变是在173gag区域扩增产物上对应于56位的鸟嘌呤和77位的胞嘧啶。除了上述的人源特定的突变，一旦阐述了另一个人-CAEV序列，本领域的熟练人员可容易地得到存在于人-CAEV分离物中的其他特定的核酸区域。因此，本文考虑使用这些在人-CAEV基因组中存在的大量的特定人核酸区域。
本发明的另一个实施方案提供了一种诊断个体，优选地是人的CAEV感染的方法。所说的方法包括a)将来自一个怀疑受CAEV感染的个体的核酸与引物混合，在利于形成可检测的扩增产物的条件下，扩增CAEV基因组核酸片段，以及b)检测含有CAEV基因组核酸的扩增产物，根据该检测说明上述个体受到CAEV的感染。
在此PCR诊断试验中所使用的合适的引物包括至少一对能够扩增CAEV核酸的引物。优选地，所选引物扩增CAEV特异的核酸，而不扩增HIV-1序列。例如包括SEQ ID Nos:16和17所述的一组嵌套PCR引物，它可扩增人-CAEV的gag基因的一个173个核苷酸区域；或者包括SEQ ID Nos:20和21所述的一组嵌套引物，它可扩增人-CAEV的pol基因的一个146个核苷酸区域。
虽然本文考虑使用的是一个单一引物对，但是在本发明的基于PCR的诊断试验的一个特别的实施方案中，对每个分析个体可以使用扩增不同的特定核苷酸区域的多套引物(例如，引物对或嵌套引物)。由于逆转录表达据知有很高的突变率，所以优选地在本发明的该诊断方法中使用多套引物，这样可以增加感染个体的CAEV被实际检测出来的可能性。本领域的熟练技术人员很容易确定引物对的数量，以确保至少99％的CAEV感染个体能被检测出来。例如，本文使用1至100个或者更多个引物对。在一个实施方案中，本文使用了一组至少10至70个引物对或嵌套引物。在另一个实施方案中，使用了至少20至50个引物对。
在本发明的另一个实施方案中，还提供了诊断系统，优选地是试剂盒形式的，其中包括至少一个以适当材料包装的诊断核酸。该诊断核酸优选地来自人CAEV核酸。
本发明的诊断系统可用于分析CAEV感染的存在与否。一个合适的诊断系统包括至少一个本发明的核酸，优选地是两个或更多个本发明的核酸，它们作为单独包装的化学试剂，其量应至少足够一次分析所需。使用包装试剂的指导也典型地包括在其中。本领域的熟练技术人员可以很容易地将本发明的核酸探针和/或引物与适当的缓冲液和溶液组合形成试剂盒，以进行本文所述本发明方法的操作。
本文所用的术语“包装材料”是指一种或多种用于盛放该试剂盒内容物如本发明的核酸探针或引物的物理结构。该包装材料以熟知的方法构建，优选地应提供一个无菌无污染的环境。该包装材料带有一个标签，以表示本发明的核酸可用于CAEV基因组或转录mRNA核酸的检测，从而诊断CAEV感染的存在。此外，包装材料含有说明书，以说明如何使用试剂盒中的材料检测特定序列以及诊断CAEV感染的存在。
本文使用的这些与诊断系统有关的包装材料是那些基于核酸的诊断系统所习惯上使用的。本文所用的“包装”一词是指一种固体基质或材料如玻璃、塑料、纸张、金属箔、以及此类的能够在一定的空间内容纳本发明的分离的核酸，寡核苷酸，或引物。因此，例如，包装可以是一个玻璃小瓶，用以容纳所需的毫克级数量的核酸、寡核苷酸或引物，或者可以是一个微量滴定板孔，其中已经附着有所需的毫克级的核酸探针。
“使用说明”通常包括描述试剂浓度或至少一个试验方法的参数，如待混合试剂与样品的相对用量，试剂/样品混合物的保存时间，温度，缓冲条件，以及此类的明确说明。
下列实施例意在对本发明举例说明，而非限制本发明。
实施例1受CAEV感染个体中HIV-1交叉反应的鉴定本实施例描述了用于证明受CAEV感染个体产生与HIV-1 gp120交叉反应的免疫应答的方法。
A．人类受试者本文所公开的研究中涉及50个以上的人受试者。受试者根据它们的疾病状况(MCTD或正常)以及它们的来源地(墨西哥/中美洲或美国)进行分类，分组如下A组MCTD-拉丁美洲出生的女性，临床诊断患有MCTD。
B组MCTD-美国出生的黑种或白种女性，临床诊断患有MCTD。
C组MTCD-瓜达拉加拉的女性居民，临床诊断患有MCTD。
D组正常(非MTCD)-拉丁美洲出生的女性。
E组正常-非拉丁美洲的女性和男性，包括2个治疗被感染山羊的兽医服务机构的工人。
F组正常-距瓜达拉加拉30km的一个村子的4个女性和4个男性居民，包括一个有150只山羊牧群的拥有者和其5个家人。
G组硬皮症患者，都带有抗Scl-70/1型抗体。
B．血液样品和试剂收集人和山羊(见下面的1F.部分)的血液样品，其血清组分用于免疫学检测。用于在ELISA和western印迹试验中测量血清抗体的抗原包括粗CAEV，和亲和纯化的gp135及重组HIV-1gp120和HIV-1 p24。重组HIV-1 gp120和p24购自Intracel(Shepreth UK)。粗CAEV的制备如Klevjer Anderson等所述，(Virology110:113-119(1981)，在此引入作参考)。简要地说，CAEV在初级胎山羊关节滑液膜(SM)细胞中培养，该细胞培养于其中补加2mM的谷氨酰胺，100mg/ml链霉素和100单位/ml的青霉素和10％FBS的碳酸氢盐-HEPES缓冲液，收集CAEV感染的SM培养物培养基，600g离心澄清。
粗CAEV制品的等份液体可以冻存于-70℃。该粗CAEV制品可用于分离纯化的CAEV或者用于制备纯化的CAEV蛋白。纯化的CAEV蛋白如纯化的CAEV gp135也可以利用常规的重组DNA技术，通过将一个编码gp135的核酸分子克隆到一个表达载体上并纯化gp135而制备，如下面所述。
利用一个结合在层析基质上的抗gp135抗体从粗CAEV制品中亲和纯化出CAEVgp135。简要地说，将粗CAEV制品调节成0.1％SDS溶液，以裂解CAEV病毒颗粒，然后上抗gp135抗体的亲和层析柱，或将重组产生的gp135上此亲和柱。
从CAEV感染的山羊血清中或者从来自用CAEV gp135肽片段免疫的山羊的血清中，分离抗gp135抗体。如果使用CAEV感染的山羊作为血清来源，则应使用含有高滴度抗gp135抗体的山羊作为血清来源。这种血清可以通过western印迹分析扫描来自几个不同山羊的血清样品而确定。通过硫酸铵沉淀，然后经层析柱收集IgG组分，而从血清中分离抗gp135抗体。将此抗gp135抗体附着于层析基质如溴化氰激活的SepharoseTM。分离IgG抗体和将此类抗体附着于基质上的方法是本领域所熟知的和常规的(见，例如，Harlow和Lane，同上，1988)。
在PBS中的粗CAEV制品和重组产生的gp135上样至抗gp135抗体亲和柱上，让gp135与抗体于4℃结合过夜。结合后，柱子用PBS清洗，然后以10mM HCl,0.15M NaCl洗脱结合的gp135。gp135抗原的纯度通过SDS-PAGE和银染确定。
C．CAEV ELISA和Western印迹试验对于ELISA试验，粗CAEV或亲和纯化的gp135抗原用磷酸缓冲液(PBS)1∶20稀释，终浓度gp135约为μg/ml，在96孔板(Corning)的每个孔内加入50μl。盖好板在4℃孵育过夜，然后去除抗原，用901μl洗涤液(1mg BSA/ml PBS)洗涤每个孔3次，每次1分钟。在每个孔中加入100μl的终止液(10mg BSA/ml PBS)，于室温(RT)孵育60分钟，然后去除终止液，每个孔用洗涤液洗涤3次，每次1分钟。
在每个孔中加入50μl的稀释血清样品(1∶100于洗涤液中)，板于室温孵育60分钟。空的孔(对照)只含有洗涤液。孵育后，板孔作如上的洗涤，然后加入50μl第二抗体并进行如上的孵育。当分析的血清样品是来自人的，则第二抗体是于PBS中1∶1000稀释的结合于辣根过氧化物酶(HRP；Zymed Laboratories,Inc.；South SanFrancisco CA；cat.#62-8420)的山羊抗人IgG。当分析的血清样品是来自山羊的，则第二抗体是于PBS中1∶3000稀释的兔抗山羊IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch Labs,Inc.；West Grove PA；cat.#30535003,lot#28671)。孵育后，每个孔用洗涤液再用PBS各洗涤2次。
在每个孔中加入75μl的显色液(25ml的ELISA缓冲液中含有10mgO-苯二胺(Sigma)；新鲜制备的50μl 30％H2O2；ELISA缓冲液为500ml0.1M柠檬酸，500ml 0.2M Na2HPO4,pH5.0)，于室温下黑暗处孵育10分钟。加入25μl6N H2SO4终止显色，然后在OD490处测定吸收值。
对于CAEV Western印迹分析，在SDS样品缓冲液(Laemmli,Nature227:680-685(1970)，在此引入作参考)中的0.1-0.5μggp135等份样品，通过10％的SDS-PAGE分离，然后电泳转移至一个硝酸纤维素膜上。该膜在50ml的终止缓冲液(含1％BSA的WBS；1升WBS中含有9g NaCl,1.21g Tris碱，0.25ml NP-40,pH7.4)保温1小时，然后用洗涤液(含0.1％BSA的WBS)洗涤3次。将该膜按凝胶上的泳道剪成条。
血清样品以1∶100稀释(20μl血清/2ml洗涤液；如果用血浆则40μl/2ml)，然后加入到含有醋酸纤维膜条的盘子中在室温下摇动60分钟。孵育后，纤维膜条用洗涤液洗涤3次，再加入2ml第二抗体(如上，但用洗涤液稀释)，室温下孵育60分钟。纤维膜条用洗涤液洗涤3次，加入2ml显色液(10mg 3,3-二氨基联苯四氯酸(Sigma ChemicalCo,；St.Louis Mo；cat.#D 5905),1ml 0.05M Tris,pH7.5,39mlWBS,80μlH2O2，应新鲜制备)。在室温下轻微摇动，继续孵育10分钟，然后将膜转至蒸馏水中终止显色。
来自拉丁美洲出生的MCTD患者，包括那些来自LAC/USC(A组)和那些来自墨西哥的瓜达拉加拉(C组)的血清样品中，有62％被观测出具有对CAEV提取物和对纯化的gp135的高度反应性。来自疾病对照的(G组)和来自非拉丁美洲健康个体的血清样品，不包括那两个兽医的，呈弱反应性或无反应。在western印迹中与CAEV反应的人血清样品含有的抗体与来自CAEV感染山羊的血清样品反应的抗体针对相同的多肽。
来自正常个体的血清样品对CAEV的反应性，与该个体具有饮用生山羊奶或接触山羊历史相关。最高的反应存在于那个瓜达拉加拉的山羊牧群拥有者上，和一个兽医上，他除了治疗受CAEV感染的山羊还据说经常消费生山羊奶。另一个兽医，也治疗受CAEV感染的山羊，他也有阳性反应。
总之，39个MCTD患者中的22个和23个非MCTD个体中的11个具有CAEV感染的阳性反应，包括33个拉丁美洲MCTD患者中的20个(61％)和14个拉丁美洲非MCTD个体中的9个(64％，见表2)。这些结果表明本研究中所检测的60％以上的拉丁美洲个体感染了CAEV。在CAEV反应个体中，来自拉丁美洲MCTD患者血清样品的反应性要高于来自非MCTD拉丁美洲个体。
表2 MCTD患者及正常人中CAEV gp135和HIV-1 gp120反应性的关系阳性gp135 阴性gp1351．MCTD3．MCTDn=22；拉丁美洲人=20 n=17；拉丁美洲人=13总gp120(+) 12/22=55％总gp120(+) 0/17=0％拉丁美洲人gp120(+)11/20=55％拉丁美洲人gp120(+)0/13=0％2．正常人4．正常人n=11；拉丁美洲人=9 n=9；拉丁美洲人=5总gp120(+) 4/11=36％ 总gp120(+)0/9=0％拉丁美洲人gp120(+) 2/9=22％拉丁美洲人gp120(+) 0/5=0％小节1:CAEV(+)拉丁美洲人总数 29/47=62％MEC-拉丁美洲人 20/33=61％正常的拉丁美洲人9/14=64％非拉丁美洲人总数2/15=13％MCTD-非拉丁美洲人 2/6=33％正常的非拉丁美洲人 2/6=33％小节2:CAEV(+)/gp120(+)拉丁美洲人MCTD 12/22=55％拉丁美洲人正常 2/9=22％CAEV(-)/gp120(+)拉丁美洲人MCTD和正常0/20=0％非拉丁美洲人MCTD和正常 0/20=0％D．PCR分析利用从外周血单核细胞(PBMC)中分离的基因组DNA进行确定CAEVgag和pol基因的PCR分析。通过对收集自所检测的人个体或来自WA、UC Davi和Gua山羊的全柠檬酸化血或肝素化血，进行Ficoll密度梯度离心，而获得PBMC(见下)。
编码gag蛋白区的CAEV特异的基因组DNA通过两步扩增。第一步得到的扩增产物为CAEV的第1057至1553核苷酸。引物为5’-GCAGTTGGCATATTATGCTACTAC-3’(SEQ ID NO:14；CAEV的第1057至1080核苷酸)和5’-CTTGTTGTACTCTTTGTCCTAGTG-3’(SEQ ID NO:15；CAEV的第1530至1553核苷酸)。第二步得到的扩增产物在第一步扩增产物之内，从第1329至1501核苷酸。第二步的引物为5’-GAGCAGTAAGACATATGGCGCAC-3’(SEQ ID NO:16；第1329至1351核苷酸)和5’-TGATGCATTTGTATAAGATAGTGTTAGCTTT-3’(SEQ ID NO:17；CAEV的第1471至1501核苷酸)。
编码CAEVpol的DNA也通过PCR检测。其第一步扩增的引物为5’-GGATTTGAACTACACCCGCAG-3’(SEQ ID NO:18；CAEV的第2845至2865核苷酸)和5’-CCTGTTGATACTATGAACCCTAGAC-3’(SEQ ID NO:19；CAEV的第3494至3518核苷酸)。第二步的引物为5’-AAGAACCTAAGCATCCCGCAAC-3’(SEQ ID NO:20；第3223至3244核苷酸)和GTGATGTTCCCTAATTGCAATTCTAGTC-3’(SEQ ID NO:21；第3341至3368核苷酸)。
扩增操作为退火温度52℃，延伸温度72℃，进行38个循环。按制造商的推荐条件使用Taq多聚酶或者pfu Taq多聚酶(Promega Corp.；Madison WI)。将1μl第一步扩增的反应混合物用于第二步扩增，操作条件相同。第二步扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，经洗脱适当条带而收集。按照制造商推荐条件，扩增的DNA样品然后克隆进一个TA3 pCRTM载体(Invitrogen；La Jolla CA)，并使用SequenaseTM2.0版的DNA测序盒(U.S.Biochemical Corp.；Cleveland OH)进行测序。将克隆的DNA序列与参照的CAEV DNA序列(GenBank编号M33677)相比较。
PCR分析揭示CAEV原病毒DNA存在于ELISA或western印迹分析确定的CAEV阳性个体的基因组中。特别是，从MCTD患者(A组)以及从CAEV感染的UC Davis山羊中扩增出了编码CAEV gag和pol序列的DNA。与参照的CAEV gag序列的比较表明，MCTD患者中的gag序列与参照序列有8.2％的分歧，UC Davis山羊的gag序列有8.8％的分歧。此外，与参照的CAEV pol序列的比较表明，MCTD患者中的CAEVpol序列与参照序列有7.6％的分歧，UC Davis山羊的CAEV pol序列有7.6％的分歧。
存在于人基因组DNA样品中的CAEV序列与参照山羊的CAEV序列具有较高相似程度，这给人的CAEV感染提供了确定的证据。序列间约8％的平均分歧程度表明人的CAEV感染可归究于一个特定的、人适应的CAEV病毒株。其他的DNA测序可分析人适应的CAEV病毒株是否导致人CAEV感染。
为了获得CAEV在人PBMC中存在的进一步直接证据，通过嵌合PCR从8个gp 135(+)个体中扩增了病毒gag和pol基因序列。通过RT-PCR从人个体样本Hmc4的无细胞血浆中也扩增出CAEV gag。从11个gp135(-)个体的PBMC DNA中扩增CAEV gag和pol序列的结果是阴性的。所有用于CAEV gag和pol PCR的DNA样品也进行了使用HIV-1 gag和pol引物的PCR，且除了HIV(+)对照组之外全部呈HIV-1阴性。从4个gp 135(+)山羊的PBMC DNA中也扩增出CAEV gag序列。2个CAEVgp135(+)山羊(gD1和gWA19)来自美国兽医牧群；gT38和gT42是墨西哥gp135(+)山羊。22个人PBNC gag克隆，3个HMC4血浆gag克隆和11个山羊PBMC gag克隆进行了测序并与发表的CAEV-CO gag序列(M.Saltrarelli，等，Virology,179:347(1990))进行比较。
扩增自7个个体的8个人gag序列的系统进化分析如图1所示。其还包括4个山羊gag序列。在图1和图2中分析的CAEV,Visna和OMVVSA gag序列的克隆和相应的GenBank查询编号如下Hmc4-c30(U69922),-c39(U69923),-c40(U69924),-c46(U69925),-c49(U69932),-c50(U69926),-fp-c254(U69933),-fp-c256(U69934),-fp-c261(U69935)；gD1c12(U69927),-c13(U69928),-c52(U69929),-c53(U69930)；Tn8-c144(U69931),-c147(U69909),-c151(U69910),-c155(U69911)；gWa19-c74(U69918),-c75(U69919),-c77(U69920),-c80(U69921)；gT42-c84(U69916),-c90(U69917)；gT38-c93(U69915)；En1-c108(U69900),-c110(69901)；Oc1-c120(U69905),-c136(U69906),-c139(U69907)；Oc2-c167(U69908)；Umc5-c184(U69912),-c185(U69913),-c190(U69914)；Hmc1-c209(U69902),-c212(U69903),-c213(U69904)；CAEV-CO(M33677)；Visna(M18039)；OMVVSA(M31646).除了JSR是来自Jaagsiekte绵羊的逆转录病毒之外,图1中所有其他序列都是慢病毒序列。此外，本文中所讨论的CAEV pol克隆和相应的查询编号如下Hmc4-c10(U69948),-c12(U69949),-c19(U69950),-c20(U69951),-c28(U69952)；gD1-c1(U69944),-c2(U69945),-c3(U69946),-c30(U69947)；gWa19-c51(U69953),-c52(U69954),-c53(U69955),-c60(U69956)；En1-c43(U69940),-c46(U69941),-c47(U69942),-c48(U69943)；Gmc15-c37(U69936),-c38(U69937),-c41(U69938),-c42(U69939).
来自人CAEV gag序列与其他慢病毒CAEV-CO gag序列间的相关距离通过反向加权节俭算法(D,M.Hillis等，Science,264:671(1994).BT.M.Korber et al.,J.Viol.,68:6730(1994))来显示。应用PAUP3.1.1(D.L.Swofford,Illinois Natural History Survey,Urbana)进行非加权(普通)节俭算法。从开始的PAUP分析中得到12个明显置换频率，然后用Macclade(W.P.Maddison和D.R.Maddison,“Macclade:Analysis of phylogeny and characterevolution”,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,(1992))一个反向加权图得自于次置换频率矩阵中，然后引入到后面的节俭算法反向中。得到的分支长度估计是反向加权置换产生的复合的数量。所有来自实验个体的病毒gag序列和山羊gag序列与CAEV-CO gag相集。
使用MASE(D.v.Faulkner and J.Jurka,Trends biochem.Sci.,13:321,(1988))的SIMILARITY功能，确定了单核苷酸距离值，即Hamming距离。只有单核苷酸差异被计算，多核苷酸差异在此数据设置中没有遇到。通过Hamming距离测定，来自CAEV-CO gag的8个gag克隆的序列差异范围是5.3％-9.4％，相比之下，与发表的羊的maedivisna gag序列差异为23.4-28％。
为了获得人和山羊gag序列的个体内和个体间的差异，用普通节俭算法计算了33个克隆(图2)。如图1，所有人序列都与CAEV-CO相集。所有22个人gag克隆与CAEV-CO的平均序列差异为8.4±1.5％。
来自3个人个体(Hmc4,Gmc15和En1)和2个山羊(gD1和gWA19)的病毒序列，用CAEV嵌合pol引物，也从PBMC DNA中扩增出来。其pol序列与发表的CAEV-CO pol序列(M.Saltarelli,et al.,Virology,179:347(1990)的差异为4.8-8.2％，与羊maedi-visna pol(P.Sonigo et al.,Cell,42:369(1985))的差异为22.6-26％。这些pol序列的节俭算法分析得到的结果与gag(图1)的结果具有拓扑学同一性。约40％的gag和17％的pol核苷酸变化导致氨基酸改变。所有这些改变和＞80％的gag的改变是保守的(基本上是I_V,K_R和D_E)。因此gag和pol序列的计算表明本研究所测8个CAEV gp135(+)的人个体中带有一个与CAEV密切相近的沉默的慢病毒。如实施例2所述，通过RT-PCR从个体Hmc4的无细胞血浆中扩增CAEV gag序列，获得了该病毒体内复制的证据(图2)。
E．HIV-1 ELISA和western印迹试验认可的HIV-1 ELISA和western印迹诊断试剂盒购自OrganonTeknika(Cambridge UK)，试验按照供应商推荐的方法进行。根据使用该认可的HIV-1 ELISA和western印迹试验的临床标准，所有的人血清样品，除了已知的作为阳性对照的HIV-1阳性血清和抗体之外，都对HIV-1呈阴性。
ELISA和wetern印迹试验使用重组HIV-1抗原gp120和p24，和HRP-结合的兔抗山羊和山羊抗人的第二抗体(Zymed LaboratoriesInc.)按照以前所述的方法进行(Douvas和Takehana，同上，1994；Crow等，Cell.Immunol.121:99-112(1989)，在此引入供参考)。与CAEV gp135反应的血清，也与HIV-1 gp120反应，包括与HIV-1 gp120反应的全部12个MCTD的血清(见表2，同上)。
如上述I.C.部分所述，39个MCTD患者中的22个和23个非MCTD个体中的11个，对CAEV感染呈阳性，包括33个拉丁美洲MCTD患者中的20个(61％)和14个拉丁美洲非MCTD个体中的9个(64％；表2)。HIV-1试验的结果进而表明22个CAEV阳性拉丁美洲MCTD患者中的12个(55％)和9个阳性拉丁美洲非MCTD个体中的2个(22)也呈现出对HIV-1 gp120的阳性活性(见表2)。相反，没有一个CAEV阴性的拉丁美洲MCTD或者非MCTD个体对HIV-1 gp120呈阳性。
结果表明一些健康个体CAEV感染的发生不伴随临床疾病的发展，包括MCTD综合症的发展。然而接触CAEV导致的对CAEV的免疫应答，在部分受感染个体中也扩展到对HIV-1的免疫应答。此外，在CAEV阳性MCTD患者中，对CAEV的反应是CAEV阳性非MCTD个体的1.6倍，并且对HIV-1 gp120高度交叉反应的发生频率更高。这些结果表明CAEV感染导致对HIV-1交叉反应，并且交叉反应免疫应答在自身免疫疾病个体中得到了增强。
F．CAEV感染的山羊研究了如下的三组山羊Ⅰ组．WA-未曾感染的山羊和实验感染的山羊(CAEV)，饲养于华盛顿大学，Pullman WA.
Ⅱ组．UC Davis-天然感染的山羊，饲养于加州大学，Davis CA.
Ⅲ组．Gua-墨西哥Guadalajara的一个牧主拥有的20个天然感染(CAEV)的山羊，(见上F组)。
对从各个CAEV感染的和未曾感染的山羊中收集的血清样品进行测定。Gua山羊(Ⅲ组)缺少对CAEV gp135的反应，但约50％对CAEVgp38和gag反应。此外，Gua山羊表现出对HIV-1 gp120和p24强烈反应，而WA山羊则不。UC Davis山羊对gp135,gp120和p24都有反应。
这些结果表明WA和Gua山羊对CAEV和对HIV-1抗原的免疫反应存在差异。这些差异可能源于不同的病毒株或者由于不同的感染途径。例如，WA山羊是通过静脉感染的，而UC Davis山羊是通过摄取受感染的奶而天然感染的。
G．HIV-1病毒中和试验利用保存于生长培养基中的PHA激活的正常供体PBMC，以1×106个细胞/ml浓度作为用于感染的靶细胞，在48孔组织培养板上进行病毒中和试验。将各种稀释度的HIVIGTM，热灭活(56℃,30分钟)的MCTD血清或纯化的IgG与10至50 TCID50(组织培养感染剂量-50)的病毒一起在37℃孵育30分钟。
MCTD血清和HIVIGTM的阴性对照相应地包括，来自未被HIV-1感染的，和不受系统风湿失调影响的，和IVIGTM的热灭活血清。HIVIGTM是一种中和IgG的制品，来自HIV-1感染早期的9个血清反应阳性供体的混合血清；IVIGTM是来自正常供体的IgG，它们都从North AmericanBiologicals Inc.(Miami FL)获得。TCID50通过常规的病毒滴度方法确定。
血清或IgG孵育之后，将以三份重复血清/IgG-病毒混合物加入到靶细胞中。37℃过夜孵育后，板在1000rpm离心5分钟，完全更换培养基。该洗涤步骤重复3次以确保血清/IgG-病毒接种体的完全去除。培养的第4天换培养基，第7天收集悬浮液以定量p24核心抗原。将每个以血清/IgG处理的组织培养孔中的p24核心抗原的平均浓度，与特定的阴性对照相比较，从而确定抑制百分率。
平行地，准备一个对照，测定由于血清或HIVIGTM经过清洗步骤未完全去除而导致的p24核心抗原数量上任何非特异性的降低。当将血清/IgG-病毒混合物加入靶细胞时，不与病毒进行温育也将每种血清、IVIGTM或HIVIGTM加入到靶细胞中。这些孔平行地与实验培养物进行同样处理。培养7天后，每个孔的上清1∶1地与阴性对照的上清相混合，并对p24抗原浓度定量。如果测定值低于50％的阴性对照值，则被视为是由于残留的p24抗体存在而导致p24抗原的非特异抑制。
这个实验的结果如表3所示。表3中表明来自MCTD患者的抗RNP血清能够中和被HIV-1病毒株MN、JR-FL、和C0的感染。表3中的1号样品为CAEV(+)(即CAEV感染的)患者Hmc1。表3中的第6号样品为CAEV(+)患者Hmc4。对应表3中的第4号样品也确定为CAEV(+)。对应于第2,3,5和7号样品的患者没测出CAEV感染。因此，由于第1,4和6号样品对应于来自人的抗CAEV血清，故表明人抗CAEV血清可中和HIV-1感染。
表3抗RNP血清对HIV-1病毒株的中和抗体 病毒株MN JR-FLCOa．抗-RNP中和百分率1 99 77 862 71 71 -3 52 80 -4 72 55 375 9 79 -6 28 60 317 18 - -8 0 - -9 0 - -b．HIV-1(+)Pt.M99 30 -HIVIGtm93 94 54c．正常NL-1 11 - -NL-2 8 - -NL-3 1 - -IVIGcm19 20 -
实施例2来自人个体的PCR(+)血浆对人PBMC的体外感染本实施例表明h-CAEV感染人PBMC细胞的能力。提供了获救的CAEVgag序列的比较。
来自通过PCR测定的CAEV感染阴性(即PCR-)供体的80万个人PBMC培养物，用100μl来自患者Hmc4的血浆(其是CAEV感染阳性的(PCR+))接种，总体积为1ml。4天后，抽提基因组DNA、细胞RNA和培养上清的RNA并经CAEV gag引物的PCR和RT-PCR分析，对最终稀释至1ml的100μl起始血浆也进行了测试。PCR反应的琼脂糖凝胶电泳表现出在基因组DNA、RNA和培养上清中的CAEV gag信号，而患者Hmc4的接种血浆中CAEV的水平要低于可检测水平。这表明CAEV可繁殖性地感染人PBMC细胞。用来自记作Hmc1的人个体的PCR(+)血浆对人PBMC进行了类似的感染，也得到了类似的结果。
从上述实验的感染细胞培养物中获救CAEV病毒。来自Hmc4实验的获救序列与来自同一个体的基因组DNA和血浆RNA的序列相比较。从感染的PBMC克隆的CAEV gag序列与图3中来自患者Hmc4的浓缩血浆的序列相符合。图3比较了来自PCR和RT-PCR的下列Hmc4相关的CAEV gag克隆Hmc4基因组克隆g-30,g-39,g-40,g-46和g-50；Hmc4血浆克隆p254和p-256；来自感染实验的克隆i-238和i-239。“i”克隆来自感染培养物的细胞质。方框表示所有的"p"和"i"克隆与来自Hcm4的基因组克隆g-30间存在集合一定的相似处，这表明在该患者存在特定活性形式的一个亚集合。
在图3提供的数据中，很容易的显示出感染人的CAEV亚型区别于参照的感染山羊的CAEV M33677(本文中也记作“CAEV-CO”)。例如，在对应于由SEQ ID NOs:16和17所示引物扩增出的173个核苷酸的片段的相对较小基因组区域中，发现人-CAEV病毒具有至少两个突变是特定人源的。这些突变在Hmc4克隆的173gag区域的扩增产物上对应于第56位的鸟嘌呤和第77位的胞嘧啶。
图4表示PCR扩增的146个核苷酸的POL基因区域序列的比较，该序列对应于山羊病毒CAEV病毒株79-63的第3223-3358核苷酸。参照的病毒株CAEV-CO来自山羊脑。脑是一个免疫豁免位点。因此，该病毒的进化不同于分离自关节炎山羊的关节液的病毒。gWa19感染了来自关节液的病毒，CAEV 79-63病毒株。人形式的进化可能更相似于CAEV-63。图4比较了参照山羊CAEV-CO，分离自Hmc4的人-CAEV和山羊gWa19 CAEV-63病毒。图4中感染山羊的病毒的序列与感染人的CAEV病毒的序列的不同处很明显。因此，本文讨论涉及新的能够感染人的人-CAEV慢病毒。
图5表示对来自山羊的CAEV病毒株CAEV-CO和gWa19(即，CAEV-79-63)和来自人的h-CAEV病毒株Hmc1和Hmc4，在图3所示的相同的173个核苷酸区域的直接序列比较。来自人的CAEV(人-CAEV)和来自山羊的CAEV之间的差异百分比如表4所小节的。Hmc1和Hmc4为人-CAEV，而gWa19,CO和g147为山羊-CAEV。
表4差异百分比pol(173个核苷酸)最大百分率最小百分率克隆数Hmc4/gWa19 4.01.7 7/1Hmc1/gWa19 8.71.2 10/1Tn8(g147)/gWa19 1.71.7 1/1pol(146个核苷酸)Hmc4/gWa19 8.22.1 5/4gwa19/Co4.04.0 1/1(特定人gag突变包括第56和77位的核苷酸)
实施例3利用CAEV疫苗免疫接种个体本实施例描述对一个个体施用CAEV疫苗以刺激抗CAEV的免疫应答的方法。
通过接种PBMC细胞(见实施例2)或单核细胞制备人-CAEV，收集病毒细胞悬浮液，通过150000g，4℃离心沉淀CAEV病毒颗粒，从而获得含有50％甘油作为稀释剂的约2×108pfu/ml的无菌悬浮液(见Graham等，J.Infect.Dis.166:244-252(1992)，在此引入供参考)。活病毒受体进行真皮免疫接种，在一个皮肤位点上用无菌分叉针，接种50μlCAEV悬浮液。免疫接种也可以用灭活的或者减毒的CAEV制品或其他CAEV免疫原如CAEVgp135(见表1，同上)。在免疫点作无菌透明包扎在形成硬壳后再清除。
在施用CAEV免疫原后的第14、28和54天，抽取血样进行评估，测定抗体滴度(体液应答)或T辅助细胞或细胞毒T细胞免疫应答(细胞应答)。用于检测体液和细胞应答的方法如实施例1中所公开的或者如本领域所熟知的(见，例如，Egan等，J.Infect.Dis.171:1623-1627(1995)，在此提供作参考，还可见Harlow和Lane，同上，1988)。如果希望，第二次(加强)免疫可在头次免疫后的第56天给予。另外的体液和细胞应答可在头次免疫后的第70、90、160、180、270和355天进行评估。如果希望，第三次(加强)免疫可在头次免疫后的第365天进行。
对于施用的CAEV免疫原是半抗原肽时，约1mg的肽与匙孔嘁血蓝蛋白缀合并和佐剂一起以0.1ml的体积如上所述经真皮施用。如上进行体液和细胞应答的评估，如果愿意，可以施用第二次或第三次免疫。
虽然本发明参考如上所述实施例进行了描述，但是应知在不离开本发明精神下可作各种修正。所以，本发明被如下的权利要求限定。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人南加利福尼亚大学(ⅱ)发明名称山羊关节炎-脑炎病毒提供抗HIV-1感染的免疫保护(ⅲ)序列数目21(ⅳ)通信地址(A)地址Campbell & Flores LLP(B)街道4370 La Jolla Village Drive,Suite 700(C)城市San Diego(D)州California(E)国家美国(F)邮政编码92122(ⅴ)计算机阅读格式(A)介质类型软盘(B)计算机类型IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatenIN Release #1.0,Version #1.25(ⅵ)当前申请数据(A)申请号(B)申请日1997年3月14日(C)分类(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Campbell,Cathryn A.
(B)注册号31,815(C)案号/文档号FP-US 2495(ⅸ)电迅信息(A)电话(619)535-9001
(B)电传(619)535-8949(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Glu Arg Lys Arg Glu Gly Phe Thr Ala Gly1 5 10(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Ser His His Gly Asn Asp Ser Arg Arg Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Ser Arg Arg Arg Arg Arg Lys Ser1 5(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4Arg Lys Glu Thr Gly Thr Leu Gly Gly1 5(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度13个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5Arg Lys Lys Arg Glu Leu Ser His Lys Arg Lys Lys Arg1 5 10(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6Arg Met Gln Arg Lys Glu Arg His Lys1 5(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7Val Arg Ser Ser Tyr Gly Ile Thr Ser Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8Gly Arg Ile Lys Leu Gln Gly Ile Gly Gly1 5 10(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9Gln Glu Ile Leu Glu Asp Trp Ile Gln Gln1 5 10(2)SEQ ID NO:10的信息
(ⅰ)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10Lys Arg Ile Asn Asn Lys Tyr Asn Lys Asn Ser1 5 10(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11Asp Gly Leu Leu Glu Gln Glu Glu Lys Lys1 5 10(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特征(A)长度10个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12Ser Val Phe Pro Ile Val Val Gln Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13Ala Ile Asp Ala Glu Pro Thr Val1 5(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:14GCAGTTGGCA TATTATGCTA CTAC 24(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15CTTGTTGTAC TCTTTGTCCT AGTG 24(2)SEQ ID NO:16的信息(ⅰ)序列特征(A)长度23个碱基对
(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:16GAGCAGTAAG ACATATGGCG CAC23(2)SEQ ID NO:17的信息(ⅰ)序列特征(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:17TGATGVCATTT GTATAAGATA GTGTTAGCTT T31TGATGCATTT GTATAAGATA GTGTTAGCTT T(2)SEQ ID NO:18的信息(ⅰ)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:18GGATTTGAAC TACACCCGCA G 21(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)序列特征(A)长度25个碱基对(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:19CCTGTTGATA CTATGAACCC TAGAC 25(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:20AAGAACCTAA GCATCCCGCA AC 22(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:21GTGATGTTCC CTAATTGCAA TTCTAGTC28
权利要求
1．一种含有CAEV免疫原和一个药学可接受的载体的疫苗。
2．如权利要求1所述的疫苗，其中所说的CAEV免疫原为CAEV。
3．如权利要求1所述的疫苗，其中所说的CAEV免疫原为CAEVgp135。
4．如权利要求1所述的疫苗，其中所说的CAEV免疫原为选自SEQID NOS:1至13所示的一组序列的氨基酸序列。
5．如权利要求1所述的疫苗，还含有一个70K免疫原。
6．一种在个体中刺激抗CAEV的免疫应答的方法，包括对一个个体施用治疗有效量的CAEV免疫原，其中所说的治疗有效量的所说CAEV免疫原刺激抗CAEV的免疫应答。
7．如权利要求6所述的方法，其中所说的个体是人并且所说的抗CAEV的免疫应答对HIV-1交叉反应。
8．一种刺激抗CAEV的免疫应答的方法，包括以治疗有效量的CAEV免疫原接触淋巴细胞，其中所说的治疗有效量的所说的CAEV免疫原刺激抗CAEV的免疫应答。
9．如权利要求8所述的方法，其中所说的接触为体外操作。
10．如权利要求8所述的方法，其中所说淋巴细胞为T细胞。
11．如权利要求8所述的方法，其中所说淋巴细胞为B细胞。
12．一种对怀疑受CAEV感染的样品诊断CAEV感染的方法，包括下述步骤a．获得样品；b．将所说的样品在合适的条件下接触一个CAEV抗原；并且c．检测所说样品中存在的抗体与所说的CAEV抗原的特异结合，其中所说的特异结合的检测是对样品感染CAEV的诊断指征。
13．如权利要求12所述的方法，其中所说的样品获得自一个个体。
14．如权利要求13所述的方法，其中所说的个体为一人个体。
15．如权利要求13所述的方法，其中所说的获得自一个个体的样品为血清样品。
16．如权利要求12所述的方法，其中所说的CAEV抗原结合于一个固体支持物。
17．如权利要求12所述的方法，其中所说的检测步骤通过ELISA完成。
18．如权利要求17所述的方法，其中所说的ELISA为竞争ELISA。
19．如权利要求12所述的方法，其中所说的CAEV抗原是CAEVgp135。
20．一种用于诊断怀疑受CAEV感染的样品的试剂盒，包括一个结合CAEV抗原的固体支持物，一个结合所说的CAEV抗原的对照抗体和一个可检测基元。
21．一种对非山羊哺乳动物个体诊断CAEV感染的方法，所说的方法包括在所说的个体中检测对应于CAEV核酸的基因组或转录mRNA的序列。
22．一种对非山羊个体诊断CAEV感染的方法，所说的方法包括a)将得自一个怀疑受CAEV感染的个体的核酸与可扩增CAEV基因组核酸片段的引物在适合形成可检测的扩增产物的条件下相接触；并b)检测含有CAEV基因组核酸的扩增产物，由此所说的检测表明所说的个体已被CAEV感染。
23．分离的人-CAEV。
24．如权利要求23所述的人-CAEV，其中所说的人-CAEV的特征在于具有感染人外周血单细胞的能力。
全文摘要
本发明提供了一种含有山羊关节炎－脑炎病毒(CAEV)免疫原和一个药学可接受的载体的疫苗。本发明还提供了一种通过对一个个体施用治疗有效量的CAEV免疫原,从而在该个体中刺激抗免疫缺损病毒－1感染或CAEV感染的免疫应答的方法。本发明进而还提供了一种通过将淋巴细胞与治疗有效量的CAEV免疫原相接触而体外刺激免疫应答的方法。本发明也提供了诊断人的CAEV感染的方法。
文档编号C12P21/08GK1219881SQ97193871
公开日1999年6月16日 申请日期1997年3月14日 优先权日1996年3月15日
发明者安吉琳·多瓦斯, 格兰·厄里斯曼 申请人:南加利福尼亚大学