专利名称：对基因表达的改进或有关基因表达的改进的制作方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及一种优选在植物细胞中表达的核酸序列，并涉及含有该核酸序列的载体和植物细胞。本发明背景在酵母中，存在一个被称为GAL4的基因，该基因的产物起着转录激活物的作用(Johnston,1987,Microbiol.Rev.51,458-476)。GAL4基因相当大(3kb)，而所编码的多肽包括一个N-末端DNA结合域，一个具有转录激活物功能的C-末端域，以及一个间插葡糖效应因子“GRE”(在有葡萄糖时GAL4被抑制)。
对于GAL4蛋白的特征已了解的相当清楚。该蛋白的1-147号氨基酸残基以序列特异性方式与DNA结合(Keegan等1986 Science 231,699-704)。其转录激活功能与C末端功能域的两个短的部分相关(Ma&Ptashne 1987 Cell 48,847-853)。已证实GAL4所结合的DNA序列是一个17聚体，它必须重复形式存在，以优化GAL结合(Giniger等，1985 Cell 40,767-774)，并可以称作GAL4效应“上游激活序列”(UAS):GAL4通过所述DNA结合域与一个基因的UAS 5′端结合，并由其C-末端域引起该基因转录的上调。
最近，已开发出用于指导基因在果蝇(Drosopila melanogaster)中表达的双因子系统。Brand和Perrimon(1993 Development 118∶401-415)使用一个以P-因子为基础的载体将编码所述GAL4的基因随机插入果蝇属基因组中。
已制备出大量稳定的果蝇属品系，这些品系分别以特定方式表达GAL4，其表达方式取决于相邻基因组DNA的序列。然后将一个选择的基因克隆于GAL4上游激活序列(UAS)的控制之下，分别转化，并在缺少GAL4时保持沉默。所述单一品系与含有GAL4的品系的文库中任一个的遗传交配可以在很多不同类型的组织和细胞中激活所述靶基因的表达，并可以方便地研究包括使所述生物致死在内的错表达的表型后果。另外，含有GAL4的苍蝇文库还日益成为有特色的共享资源，并由它构成各种“反向”遗传学技术的共同进入点。
十分希望一种可用于植物中的类似系统。不过，以往已证实异源真核基因在植物中的表达是很成问题的(例如，参见Green FluorescentPntein)，而GAL4的有效表达似乎同样困难，而且，已证实这是因为GAL4 mRNA在植物中的低效率的翻译造成的(Reichel等，1995 PlantCell Reports 14,773-776)。Ma等(1988,Nature 334,631-633)能证实实现了改性的功能性GAL4衍生物在烟草叶子原生质体中的瞬时表达，但未能证实功能性全长野生型GAL4的存在。类似地，已在玉米原生质体中证实了GAL4的瞬时表达(McCarrty等，1991 Cell 66,895-905)，并在通过biolistic方法导入时在玉米糊粉组织或胚胎发生愈伤组织中证实了其表达(Goff等，1991 Genes & Dev.5,298-309；Goff等，1992,Genes & Dev.6,864-875)。不过，迄今为止尚未见到功能性GAL4或其衍生物在植物细胞中稳定有效表达的报道。
本发明的目的是用GAL4基因的改性部分提供一种可用于植物中的新的表达系统。本发明概述第一方面，本发明提供了一种可在植物细胞中表达的、至少编码一种GAL 4 DNA结合域的至少一个有效部分的核酸序列，该序列的A/T碱基含量相对其野生型酵母序列明显降低。
编码GAL4的DNA结合域的野生型酵母序列的A/T含量大约为59％。当本发明编码所述GAL 4 DNA-结合域的有效部分的序列的A/T百分含量不足50％时可被视为显著降低。优选的是其A/T含量不足45％，更优选的是不足40％。例如，本发明的序列可以通过定点诱变制备或通过化学方法从头合成。
所述DNA结合域的“有效部分”是一个足以保持其全长DNA结合域的大部分(即50％以上)DNA结合活性的部分。通常，所述“有效部分”至少包括该DNA结合域全长序列的2/3。通常，所述核酸序列可大致编码所述GAL 4 DNA结合域的全部(即其酵母多肽的1-147号氨基酸残基)，不过，其明显较小的部分(大约75个氨基酸残基)也足以保留其大部分DNA结合活性(Kraulis等，1992 Nature 356,448-450；和Marmostein等，1992 Nature 356,408-414)，在一种特定实施方案中，所述序列可包括
图1的5′部分(1-大约460号核苷酸)的核苷酸序列，相对其野生型酵母序列而言，其A/T含量(38％)明显较低，仍编码一种相同的氨基酸序列。
所述GAL 4 DNA结合域本身并无转录激活功能。因此，在优选实施方案中，编码所述GAL 4 DNA结合域的有效部分的序列可操作地连接于一个或几个其它核酸序列上，该序列可以是结构(即编码功能性多肽)和/或调节序列。通常，编码所述DNA结合域的序列可操作地连接于(即符合读框的融合于)一个编码一种具有调节功能的肽或多肽的序列上，所述肽优选为一种转录激活物。该转录激活物可以是GAL4蛋白的激活域，编码它的序列最好优选在植物中表达(例如，通过降低其A/T含量)。另外，所述转录激活物可以是多种已知在植物中有活性的蛋白中的任一种，这些蛋白为本领域技术人员所熟知，以使本发明的序列可编码一种嵌合多肽，该多肽至少包括所述GAL 4 DNA结合域的一个有效部分，和一个转录激活域。一种特别适用的转录激活物域可从单纯疱疹病毒(HSV)VP-16中获取(参见Greaves和O′Hare 1989 J.Virol.63,1641-1650；VP，又被称作VMW65)。其它转录激活域包括由大肠杆菌(E.Coli)基因组DNA片段编码的多肽(Ma & Ptashne1987 Cell 51,113-119)或被设计用于产生两亲性α-螺旋的合成肽(Giniger & Ptashne 1987 Natare 330,670-672)。一个共同的特征似乎是要求剩余的电荷，该剩余电荷或是正电荷(Gill & Ptashne 1987 Cell51,121-126)，或者特别是就植物激活域而言，要求剩余的负电荷(Estruch等，1994 Nucl.Acids Res.22,3983-3989)。在了解以上情况之后,本领域技术人员可以方便地合成或寻找到天然存在的编码在植物中具有转录激活活性的肽或多肽。所述激活序列在任何场合下均可修饰，以便在植物细胞中取得最佳活性。
另一方面，本发明提供了一种核酸构建体，该构建体含有上述核酸序列。在一种具体实施方案中，可将该核酸构建体用作“增强子陷阱”，以钓取植物增强子序列(参见Sundaresan等，1995 Genes & Dev.9,1797-1810)。在该实施方案中，所述构建体优选包括右和左Ti-DNA，以便可以随机、稳定地插入植物细胞宿主的基因组中。该构建体优选包括一个原始植物启动子序列，该序列是指这样一种启动子(可用于植物细胞)它需要有合适的增强子序列，以导致高水平的转录。这样一种“原始”启动子可被视为“增强子依赖型”启动子，并大致相当于已知植物启动子的TATA框片段。“植物”启动子包括在植物细胞中有活性的病毒和细菌启动子序列(例如，CaMV35S启动子的-48至+1号核苷酸)。所述原始启动子通常明显接近一个Ti边界，该启动子与编码GAL 4 DNA结合域的序列呈感受态关系，该结合域与一个可在植物中起作用的转录激活域融合，以使插入植物宿主细胞基因组中的启动子与一个增强子序列呈功能性关系，由该启动子指导GAL 4 DNA结合域及所述转录激活域的表达。为方便起见，该构建体还可以包括一个植物选择标记(例如，卡那霉素抗性)。
此外，所述构建体可以包括一个在植物中有活性的报导基因(如Green荧光蛋白或β-葡糖醛酸酶“GUS”)，该基因可操作地连接于GAL4-效应型上游激活序列(UAS)上，以使该报导基因随着GAL 4DNA结合域/转录激活物融合蛋白的合成而被表达。优选该报导基因是如在WO 96/27675中所披露的修饰GFP，或GUS(通常带有一个核定位信号)。优选该UAS包括所述17聚体的一个或几个重复，而且它与GAL4结合(Giniger等，1985 Cell 40,767-774)。
作为将GAL4结合域/转录激活物序列导入植物宿主细胞基因组的方法，所述构建体可以包括Ds(“解离”)因子，该因子随后在瞬时表达的Ac(激活物)酶的作用下在其基因组中转移(例如，Cocherel等，1996 Plant Mol Biol.30,539-551)。
再一方面，本发明提供了一种含有上述构建体的植物或其部分(例如，植物宿主细胞或细胞系)。通常，该构建体被整合到植物细胞基因组中，并且被稳定地保持在其中。具体地讲，本发明提供了含有一个文库的若干植物或其部分(如分离的植物细胞或细胞系或组织培养物)，每一个植物或其部分含有一个如上文所述的编码所述GAL 4 DNA结合域有效部分的稳定维持的核酸序列。通常，该核酸序列可插入存在于所述文库中的植物细胞基因组中。
因而由所述植物或其部分的文库构成一种十分有用的资源。例如，该文库可以是拟南芥(Arabidopsis thaliana)或是常用于研究的任何其它植物。该文库的每一个植物或其部分中整合的报道基因具有特殊的表达形式(例如，参见Sundaresan等，1995 Gene & Dev.9,1797-1810；Klimyuk等，1995 Molec.Gen.Genet.249,357-365)。因此，将具有GAL4效应型UAS的另一个基因导入所述细胞系，所导入的基因以与所述报导基因相同的时间/空间模式表达，使研究者可以在特定组织中和/或在特定时间以可预计的方式表达特定的基因。
因此，本发明提供了一种以已知的(可预计的)方式在植物或其部分中表达感兴趣的基因的方法，该方法包括将所述感兴趣的基因导入植物或其部分中，所述感兴趣的基因具有一个GAL4效应型上游激活序列(UAS)，其特征在于所述植物或其部分包括一个报道基因，该报导基因在一种转录激活物的影响下以已知方式表达，该转录激活物含有一个由上述本发明序列编码的GAL 4 DNA结合域的有效部分，以便该转录激活物与UAS的结合可导致所述感兴趣的基因的转录激活。
所导入的感兴趣的基因表达的时间/空间方式将反映出所述报导基因的已知的表达形式。通常，所述植物或植物部分可以是拟南芥，但也可以是常用于研究的任何其它植物(例如，玉米、水稻、马铃薯等)。
一般，是通过让GAL4-表达植物细胞系与含有和一个GAL4效应UAS连锁的感兴趣的基因的植物细胞系杂交将所述感兴趣的基因导入。
本发明的核酸序列除了用作“增强子陷阱”或指导感兴趣的基因以预定方式表达之外，还具有其它用途。所述修饰过的GAL 4 DNA结合域/转录激活物还可用于协调若干感兴趣基因的表达。在很多场合下，出于研究目的或农业/工业目的(例如，研究代谢途径或操作诸如植物染料或脂质的理想产物的合成)，希望在一种植物中同时表达若干基因。
因此，本发明提供了一种用于协调若干感兴趣的基因在植物或其部分中表达的方法，所述每一个感兴趣的基因在功能上与GAL4效应UAS相关，其特征在于所述植物或其部分含有如上文所定义的符合本发明第一方面的序列，并能够表达含有GAL 4 DNA结合域的有效部分的转录激活物，以便该转录激活物与UAS的结合可导致所有感兴趣基因的同时转录激活作用。
通常，所述若干感兴趣的基因都可以一种多顺反子排列形式与一个UAS相连，该UAS有利于将所述感兴趣的基因导入植物或其部分中(所述感兴趣的基因通常是在正常情况下不存在于植物或其部分中的基因，例如，哺乳动物或细菌基因，或来自不同植物的基因，或者可能是曾作为各种修饰的目标的天然植物基因)。另外，一个或几个基因能可操作地连接于各自UAS上。该转录激活物可以由一个已经存在于植物或其部分中的序列编码，或在导入所述若干感兴趣的基因的同时(或之后)导入。
下面将通过说明性实施例的形式并结合附图对本发明做进一步说明，在附图中图1表示编码一个修饰的GAL 4 DNA结合域的本发明的核苷酸序列，该序列以符合读框的形式与一个来自HSV VP16的一个编码一种修饰的转录激活域的序列融合，图中的竖线表示GAL 4 DNA结合域的末端；图2是含有本发明序列的核酸构建体的示意图；图3表示在图2中示意性地示出的部分核酸构建体的核苷酸序列；和图4a-4d表示含有本发明序列的植物根部分显微摄影。实施例本发明人采用了一种类似于Brand & Perrimon(1993，同上文)所披露的方法，但对该方法做过修改，以适用于拟南芥属，用由根瘤土壤杆菌介导的转化来产生“增强子陷阱”植物细胞系，该细胞系具有一种包括GAL 4 DNA结合域的转录激活物，其与HSV VP16的激活域融合(mGAL4-VP16)。例1-构建mGAL4-VP16基因合成了8种与GAL 4 DNA结合区修饰序列相应的寡核苷酸。GAL-5’(28-mer)GGC AAC AAT GAA GCT ACT GTC TTC TAT C(Seq.ID No.3)VP16-3’(31-mer)GGC AGA TCT ACC CAC CGT ACT CGT CAA TTC C(Seq.ID No.4)MGAL1(109-mer)GGC AAG CTT GGA TCC AAC AAT GAA GCT CCT GTC CTC CAT CGA GCAGGC CTG CGA CAT CTG CCG CCT CAA GAA GCT CAA GTG CTC CAA GGAGAA GCC GAA GTG CGC CAA G(Seq.ID No.5)MGAL2(108-mer)TCC TCT CGA GGG AAG ATC AGG AGG AAG AGC TGC TCC AGG CGC TCCAGG CGG GAC TCC ACT TCG GTG AGG TGG GCG CGG GTC AGC GGG GAGCGC TTG GTT TTG GGA GAG (Seq.ID No.6)MGAL3(81-mer)TTC CCT CGA GAG GAC CTC GAC ATG ATC CTG AAA ATG GAC TCC CTCCAG GAC ATC AAA GCC CTG CTC ACC GGC CTC TTC GTC (Seq.ID No.7)MGAL4(89-mer)GGG TGA GGG GCA TGT CGG TCT CCA CGG AGG CCA GGC GGT CGG TGACGG CGT CTT TGT TCA CGT TGT CCT GGA CGA AGA GGC CGG TGA GC(Seq.ID No.8)MGAL5(80-mer)GGA GAC CGA CAT GCC CCT CAC CCT GCG CCA GCA CCG CAT CAG CGCGAC CTC CTC CTC GGA GGA GAG CAG CAA CAA GGG CC(Seq.ID No.9)MGAL6(83-mer)AGT GGA GCT CGT CCC CCA GGC TGA CGT CGG TCG GGG GGG CCG TCGAGA CGG TCA ACT GGC GCT GGC CCT TGT TGC TGC TCT CC(Seq.ID No.10)通过在含有7M尿素和90mM Tris-硼酸1mM EDTA pH8.3(TBE)缓冲液的5％聚丙烯酰胺凝胶中电泳纯化全长寡核苷酸。通过用滤过的0.05％甲苯胺蓝染料进行简单的染色检测分离的寡核苷酸，切除，并在37℃下在0.5M乙酸铵、0.1％SDS和0.1mM EDTA中洗脱过夜。使洗脱的DNA沉淀并用乙醇洗涤，用T4多聚核苷酸激酶磷酸化。将DNA(各0.5μg)分别悬浮于50mM Tris-HCl pH9.0,10mMMgCl2,10mM DTT中，其中含有1mM ATP和5个单位的T4多聚核苷酸激酶，并在37℃下培养30分钟。
将质粒pCMVGal 65(Cousens等，1989 EMBO J.8,2337-2342)用作使用未修饰密码子的GAL 4 VP16序列的来源。从该质粒中分离两种内切核酸酶片段。通过在1％低熔点(LGT)琼脂糖凝胶上电泳分离和洗脱，纯化一个含有编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GAL 4蛋白的DNA结合因子的序列的SacⅠ-SacⅠ片段，和一个编码单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活域的SacⅠ-KpnⅠ片段。
用所述GAL-5′和MGAL2寡聚体作引物，用所述SacⅠ-SacⅠGAL4DNA片段作模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增mGAL4-VP16序列的5′部分。在标准条件下用VENT DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)温育引物和模板，并进行30轮反应94℃下30秒，50℃下1分钟，72℃下1分钟。用XhoⅠ限制内切核酸酶裂解所述产物，并在通过1.5％LGT琼脂糖凝胶电泳后纯化。
通过加热至65℃并缓慢冷却至室温将MGAL4和MGAL5寡核苷酸退火。然后加入MGAL3和MGAL6，并对该混合物进行退火。再在37℃下，在50mM Tris-HCl pH7.5,10mM MgCl2、10mM DTT、1mM dNTPs和1mM ATP中温育所述寡核苷酸和DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和T4 DNA连接酶。用限制性内切核酸酶XhoⅠ和SacⅠ裂解所述产物，并在通过1.5％LGT琼脂糖凝胶电泳后纯化。
将3种凝胶纯化的限制性片段(1)GAL-5′/MGAL 2 PCR扩增产物，相当于GAL 4 DNA结合域的5′部分，(2)MGAL3-6退火和扩增产物，相当于GAL 4 DNA结合域的3′部分，和(3)源于pCMVGal 65的SacⅠ-KpnⅠ片段，相当于VP16激活域混合，并在20℃下在50mM Tris-HCl pH7.5、10mM MgCl2、10MmM DTT和1mM ATP中用T4 DNA连接酶连接过夜。用MGAL 1和VP16-3′作引物对连接的产物进行PCR扩增(如上文所述)。用BamHⅠ裂解含有整个修饰过的GAL4-VP16序列的产物，并与用SacⅠ裂解过的PBI121(Jefferson等，EMBO J.6:3907,1987)连接，用T4 DNA聚合酶处理补平末端，用BamHⅠ再次裂解。该重组质粒(pBIN 35S-mGAL4-VP16)含有组成型35S植物启动子下游的mGAL 4-VP16基因。
如图1所示，下面的DNA序列是融合基因(序列1)的DNA序列，它编码GAL 4 DNA-结合域的5′部分，并编码源于HSV VP16的转录激活域的3′部分。为比较起见，在其上方示出了野生型序列。可以看出，野生型GAL 4 DNA结合域编码序列是富含A/T的(在每一行序列的右边示出了A/T的百分含量)，并且，据信这是导致其在植物中低效率表达的原因。具体地讲，据信富含A/T的DNA含有一个或几个这样的区段该片段转录之后在植物细胞中被作为mRNA剪接位点识别。改变了的核苷酸在图1中划线示出。其所编码的多肽序列在下面示出(序列2)。对核苷酸序列的修饰要认真选择，以确保在所编码的氨基酸序列上不会发生变化。序列上方面的数字表示在该位点上核苷酸或氨基酸的数目。还示出了某些限制性内切核酸酶的位点。
通过用限制性内切核酸酶HinDⅢ和EcoRⅠ消化切除35S启动子和mGAL 4-VP16基因，通过1％LGT琼脂糖凝胶电泳纯化，并亚克隆到含有一种GAL4-效应型mgfp5-ER标记基因的载体上(见下面的例2)。所得到的构建体如图2所示，其中，R和L表示右侧和左侧Ti质粒边界序列。将位于CaMV 35S基因的TATA框片段(第-48至+1号核苷酸)下游的GAL4-VP16融合基因插入接近右侧Ti边界处。该质粒还含有卡那霉素抗性(Kan R)选择标记，而一个报导基因(GUS或GFP)可操作地连接于一种合成GAL4-UAS启动子序列上。还示出了某些内切核酸酶位点。
图3表示通过Ti质粒右侧边界、CaMV 35S TATA框、和GAL 4 DNA结合域编码区的起点的核苷酸序列(序列15)。
在通过土壤杆菌介导的转化方法(Valvekens等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5536-5540,1988)转化的拟南芥属植物中直接测定mGAL4-VP16基因的活性。例2构建GAL-GFP增强子陷阱载体修饰T-DNA右侧边界。
用限制性内切核酸酶SacⅡ消化质粒pBIN 19(Bevan,M.Nuc.AcidsRes.12:8711-8721,1984)，并将一个含有土壤杆菌属T-DNA右侧边界序列的2.6kb的片段亚克隆到SacⅡ裂解过的pGEM 5Zf(Genbank入藏号X65308；由Promega出售)上。用辅助噬菌体对含有所述重组噬粒的细菌进行超感染，以得到单链噬粒DNA。
对一种合成的突变寡核苷酸(“TR+”:ATA TCC TGT CAA ACACTG GAT CCG AGC TCC AAT TCA TAG TTT AAA CTG AAG GCGGG；序列11)进行激酶处理，并与纯化的粘粒DNA退火，用T7 DNA聚合酶在模板上延伸，并用T4 DNA连接酶连接。将该DNA转入细菌中，筛选在紧邻T-DNA右侧边界插入了限制性内切核酸酶BamHⅠ、SmaⅠ和EcoRⅠ的新位点的重组质粒(pTr+)。
插入TATA框片段。
用互补于35S启动子的-48区(寡核苷酸Δ35S BgⅢ；GGC AGATCT TCG CAA GAC CCT TCC TCT ATA TAA GG；序列12)和下游β-葡糖醛酸酶基因(寡核苷酸GUSSnaBI；CAC ACA AAC GGT GATACG TA；序列13)的寡核苷酸通过PCR由pBI121扩增所述35S启动子的TATA框区。用限制性内切酶BgⅢ和BamHⅠ裂解所述PCR产物，并连接于BamHⅠ裂解过的pTr+上。所得到的重组质粒(pTr+Δ35S)含有一个位于接近所述T-DNA右侧边界的最小(原始)启动子。
插入驱动mGAL4-VP16基因的35S启动子。
在未成功的实验中，将使用未修改过的密码子的GAL4衍生物插入了pTr+Δ35S质粒中，而且，上述构建体之一(插入源于pMA236的截短的GAL4基因；Ma等，1988 Nature 334,631-633)已造成一个HindⅢ位点插入紧邻pTR+Δ35S中的BamHⅠ位点处。用限制性内切核酸酶HindⅢ和EcoRⅠ消化质粒pTr+ΔGAL4，并与源于pBIN 35S-mGAL4-VP16的HinDⅢ-EcoRⅠ片段连接，以导入35S-驱动的mGAL4-VP16基因。然后将源于该质粒(pTr+35S-mGAL4-VP16)的土壤杆菌序列再克隆到一种二元植物转化载体中，该载体含有一个用于在植株中测验的GAL4-效应型标记基因(见下文)。
构建一种合成的GAL4-效应型启动子。
从质粒pUAST(Brand & Perrimon,1993 Development,118,401-415)上切除一个含有5个GAL4的优化结合位点的HinDⅢ-XbaⅠ限制内切核酸酶片段，并将其连接到HinDⅢ-XbaⅠ裂解的pBI 101(Jefeersen等，1987 EMBO J.6,3901-3907)上，位于GUS基因上游(以形成pBINΔUAS-GUS)。用寡核苷酸DELAS1(GAA CTC TAGAAG CTA CTC CAC GTC CAT AAG GGA CAC ATC ACA ATC CCA CTATCC TTC GC；序列14)和GUSSnaBI(同上)通过PCR扩增相当于35S启动子的-90区。用XbaⅠ-BamHⅠ裂解所得到的产物，并克隆至作过类似裂解的pBIN ΔUAS-GUS。所得到的质粒(pBIN UAS(-90-AS1)GUS)含有一个合成的β-葡糖醛酸酶(GUS)编码序列的GAL4启动子上游。然后用绿色荧光蛋白(GFP)取代所述GUS基因。
GAL4-效应mgfp5-ER基因。
我们已对绿色荧光蛋白基因作过各种诱变，以优化其在植物中的表达。所优化的基因被称为mgfp5-ER(Siemering等，Current Biology6:1653-1663,1996；WO 96/27675)。
已将mgfp5-ER基因克隆到植物转化载体pBI 121中，而且，我们已切除一个BamHⅠ-SacⅠ片段，该片段含有所述编码序列，并且已被插入BamHⅠ-SacⅠ裂解过的pBINUAS(-90-AS1)GUS上，以取代GUS基因。用SacⅡ裂解该质粒(pBIN UAS(-90-AS1)mgf5-ER)，并与含有修饰的T-DNA右侧边界和源于pTr+35S-mGAL4-VP16的mGAL4-VP16基因的SacⅡ片段连接，以得到pBIN 35S-GAL4-VP16+UAS-mgfp5-ER(缩写为pBIN 35S-GAL-GFP)。
检验pBIN 35S-GAL-GFP载体。
通过电穿孔法将pBIN 35S-GAL-GFP质粒导入根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4044(Jefferson等，EMBOJ.6:3901-3907,1987)，然后在含有卡那霉素的平板上选择。用下面所述的方法将上述土壤杆菌属菌株转化拟南芥属。在转化之后对植物的GAL-4依赖型GFP荧光诱导进行计分。
构建GAL-GFP增强子陷阱载体用BamHⅠ处理pTR+35S-mGAL-VP16质粒(以切除所述35S启动子序列)，并用T4 DNA连接酶进行重新连接。该质粒(pTR+mGAL4-VP16)含有修饰过的GAL4-VP16，有一个最小启动子位于T-DNA右侧边缘。然后通过用SacⅡ消化切除所述T-DNA序列，并与用同一种酶裂解的pBIN UAS(-90-AS1)mgfp5-ER连接。由此产生的pBIN GAL-GFP含有活性很高的mGAL-4-VP16转录激活物，该激活物响应于相邻的增强子因子，并包括一个GAL4-依赖型GFP基因。GFP荧光是因为GAL4-VP16的激活而产生的。
增强子陷阱筛选。
将增强子陷阱载体pBIN GAL-GFP导入根瘤土壤杆菌(详见下文)LBA4044中，并将其用于制备7,500个以上的转化拟南芥属幼苗。直接筛选转基因幼苗的GAL4-介导的GFP表达，并从表达植株上采集种子。我们拥有一个超过250个拟南芥属品系的文库，这些品系在其根部表现出由GAL4介导的GFP表达的稳定遗传的形式。
反式激活。
为了证实由GAL4介导的外源基因的反式激活作用，我们制备了含有源于pBIN UAS(-90-AS1)GUS)的T-DNA序列的转基因拟南芥。缺乏GAL4-VP16时，这些植物不表达GUS基因。不过，在与表达mGAL′4-VP16基因的品系进行遗传杂交时，该GUS基因以表达的方式被激活，这准确地反映出该mGAL4-VP16基因源于所述供体亲本(见下面的例3)。例3构成上述文库一部分的一个稳定转化的拟南芥系(J2302)，可在其根尖末端的细胞中表达修饰的GFP(受mGAL4-VP16激活物的影响)(参见图4a和4b)。
图4a是表示在根尖部位由GFP-介导的落射荧光(400nm激励光)的低倍显微照片。图4b是更详细地显示GFP-介导的落射荧光的较大放大倍数的共焦显微照片(488nm激励光)。
让所述拟南芥系J2302与另一个拟南芥系杂交，该另一个系包括一个稳定的沉默维持的GUS报道基因；该基因可操作地连接于GAL4-效应UAS上。正如所预料的，所述杂交的产物可在GAL4-VP16转录激活物的影响下表达GUS，与GFP报导基因在J2302中的表达方式相似(即在根尖末端表达)。在图4c和4d中示出了经适当染色的样品，通过明视野显微术成像，并验证在根尖部位的GUS报导基因活性(染色最深的部分)。
这表明修饰的GAL 4 DNA结合域序列可以(ⅰ)成功地用于构建增强子陷阱载体；(ⅱ)以可预计的方式表达感兴趣的基因(例如GUS)；和(ⅲ)协调若干感兴趣基因的同时表达(例如GFP和GUS基因)。例4转化拟南芥所使用的方法基于由Valvekens等(1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85,5536-5540)最初所披露的方法。培养基除非另加说明，一切过程均是用无菌溶液和设备在无菌条件下完成。所有培养基均用于标准的塑料一次性培养皿中，或是在后期用于Magenta CA7瓶(Magenta Corp.USA)中。以1000倍母液形式将激素溶于二甲基亚砜(DMSO)中。在加入激素和抗生素后对所述培养基进行高压灭菌并冷却至65℃。
1．萌芽培养基(GM)含有1×Murashige和Skoog盐混合物；1％蔗糖；100mg/l肌醇；1.0mg/l硫胺素；0.5mg/l吡哆醇；0.5mg/l烟酸；0.5g/l 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)；(用1M KOH调至pH5.7)；和0.8％Difco Bacto琼脂(用于固体GM培养基)。
1a. GM K50用GM，但补充了50mg/l卡那霉素(Sigma)2．愈伤组织诱导培养基(CIM)含有1×Gamborg′s B5培养基；2％葡萄糖；0.5g/l MES(pH5.7，用1N KOH调节)；0.5mg/l 2,4-D(Sigma)；0.05mg/l细胞分裂素(Sigma)；和0.8％琼脂(用于固体CIM培养基)。
3．含有万古霉素的芽诱导培养基(SIM V750 K50)，它含有Gamborg′s B5培养基；2％葡萄糖；0.5g/l MES(pH5.7)；0.8％琼脂；5mg/l N6-(2-异戊烯)腺嘌呤(2ip)；0.15mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)；750mg/l万古霉素；和50mg/l卡那霉素。
3a. SIM V500 K50同SIM，但补充了500mg/l万古霉素；和50mg/l卡那霉素。
4．根诱导培养基(RIM)，含有Gamborg′s B5培养基；2％葡萄糖；0.5g/l MES(pH5.7)；0.8％琼脂；12.5mg/l吲哚丁酸(IBA)；和50mg/l头孢噻肟。植物生长(ⅰ)将种子放入一个15ml的聚丙烯离心管中。
(ⅱ)加入乙醇保持2分钟。用移液管除去乙醇。
(ⅲ)用5％的市售漂白粉(约含0.25％可利用氯)取代乙醇，其中，每50ml含有1滴NP40。放置15分钟，有规律地摇动。
(ⅳ)在无菌蒸馏水中至少洗涤种子3次。
(ⅴ)在经过最后一次洗涤之后，将无菌的种子放入装在锥形烧瓶中的100ml GM中。在20-25℃的培养室中摇动培养2-4周。由土壤杆菌介导的转化。
1．第1天(ⅰ)用解剖刀片切除小植株的所有绿色部分(上部)，仅留下根系。
(ⅱ)将所述根系分布在装有固体CIM的平板上。轻轻下压每一束根，以保证其与所述琼脂表面的接触。
(ⅲ)在生长室中培养3天(22℃，连续光照)。
2．第4天(ⅰ)在保证无可见的污染迹象之后，将诱导出愈伤组织的根系收集到一个空的培养皿中。
(ⅱ)将上述根系切成0.5cm长的外植体。
(ⅲ)将3-5ml在28℃下生长过夜的土壤杆菌属培养物加入Luria肉汤中，并离心洗涤。用平头镊子搅拌。让其共培养2分钟。
(ⅳ)用放在培养皿中的双层厚无菌滤纸(Whatman No.1)将所述根吸干。
(ⅴ)将所述外植体放在装在培养皿中的固化CIM培养基上，并将其轻压至培养基的表面上，以确保其接触培养基。
(ⅵ)在生长室中培养所述平皿2天时间，以完成土壤杆菌属的共培养。
3．第6天(ⅰ)将所述外植体转移至装在一个培养皿中的20-25ml水中。
用平头镊子搅动，以洗去所述土壤杆菌。洗涤培养基会略微变浊。将所述根段转移到筛网上，并重复以上洗涤步骤。然后将所述筛网从缓冲液中抬起并沥干。将所述外植体下压至网眼上，以便除去尽可能多的缓冲液和土壤杆菌。将所述半干燥的外植体挤压在一起形成团块。
(在用土壤杆菌属感染和洗涤根系外植体期间将定做的、可高压灭菌和再利用的筛网用于固定所述外植体。所述筛网是由100ml的塑料三角烧瓶和100μm的尼龙网制成。将该烧瓶的顶部3-4cm切除，将所述尼龙网固定在该切除部分的底部，其做法是将从该烧瓶底部上方切下的一个2cm高的环压入所述上部的下部。通过将热金属棒在几处位置上插入二者之间将以上两部分密封在一起。)(ⅱ)用放在培养皿中的双层厚无菌滤纸吸干小的根系材料束，并将其转移到固化的SIM V750 K50培养基上，留意根系外植体与所述培养基保持密切接触。
(ⅲ)在生长室中培养。再生(ⅰ)在生长室中，在生长3周以后的黄色根部外植体上出现极小的绿色抗卡那霉素愈伤组织。
(ⅱ)每隔2周将外植体转移到新鲜的SIM V750 K50上。在随后的几周中，会断断续续地在所述绿色愈伤组织上出现芽(起初通常为透明的)。
(ⅲ)将所述芽转移到RIM中，在这里将用2-3周时间长出根。
(ⅳ)在形成根以后，将这样的小植株转移至通风的Magenta GA 7盆中或直接移栽到土壤中。确保湿度保持较低，以保证结实良好。
(ⅴ)在种子变成黄褐色并因而成熟之后，收获种子荚。F1代的萌发和筛选。
为了检验转化，在GM K50上萌发F1幼苗。
(ⅰ)将种子放在GM K50上(如果必要，对种子进行表面消毒)。
(ⅱ)将培养皿在4℃下(冰箱中)于黑暗中放置3-5天，以打破种子的休眠。如果种子已存放1月以上，则不必这么做。
(ⅲ)在生长室中将培养皿培养2周。敏感的幼苗不能形成根或叶，并具有白色子叶。转化的幼苗在表型上是正常的。
(ⅳ)用一台装有一种滤光装置(Leitx-D excitation BP355-425,dichroic 455,emission LP 460)的倒置荧光显微镜(Leitz DM-IL)筛选转基因愈伤组织和芽中GFP的表达，所述滤光装置适用于GFP的395nm的主激励光和509nm的发射峰。使用一个具有4×物镜的7mm螺纹加长管(EF4/0.12)可以产生更大的工作距离，并能够方便地直接观察倒置的密封培养皿中的组织。还用一个100瓦特的长波长手持式UV灯(UV Products,B100AP)对转基因芽和植株进行日常监测。让转基因的拟南芥属F1幼苗在无菌琼脂培养物中生长5天，并在水中将其装在玻璃盖片下面，以便作显微观察。用一台装有氪-氩激光和滤光装置的BioRad MRC-600激光扫描共焦显微镜检查样品，所述装置适于检测荧光素和德克萨斯红染料(BioRad K1/K2)，所述显微镜还包括一个Nikon60×PlanApo N.A.1.2水浸物镜。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)名称Medical Research Council(B)街道20 Park Crescent(C)城市London(E)国家United Kingdom(F)邮编WIN 4AL(G)电话(0171)636 5422(H)电传(0171)323 1331(ⅱ)发明名称对基因表达的改进或有关基因表达的改进(ⅲ)序列数15(ⅳ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0.Version#1.30(EPO)(2)序列1资料(ⅰ)序列特征(A)长度701bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅸ)特征(A)名称/键词CDS(B)位置17..694(ⅹⅰ)序列描述序列1AAGCTTGGAT CCAACA ATG AAG CTC CTG TCC TCC ATC GAG CAG GCC TGC 49Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys1 5 10GAC ATC TGC CGC CTC AAG AAG CTC AAG TGC TCC AAG GAG AAG CCG AAG97Asp Ile Cys Arg Leu Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys15 20 25TGC GCC AAG TGT CTG AAG AAC AAC TGG GAG TGT CGC TAC TCT CCC AAA 145Cys Ale Lys Cys Leu Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys30 35 40ACC AAG CGC TCC CCG CTG ACC CGC GCC CAC CTC ACC GAA GTG GAG TCC 193Thr Lys Arg Ser Pro Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Vel Glu Ser45 50 55CGC CTG GAG CGC CTG GAG CAG CTC TTC CTC CTG ATC TTC CCT CGA GAG 241Arg Leu Glu Arg Leu Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu60 65 70 75GAC CTC GAC ATG ATC CTG AAA ATG GAC TCC CTC CAG GAC ATC AAA GCC 289Asp Leu Asp Met Ile Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala80 85 90CTG CTC ACC GGC CTC TTC GTC CAG GAC AAC GTG AAC AAA GAC GCC GTC 337Leu Leu Thr Gly Leu Phe Vel Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val95 100 105ACC GAC CGC CTG GCC TCC GTG GAG ACC GAC ATG CCC CTC ACC CTG CGC 385Thr Asp Arg Leu Ala Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg110 115 120CAG CAC CGC ATC AGC GCG ACC TCC TCC TCG GAG GAG AGC AGC AAC AAG 433Gln His Arg Ile Ser Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys125 130 135GGC CAG CGC CAG TTG ACC GTC TCG ACG GCC CCC CCG ACC GAC GTC AGC 481Gly Gln Arg Gln Leu Thr Val 5er Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser140 145 150 155CTG GGG GAC GAG CTC CAC TTA GAC GGC GAG GAG GTG GCG ATG GCG CAT 529Leu Gly Asp Glu Leu His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His160 165 170GCC GAC GCG CTA GAC GAT TTC GAT CTG GAC ATG TTG GGG GAC GGG GAT 577Ala Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp175 180 185TCC CCG GGG CCG GGA TTT ACC CCC CAC GAC TCC GCC CCC TAC GGC GCT 625Ser Pro Gly Pro Gly Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala190 195 200CTG GAT ATG GCC GAC TTC GAG TTT GAG CAG ATG TTT ACC GAT GCC CTT 673Leu Asp Met Ala Asp Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu205 210 215GGA ATT GAC GAG TAC GGT GGG TAGATCT 701Gly Ile Asp Glu Tyr Gly Gly220 225(2)序列2资料(ⅰ)序列特征(A)长度226个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白(ⅹⅰ)序列描述序列2Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu1 5 10 15Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu20 25 30Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro35 40 45Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu50 55 60Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile65 70 75 80Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu85 90 95Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala100 105 110Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser115 120 125Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu130 135 140Thr Val Ser Thr Ala Pro Pro Thr Asp Val Ser Leu Gly Asp Glu Leu145 150 155 160His Leu Asp Gly Glu Asp Val Ala Met Ala His Ala Asp Ala Leu Asp165 170 175Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Asp Gly Asp Ser Pro Gly Pro Gly180 185 190Phe Thr Pro His Asp Ser Ala Pro Tyr Gly Ala Leu Asp Met Ala Asp195 200 205Phe Glu Phe Glu Gln Met Phe Thr Asp Ala Leu Gly Ile Asp Glu Tyr210 215 220Gly Gly225(2)序列3资料(ⅰ)序列特征(A)长度28bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列3GGCAACAATG AAGCTACTGT CTTCTATC 28(2)序列4资料(ⅰ)序列特征(A)长度31bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列4GGCAGATCTA CCCACCGTAC TCGTCAATTC C 31(2)序列5资料(ⅰ)序列特征(A)长度109bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列5GGCAAGCTTG GATCCAACAA TGAAGCTCCT GTCCTCCATC GAGCAGGCCT GCGACATCTG 60CCGCCTCAAG AAGCTCAAGT GCTCCAAGGA GAAGCCGAAG TGCGCCAAG 109(2)序列6资料(ⅰ)序列特征(A)长度108bp
(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列6TCCTCTCGAG GGAAGATCAG GAGGAAGAGC TGCTCCAGGC GCTCCAGGCG GGACTCCACT 60TCGGTGAGGT GGGCGCGGGT CAGCGGGGAG CGCTTGGTTT TTGGGAGAG 108(2)序列7资料(ⅰ)序列特征(A)长度81bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列7TTCCCTCGAG AGGACCTCGA CATGATCCTG AAAATGGACT CCCTCCAGGA CATCAAAGCC 60CTGCTCACCG GCCTCTTCGT C 81(2)序列8资料(ⅰ)序列特征(A)长度89bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列8GGGTGAGGGG CATGTCGGTC TCCACGGAGG CCAGGCGGTC GGTGACGGCG TCTTTGTTCA60CGTTGTCCTG GACGAAGAGG CCGGTGAGC 89(2)序列9资料(ⅰ)序列特征(A)长度80bp(B)类型核酸
(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列9GGAGACCGAC ATGCCCCTCA CCCTGCGCCA GCACCGCATC AGCGCGACCT CCTCCTCGGA 60GGAGAGCAGC AACAAGGGCC 80(2)序列10资料(ⅰ)序列特征(A)长度83bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列10AGTGGAGCTC GTCCCCCAGG CTGACGTCGG TCGGGGGGGC CGTCGAGACG GTCAACTGGGC 60GCTGGCCCTT GTTGCTGCTC TCC 83(2)序列11资料(ⅰ)序列特征(A)长度56bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列11ATATCCTGTC AAACACTGGA TCCGAGCTCC AATTCATAGT TTAAACTGAA GGCGGG 56(2)序列12资料(ⅰ)序列特征(A)长度35bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性
(ⅹⅰ)序列描述序列12GGCAGATCTT CGCAAGACCC TTCCTCTATA TAAGG 35(2)序列13资料(ⅰ)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列13CACACAAACG GTGATACGTA 20(2)序列14资料(ⅰ)序列特征(A)长度59bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列14GAACTCTAGA AGCTACTCCA CGTCCATAAG GGACACATCA CAATCCCACT ATCCTTCGC 59(2)序列15资料(ⅰ)序列特征(A)长度91bp(B)类型核酸(C)链型单(D)拓扑结构线性(ⅹⅰ)序列描述序列15TAGGTTTACC CGCCAATATA TCCTGTCAAA CACTGGATCT TCGCAAGACC CTTCCTCTAT 60ATAAGGAAGT TCATTTCATT TGGAGAGGAC A9权利要求
1．一种可在植物细胞中表达的、至少编码一种GAL 4 DNA-结合域的一个有效部分的核酸序列，与其野生型酵母序列相比，该序列的A/T碱基百分含量显著降低。
2．如权利要求1的序列，还包括一个可操作地与编码所述GAL 4DNA结合域的有效部分的序列连接的结构和/或调控序列。
3．如权利要求1或2的序列，其中，所述核酸编码一种具有转录激活活性的肽或多肽，该序列可操作地与编码所述GAL 4 DNA结合域的有效部分的序列连接。
4．如权利要求1、2或3的序列，其中，所述序列编码一种在植物细胞中具有转录激活活性的肽或多肽，其为GAL 4、VP16、GCN4的修饰部分或是一种非天然存在的设计序列。
5．一种核酸构建体，含有一个如权利要求1-4中任一项所述的序列。
6．如权利要求5的构建体，可以把如权利要求1-4中任一项所述的序列插入一种植物宿主细胞的基因组中。
7．如权利要求5或6的构建体，还包括一个可操作地与一个GAL 4-效应上游激活序列(UAS)连接的报导基因。
8．如权利要求5、6或7中任一项的构建体，包括一个适于在植物细胞中表达的编码GUS或绿色荧光蛋白(GFP)的序列。
9．如权利要求5-8中任一项的构建体，含有T-DNA边界或Ds因子。
10．如权利要求5-9中任一项的构建体，其中，权利要求1-4中所述的序列的表达是受一个增强子依赖型植物启动子的控制。
11．如权利要求5-10中任一项的构建体，还包括一个选择标记基因。
12．一种植物或其部分，含有一种如权利要求1-4中任一项所述的核酸序列或是用权利要求5-11中任一项所述的构建体转化过。
13．如权利要求12的植物或其部分，其中，所述序列被稳定保持于植物基因组中。
14．一种包括若干植物或其部分的文库，每个植物或部分包括一个稳定整合的如权利要求3或4所述的核酸序列，该序列可导致一个报导基因以已知的时间和/或空间模式表达。
15．如权利要求14的文库，该文库是通过将权利要求6-11中任一项所述的核酸构建体导入若干植物或其部分中制成的。
16．如权利要求14或15的文库，包括若干拟南芥(Arabidopsisthaliana)植株。
17．一种以已知方式在植物或其部分中表达一个感兴趣的基因的方法，该方法包括将所述感兴趣的基因导入所述植株或其部分中，所述感兴趣的基因具有一个GAL4-效应上游激活序列(UAS)，其特征在于所述植物或其部分包括一个以已知方式表达的报导基因，该基因的表达受一种转录激活物的影响，该激活物含有一种GAL 4 DNA结合域的有效部分，该部分由权利要求1-4中任一项的序列编码，以便所述转录激活物与UAS的结合可导致所述感兴趣的基因的转录激活。
18．如权利要求17的方法，其中，所述感兴趣的基因被导入来自如权利要求14、15或16中任一项所述文库的一个或几个植株或其部分。
19．一种协调若干感兴趣的基因在植物或其部分中表达的方法，每一个感兴趣的基因在功能上与GAL4-效应USA相关，其特征在于所述植物或其部分含有一个如权利要求1-4中任一项所述的序列，并能够表达一种转录激活物，该激活物含有一个GAL 4 DNA结合域的有效部分，以使该转录激活物与UAS的结合可导致所有感兴趣基因的同时转录激活。
20．如权利要求19的方法，其中，所述感兴趣的基因中的至少某一些是呈多顺反子排列，并与一个GAL4-效应UAS相关。
21．如权利要求19的方法，其中，感兴趣的基因在功能上与相应的GAL4效应UASs相关。
全文摘要
披露了一种可在植物细胞中表达、至少编码一种GAL4 DNA－结合域的一个有效部分的核酸序列,该序列的A/T碱基百分含量相对其野生型酵母序列显著降低。
文档编号C12N15/09GK1216067SQ9719368
公开日1999年5月5日 申请日期1997年2月14日 优先权日1996年2月14日
发明者J·P·哈瑟罗夫, S·霍德格 申请人:英国技术集团有限公司