专利名称：用于多基因表达的载体的制作方法
用于多基因表达的载体
本发明涉及改造用于独立表达多个目的核苷酸序列的重组载体，其中所述目的核苷酸序列获得自同一种生物体或从密切相关的生物体。本发明涉及在多种原核及真核体外系统或在动物或人类对象中表达彼此显示同源性的多个核苷酸序列用于治疗或预防性目的重组核酸技术领域。本发明特别用于免疫治疗领域，尤其用于治疗或预防因感染性生物如乳头状瘤病毒和肝炎病毒所致的病理状况。
重组DNA技术己经使得在培养的宿主细胞或在活生物中表达核苷酸序列成为可能。已经产生几种质粒DNA和病毒载体并用于多种目的，包括免疫接种、基因治疗、免疫治疗和在培养的细胞中表达。载体如腺病毒的和痘病毒载体具有容纳巨大克隆容量的优点，具有在类型广泛的宿主细胞中表达多个核苷酸序列的潜能。表达多个核苷酸序列可以有利于改善由所编码的多肽提供的治疗效力(例如联合体液免疫及细胞免疫)。有利的是产生单个重组载体，而非产生分别改造以表达每种想要的核苷酸序列的多个重组载体，至少对于生产步骤和行政批准而言是有利的。
例如，就乳头状瘤病毒感染而言，有意义的将是表达来自几种乳头状瘤病毒基因型的免疫原性多肽，旨在拓宽或增强宿主的免疫应答，尤其在面临多重感染(例如HPV-16和HPV-18)风险的对象中。然而，编码此类免疫原性多肽的核苷酸序列在相关HPV基因型之间是高度同源的。例如，在核苷酸水平显示63%的整体同源性的HPV-16 E6和HPV-18 E6序列反而包含具有超过75 %极高同源性的可以危及从单个载体表达HPV-16和HPV-18基因的特殊区域。
另外，当表达病毒源多肽时，同源核苷酸序列也可以因病毒基因组的整体组织作用而产生。病毒通过生物学机制(如内部翻译起始或移码)使用相同核苷酸序列来编码两种不同蛋白质是相当频繁的，例如相同DNA的序列在多于一个可读框中翻译。例如，在HPV-16基因组中，毗邻的E1和E2基因具有59个核苷酸的重叠区，其在不同的可读框中被翻译。换句话说，El基因的最后59个核苷酸与E2基因的头59个核苷酸重叠。然而，预期载体中同源序列的存在不利地影响载体的稳定性，尤其在载体生产步骤期间，这导致基因序列丢失，原因在于同源序列之间出现的
重组事件。因此，在单个载体中表达HPV-16E1和E2基因涉及59个核苷酸共同部分的存在，其中所述共同部分可能潜在地造成同源重组事件并且最终造成El与E2同源序列之间所包含的序列丢失。这类不希望的同源重组事件也可以在相同载体中表达HPV-16和HPV-18基因序列时发生。这种不稳定性问题可以导致载体原液不可用，尤其对于人类临床试验而言。
在这个方面，W092/16636提出将同源核苷酸序列以彼此相反的方向插入重组载体中，从而降低重组事件的可能性。然而，该策略是就痘苗病毒载体进行描述的，没有对其他重组载体(如腺病毒)进行描述。另外，以相反方向排列并非总是可能的，原因在于可能的启动子干扰和构建限制。
本领域需要产生能够在宿主细胞或对象中表达从同一种生物体或从密切相关的生物体所获得的核苷酸序列的重组载体，其中所述生物在天然环境下含有高度同源的部分。本发明通过提供一种新策略满足这种需求，所述策略被设计为旨在以如下方式使重组事件的可能性最小化，即利用遗传密码的简并性改变同源核苷酸序列两者之一或两者以使得它们的同源性比修饰前更少，同时不改变或不显著改变所编码的氨基酸序列。本发明允许避开同源重组的有害作用，其中所述有害作用可以在同源序列之间出现，尤其在载体生产步骤期间，并且导致同源序列之间所含有的核苷酸序列丢失。已经发现本发明的载体在表达天然环境下共同拥有59个核苷酸的100%同源部分的El和E2乳头状瘤病毒基因方面出人意料地有效并且在载体生产步骤期间出人意料地稳定。还发现本发明的载体在表达从密切相关的HPV-16和HPV-18基因型中获得的E6和E7基因方面出人意料地有效。
这个技术问题通过提供如权利要求书中定义的实施方案加以解决。本发明的其他和另外方面、特征和优点将因以下对本发明当前优选实施方案的描述而显而易见。这些实施方案出于公开目的给出。
因此，在第一方面，本发明提供载体，其至少包含编码第一多肽的第一核酸分子和编码第二多肽的第二核酸分子，其中
-所述第一和第二核酸分子分别获得自第一和第二天然核酸序列，其中所述第一和第二天然核酸序列在一40个或更多个连续核苷酸的部分显示大约80%或大于80%的同源性百分比，禾口
-在该载体中包含的所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75%。
如整个申请书范围内通篇所用，术语"一("a"和"an")"以如此含义使用，从而它们意指所指向的化合物或步骤的"至少一个"、"至少第一个"、"一个或多个"或"多个"，除非上下文另外申明。例如，术语"一细胞"包括多个细胞，包括其混合物。
如论在本文中何处使用，术语"和/或"包括"和"、"或"和"与该术语相联的要素的全部或任何其他组合"的意思。例如，"第一核酸分子和/或第二核酸分子"意指第一核酸分子或第二核酸分子或第一以及第二核酸分子。
如本文中所用的术语"约"或"大约"意指在给定值或区间的5%范围内，优选在4%范围内并且更优选在2%范围内。如本文中所用，当用来定义产物、组合物和方法时，术语"包括"意图指该产品、组合物和方法包括所指的组分或步骤，但不排除其他组分或步骤。"基本上由......组成"应当指排
除任何具有重要意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所提及组分组成的组合物将不排除痕量杂质和可药用载体。"由......组成"应当指将其他组
分或步骤的更多痕量要素排除。例如，当多肽不含有除所提及氨基酸序列之外的任何氨基酸时，则该多肽"由一个氨基酸序列组成"。当多肽"基本上由一个氨基酸序列组成"时，这种氨基酸序列仅连同几个额外氨基酸残基，一般连同约1个至约50个或左右的额外残基一起存在。多肽"包含"一个氨基酸序列，当该氨基酸序列至少是此多肽的最终氨基酸序列的部分时。此种多肽可以具有几个直至几千个额外的氨基酸残基。此类额外的氨基酸残基可以在多肽转运方面发挥作用、促进肽产生或纯化、延长半寿期及其他作用。同理可以适用于核苷酸序列。
如本文中所用，"载体"可以是能够送递并在宿主细胞或对象中表达至少第一和第二核酸分子的任意介质。载体可以是染色体外的(例如附加体)或整合的(用于并入宿主染色体)、自主复制或非自我复制的，多拷贝或低拷贝的，双链或单链的、裸露的或与其他分子复合的(例如与脂质或聚合物复合以形成颗粒结构(如脂质体、脂质复合体或纳米粒子)的载体、包裹在病毒衣壳内的载体和固定在固相粒子上的载体等)。术语"载体，，的定义也包括已经被修饰以允许偏好地靶向特定宿主细胞的载体。靶向载体的一个特征性 特点是在其表面存在配体，其中所述配体能够识别并结合至细胞的且表面
暴露的组分如细胞特异性标记(例如HPV感染的细胞)、组织特异性标记或 肿瘤特异性标记。该配体可以被遗传地插入在载体表面存在的多肽中(例 如，如WO94/10323和WO02/96939中描述的腺病毒纤突、五邻体、pIX或 如EP 1 146 125中描述的痘苗病毒p14基因产物)。
在本发明的上下文中，术语"核酸"、"核酸分子"、"多核苷酸"和"核苷 酸序列"以互换方式使用并且定义了多脱氧核糖核苷酸(DNA)或多核糖核 苷酸(RNA)分子或其任意组合的任意长度的聚合物。该定义包括单链或双 链的、线性或环状的、天然存在的或合成性核苷酸。另外，此类多核苷酸 可以包含非天然存在性核苷酸(例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，如US 5,525,711、 US 4，711,955或EPA 302 175中所描述的那些)以及化学修饰(例 如见WO 92/03568; US 5,118,672)，以提高核酸的体内稳定性、增强其送 递或减低从宿主对象中的清除速率。若存在，可以在聚合之前或之后赋予 修饰。
术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中以互换方式用来指包含由肽键连 接的9个或更多个氨基酸的氨基酸残基聚合物。该聚合物可以是线性或环 状的。在本发明的上下文中，"多肽"可以包含作为L立体异构物(天然存在 形式)或D立体异构物的氨基酸并且可以包含除20种天然存在性氨基酸之 外的氨基酸，如(3-丙氨酸、鸟氨酸或甲硫氨酸亚砜或在一个或多个a-氨基、 a-羧基或侧链上被修饰(例如通过附接甲基、甲酰、乙酰基、糖基、磷酸基 等)的氨基酸。作为一般提示，若氨基酸聚合物长(例如多于50个氨基酸残 基)，则它优选称作多肽或蛋白质。因此，"肽"指约9个至约50个氨基酸长 度的片段。在本发明的上下文中，肽优选地包含天然存在性(或天然)蛋白质 的所选区域，例如含有表位的其免疫原性片段。
如本文中定义的术语"多肽"包括天然多肽以及修饰的多肽。如本文中 所用，术语"天然"指从自然界来源中回收的区别于由人在实验室中以人工 方式修饰或改造的材料。例如，天然多肽由存在于野生型生物或细胞的基 因组中的基因编码。相反，修饰的多肽由这样的核酸分子编码，其中所述 核酸分子已经在实验室中被修饰，从而与天然多肽的区别在于例如一个或 多个氨基酸的插入、缺失或置换或这些可能性的任意组合。当构思了几个
10修饰时，它们可以涉及连续残基和/或非连续残基。由本发明构思的修饰的 实例可以导致由该天然多肽显示的生物活性的改变。可以通过常规方法， 如通过结构性和功能性分析法，鉴定对给定生物学活性关键的氨基酸，并 且本领域技术人员可以轻易地确定能够减低或取消这种生物学活性的突变 类型。此类修饰可以通过常规技术如位点定向诱变法进行。备选地，可以 通过化学合成在自动化过程中产生编码修饰的多肽的合成性核酸分子(例 如，如所附实施例部分中所述，从重叠的合成性寡核苷酸中装配出来)。
如本文中所用的术语"获得"指从自然界中找到、分离、纯化或衍生的 材料。"分离"意指从其自然环境中移出。"纯化"指该材料基本上不含与其 天然关联的至少一种其他组分。"衍生"指与天然材料相比的一个或多个修 饰(尤其突变，如置换、缺失和/或插入)。分离、纯化和修饰技术在本领域 中是常规的并且取决于待获得的材料(例如从自然界的一个来源克隆核酸
分子可以通过使用限制性酶、通过PCR或通过化学合成进行)。
如本文中所用，术语"同源性"通常表述百分比并且指在至少40个连续 核苷酸(例如大约40、 45、 50、 55、 57、 58、 59、 60、 70或甚至更多个连 续核苷酸)部分的范围内彼此仍保留给定程度的相同性的核苷酸序列。"至 少80%"指大约80°/。或大于80% (例如超过80%的任意值，有利地至少85%， 合意地至少87%，优选至少90%，更优选至少95%，仍更优选少97%至多 到100%的序列同源性)。"小于75%"指低于75的任意值，例如大约74、 72、 70、 68、 65、 62、 60%或甚至更小。两个核苷酸序列之间的同源性百分比 是由所述序列共有的相同位置数目的函数，同时考虑了需要导入用于最佳 比对的空位数和每个空位的长度。在本领域中多种计算机程序和数学算法 可用于确定核苷酸序列之间的相同性百分比，如GCG Wisconsin软件包和 在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)可公开获得并在印刷出版物中描述(例如Altschul等人，1990, J. Mol. Biol. 215， 403-410)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序。
作为起点，可以使用第一和第二核酸分子之间在修饰之前的序列比对 结果，旨在揭示共同拥有80%或大于80%同源性百分比的具有40个或更多 个连续核苷酸的一个或多个部分，例如"同源"部分。在具体实施方案，至 少在40个或更多个(例如大约40、 45、 50、 55、 57、 58、 59、 60、 70个或 甚至更多个)连续核苷酸的所述同源部分中修饰第一核酸分子或第二核酸分子或第一以及第二核酸分子的密码子使用模式(例如借助密码子使用模
式的简并性)，以使得所述的同源性百分比减低至小于75% (例如大约74、 72、 70、 68、 65、 62、 60%或甚至更小)。
尽管甲硫氨酸和色氨酸残基各自由独特的核酸三联体(例如密码子)编 码，然而可以使用不同的密码子来编码其余18种氨基酸(遗传密码的简并 性)。例如，氨基酸由以下密码子编码丙氨酸(Ala或A)由密码子GCA、 GCC、 GCG和GCU编码；半胱氨酸(C或Cys)由密码子UGC和UGU;天 冬氨酸(D或Asp)由密码子GAC和GAU编码；谷氨酸(E或Glu)由密码子 GAA和GAG编码；苯丙氨酸(F或Phe)由密码子UUC和UUU编码；甘氨 酸(G或Gly)由密码子GGA、 GGC、 GGG禾卩GGU编码；组氨酸(H或His) 由密码子CAC和CAU编码；异亮氨酸(I或Ile)由密码子AUA、 AUC和 AUU编码；赖氨酸(K或ys)由密码子AAA和AAG编码；亮氨酸(L或Leu) 由密码子UUA、 UUG、 CUA、 CUC、 CUG和CUU编码；甲硫氨酸(M或 Met)密码子AUG编码；天冬酰胺(N或Asn)由密码子AAC和AAU编码； 脯氨酸(P或Pro)由密码子CCA、 CCC、 CCG和CCU编码；谷氨酰胺(Q或 Gln)由密码子CAA和CAG编码；精氨酸(R或Arg)由密码子AGA、 AGG、 CGA、 CGC、 CGG和CGU编码；丝氨酸(S或Ser)由密码子AGC、 AGU、 UCA、 UCC、 UCG和UCU编码；苏氨酸(T或Thr)由密码子ACA、 ACC、 ACG和ACU编码；缬氨酸(V或Val)由密码子GUA、 GUC、 GUG和GUU 编码；色氨酸(W或Trp)由密码子UGG编码和酪氨酸(Y或Tyr)由密码子 UAC和UAU编码。
减低在所述第一和第二核酸分子内存在的一个或多个同源部分中的同 源性百分比可以通过利用遗传密码的简并性并修饰第一核酸分子和/或第 二核酸分子中的密码子使用模式实现。修饰密码子使用模式一般通过将一 个或多个"天然性"密码子替换为另一个密码子来进行。例如，将编码Arg 的AGA密码子替换为编码Arg的CGC密码子会降低密码子的3个位置中 2个位置的同源性。不需要简并全部天然密码子，因为可以用局部替换充分 地减低同源性。另外，修饰密码子使用模式可以在整个核酸分子范围内进 行或可以限定于在修饰前存在的同源部分。希望地是，在本发明的上下文 中，简并性在第一核酸分子中进行并且限定于同源部分。优选地，在核苷 酸水平修饰密码子使用模式并且所述修饰是在氨基酸水平上沉默的，例如，相同氨基酸的密码子，以致此 类修饰在编码的多肽中不翻译。更优选地，当可能时，以这样的方式修饰
密码子使用模式，以致将第一和第二核酸分子之间的同源部分限制在小于9 个或8个连续核苷酸，有利地至小于7个连续核苷酸，优选地至小于6个 连续核苷酸，并且更优选至小于5个连续核苷酸。对密码子使用模式的修 饰可以通过本领域技术人员已知的众多方式进行，如位点定向诱变(例如使 用法国Amersham， Les Ullis的SculptorTM体外诱变系统)、PCR诱变、DNA 改组和通过化学合成技术(例如产生合成性核酸分子)。
当本发明的载体包含多于两种核酸分子时，则可以修饰在该载体中所 包含的从天然核酸序列获得的任意核酸分子(其中所述天然核酸序列在一 40个或更多个连续核苷酸的部分与从中获得另一个核酸分子的至少一个其 他天然核酸序列显示大约80%或大于80%的同源性百分比)，以使得所述的 同源性百分比减低至小于75%，即使得该载体中所包含的核酸分子对无一 会包含显示大于75%的相同性百分比的40个或更多个连续核苷酸部分。
可以使用从中获得所述核酸分子的每个(每对)天然性序列之间的序列 比对结果，旨在揭示出显示80%或大于80%同源性百分比的一个或多个部 分。随后，修饰一个或多个天然序列的序列，尤其通过简化密码子使用， 从而减低至少同源部分中的同源性百分比至小于75%。最后，该载体中所 包含的核酸分子均应当不包含与所述载体中所包含的任何其余核酸分子显 示大于75%相同性百分比的40个或更多个(例如45、 50、 55、 57、 58、 59、 60、 70或甚至更多个)连续核苷酸部分。
如上所述，由该载体中包含的核酸分子编码的多肽可以具有或可以不 具有与天然多肽相同的氨基酸序列。尤其，除了使用简并密码子以致于至 少在核酸分子的同源部分中减低同源性的突变之外，该载体中所包含的所 述核酸分子也可以包含导致或不导致修饰所编码多肽的氨基酸序列的额外 突变。
本发明的载体包括病毒载体以及非病毒载体(例如质粒DNA)。合适的 非病毒载体包括质粒如pREP4、pCEP4 (Invitrogene)、pCI (Promega)、pCDM8 (Seed， 1987, Nature 329， 840)、 pVAX禾口 pgWiz (Gene Therapy System Inc; Himoudi等人，2002, J. Virol. 76， 12735-12746)。"病毒载体"在本文中根据 本领域认可的意思使用。它指包含病毒来源的至少一个元件的任意载体，所述的元件包括完整病毒基因组、其部分或如下文所述的修饰的病毒基因 组以及其产生的病毒粒子(例如包裹到病毒衣壳中以产生感染性病毒粒子 的病毒载体)。本发明的病毒载体可以是复制型的或可以是遗传上失能的， 从而是复制缺陷型的或复制受损的。如本文中所用的术语"有复制能力"包 括选择复制型和条件复制型病毒载体，其中所述病毒被改造成在特定宿主 细胞(例如肿瘤细胞)中更好地或选择性地复制。病毒载体可以从多种不同的
病毒获得并且尤其从选自由逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、痘 病毒、疱疹病毒、麻疹病毒和泡沫病毒组成的组中的病毒获得。
在一个实施方案中，本发明的载体是腺病毒载体(综述，见"Adenoviral vectors for gene therapy", 2002,编辑D. Curid禾卩J. Douglas, Academic Press)。它可以从任意的人或动物腺病毒衍生。可以在本发明的环境中使用 任意的血清型和亚群。可以更具体地提及亚群A (例如血清型12、 18和31)、 亚群B(例如血清型3、 7、 11、 14、 16、 21、 34和35)、亚群C (例如血清 型l、 2、 5和6)、亚群D (例如血清型8、 9、 10、 13、 15、 17、 19、 20、 22-30、 32、 33、 36-39和42-47)、亚群E (血清型4)和亚群F (血清型40和 41)。特别优选的是人腺病毒2 (Ad2)、 5 (Ad5)、 6 (Ad6)、 11 (Adl 1)、 24 (Ad24) 和35 (Ad35)。此类腺病毒从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.))可获得并且已经是描述其序列、 组织和产生方法的无数出版物的主题，因而允许技术人员使用它们(见例如 US6，133,028; US6,110，735; WO02/40665; WO00/50573; EP 1016711; Vogels等人，2003, J. Virol. 77, 8263-8271)。
本发明的腺病毒载体可以是复制型的。复制型的腺病毒载体的众多实 例是本领域技术人员轻易可得的(见例如Hemandez-Alcoceba等人，2000， Human Gene Ther. 11， 2009-2024; Nemunaitis等人，2001,Gene Ther. 8, 746-759; Alemany等人，2000， Nature Biotechnology 18， 723-727; WO00/24408 ; US5,998，205, WO99/25860, US5，698,443, WO00/46355, WO00/15820和WO01/36650)。
备选地，本发明的腺病毒载体可以是复制缺陷型的(见例如 W094/28152)。优选的复制缺陷型腺病毒载体是El缺陷的(例如US 6,136,594和US 6,013,638)，其中El缺失从大约第459位置延伸至第3328 位置或从大约第459位置延伸至第3510位置(通过参考在GeneBank中以登录号M73260并在Chroboczek等人，1992， Virol. 186, 280-285中披露的人 腺病毒5型的序列)。可以通过缺失腺病毒基因组的额外部分(例如在非必需 E3区域或在其他必需E2、 E4区域中，如Lusky等人，1998, J. Virol 72, 2022-2032中所述)进一步改善克隆容量和安全性。
第一和第二核酸分子可以独立地插入本发明腺病毒载体的任意位置 中，如Chartier等人(1996， J. Virol. 70, 4805-4810)中描述，并且相对于插入
区域的天然转录方向在有义和/或反义方向上独立地安置。例如，它们可以 被同时插入而替代E1区域，或备选地，插入一个核酸分子替代El区域并 且插入另一个核酸分子替代E3区域。
在另一个实施方案中，本发明的载体是痘病毒载体(见例如Cox等人 "Viruses in Human Gene Therapy"中，J. M. Hos编辑，Carolina Academic Press)。该载体可以从痘病毒科(poxviridae)的任意成员、尤其金丝雀痘病毒 (例如，如W095/27780中所述的ALVAC)、禽痘病毒(例如，如Paoletti等 人，1995， Dev. Biol. Stand. 84， 159-163中所述的TROVAC)或痘苗病毒获得， 优选后者。合适的痘苗病毒可以选自由从选自由哥本哈根株(Goebel等人， 1990， Virol. 179, 247-266禾卩517-563; Johnson等人，1993, Virol. 196， 381-401)、 Wyeth株、NYVAC(见W092/15672和Tartaglia等人，1992， Virology 188, 217-232)和高度减毒的改良Ankara (MVA)株(Mayr等人，1975, Infection 3, 6-16)构成的组。此类载体和产生方法在本领域技术人员可获得 的众多文献中描述(例如Paul等人，2002， Cancer gene Ther. 9， 470-477; Piccini等人，1987， Methods of Enzymology 153, 545-563; US 4,769,330; US 4,772,848; US 4,603,112; US 5,100,587和US 5，179，993)。在本发明中 使用的第一和第二核酸分子优选地插入痘病毒基因组的非必需基因座中， 旨在重组痘病毒仍保持活力和感染性。非必需区域是非编码的基因间区或 其失活或缺失不明显破坏病毒生长、复制或感染的任意基因。也可以构思 在病毒必需基因座中的插入，只要在病毒粒子产生期间提供缺损功能，例 如通过使用携带互补序列的辅助细胞系，其中所述互补序列与痘病毒基因 组中所缺失的那些序列相对应。
当使用哥本哈根痘苗病毒时，至少第一和第二核酸分子优选地插入胸 苷激酶基因(tk)中(Hruby等人，1983, Proc. Natl. Acad. Sci USA 80， 3411-3415; Weir等人，1983, J. Virol. 46， 530-537)。然而，其他插入位点也是适合的，例如在血凝素基因(Guo等人，1989,J. Virol. 63， 4189-4198)中、 在KIL基因座中、在u基因中(Zhou等人，1990, J. Gen. Virol. 71， 2185-2190) 或在痘苗病毒基因组的左侧端，其中己经在文献中报道了在左侧端的多种 自发或工程化缺失(Altenburger等人，1989, Archives Virol. 105， 15-27; Moss 等人，1981， J. Virol. 40， 387-395; Panicali等人，1981， J. Virol. 37， 1000-1010; Perkus等人，1989， J， Virol. 63， 3829-3836; Perkus等人，1990, Virol. 179， 276-286; Perkus等人，1991， Virol. 180， 406-410)。
当使用MVA时，可以在MVA基因组中存在的已鉴定的缺失I至VII 的任一者中以及在D4R基因座中独立地插入至少第一和第二核酸分子 (Antoine等人，1998， Virology 244, 365-396)，不过优选在缺失II和/或III 中的插入(Meyer等人，1991, J. Gen. Virol. 72， 1031-1038; Sutter等人，1994, Vaccine 12， 1032-1040)。
当使用禽痘病毒时，尽管可以考虑在胸苷激酶基因中插入，然而至少 第一和第二核酸分子优选地导入位于ORF7和9之间的基因间区内(见例如 EP 314 569和US 5,180,675)。
在本发明的另一个实施方案中，至少第一和第二核酸分子独立地编码 能够在表现或易于表现病理状况的对象中提供治疗活性或保护活性的多 肽。如本文中所用的术语"对象"指脊椎动物，特别是哺乳动物物种的成员， 尤其是家养动物、牲畜、体育动物和包括人在内的灵长类。此种多肽优选 地选自由免疫原性多肽和抗肿瘤多肽组成的组。
"免疫原性"多肽指这样的多肽，所述多肽能够在表达该多肽的对象中 诱导、刺激、发育或促进免疫系统。这种免疫应答可以是体液应答或细胞 应答或体液应答和细胞应答。体液应答激发针对所讨论多肽的抗体产生， 而细胞应答激发T-辅助细胞和/或CTL应答和/或刺激细胞因子产生。 一般， 可以通过本领域中作为标准的多种测定法体外或体内地评价多肽的免疫原 属性(对可用于评价免疫应答的启动和激活的技术的一般描述，见例如J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health编辑的Coligan等人，Current Protocols in Immunology最新版)。例如，检测可以是比色法、荧光测定或 放射法，并且合适的技术包括ELISA、蛋白质印迹法、放射免疫测定法和 免疫沉淀测定法。细胞免疫的测量可以通过测量由激活的效应细胞(包括从 CD4+和CD8+T-细胞衍生的那些效应器细胞)分泌的细胞因子谱(例如通过ELIspot量化产生IFNy的细胞)、通过确定免疫效应细胞的激活状态免疫(例 如借助传统[3印胸苷摄取的T细胞增殖测定法)、通过分析致敏对象中的抗 原特异性T淋巴细胞(例如在细胞毒性测定法中的肽特异性裂解)进行。多 肽的免疫原属性也可能在合适的动物模型中通过ELIspot、基于四聚物的分 析技术或用于分析T细胞介导的免疫的其他标准技术评价。合适的免疫原 性多肽可以从乙型肝炎病毒(HBV)(如EP 414 374; EP 304 578或EP 198 474 中描述的S、 preS2或preSl-多肽)；丙型肝炎病毒(HCV)(例如Core (C)、包 膜糖蛋白E1、 E2、非结构多肽NS2、 NS3、 NS4,或NS5或其任意组合)； 人免疫缺陷病毒(HIV)(例如gpl20或gpl60)和乳头状瘤病毒(如此后所述) 获得。
"抗肿瘤"多肽指能够导致抑制或净縮减肿瘤细胞扩张的多肽。多肽的 抗肿瘤属性可以在适宜的动物模型中或在治疗的对象中由实际肿瘤大小在 一段时间后縮小而确定。多种方法可以用来估计肿瘤肿瘤大小，所述方法 包括放射学方法(例如，单光子和正电子发射计算机断层摄影术；通常见 "Nuclear Medicine in Clinical Oncology", Winkler, C.(编辑)Springer画Verlag, New York, 1986)，使用常规成像试剂(例如柠檬酸镓-67)的方法、免疫学方 法(例如放射标记的针对特定肿瘤标记的单克隆抗体)以及超声波方法(见 "Ultrasonic Differential Diagnosis of Tumors", Kossoff禾口 Fukuda，(编辑)， Igaku-Shoin， New York, 1984)。备选地，可以基于肿瘤标记存在的减少而确 定多肽的抗肿瘤属性。实例包括用于检测前列腺癌的PSA和用于检测结直 肠癌和某些乳腺癌的CEA。另外，可以在合适的动物模型中，例如使用以 代表性人癌细胞系注射的小鼠，确定多肽的抗肿瘤属性。在明显的肿瘤已 经发育后，用本发明的载体注射小鼠，并随后监测肿瘤生长速率的降低和 存活增加。另外，多种体外方法可以用来预测体内肿瘤抑制作用。合适的 抗肿瘤多肽包括肿瘤相关抗原(TAA)如MUC-I(WO92/07000; Acres等人， 2005， Exp. Rev. Vaccines 4(4))、 BRCA-I、 BRCA-2(Palma等人，2006， Critical Reviews in Oncology/haematology 27， 1-23)、癌胚抗原CEA(Conroy等人， 1995，Gene Ther; 2， 59-65)、 MAGE (WO99/40188; De Plaen等人，1994， Immunogenetics 40, 360-369)、 MART-I、 gpl00 (Bakker等人，1994, J. Exp. Med. 179， 1005-9)、 PRAME、 BAGE、 Lage (又称作NY Eos 1)、 SAGE、 HAGE (WO99/53061)、 GAGE (Robbins禾口 Kawakami, 1996. Current Opinions inImmunol, 8， 628-36)和前列腺特异性抗原(PSA)(Ferguson等人，1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96， 3114-9; WO98/12302, WO98/20117和WOOO/04149)
以及来自具有肿瘤诱导潜能的病毒(例如乳头状瘤病毒)中的病毒多肽。
在本发明的另一个实施方案中，所述至少第一和第二核酸分子从同一 种生物体或从密切相关的生物体获得。
如本文中所用，术语"生物体"包括微生物，其优选地具有致病潜能， 以及高等真核生物。术语"微生物"指真菌、细菌、原虫和病毒。病毒的代 表性实例包括，而不限于HIV (HIV-I或HIV-2)、人疱疹病毒(例如HSV1 或HSV2)、巨细胞病毒(CMV)、 Epstein Barr病毒(EBV)、肝炎病毒(例如甲 型肝炎病毒(HAV)、 HBV、 HCV和戊型肝炎病毒)、黄病毒(例如黄热病毒)、 带状疱疹病毒(VZV)、副粘病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、麻疹病毒、 流感病毒和乳头状瘤病毒(如上文定义)。合适细菌的代表性实例包括，不限 于奈瑟氏菌属(Neisseria)(例如淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏 菌(N. meningitidis));博德特菌属(Bordetella)(例如百日咳博德特菌(B. pertussis)、副百日咳博德特菌(B. parapertussis)和支气管炎博德特菌(B. bronchiseptica))、分枝杆菌属(Mycobacteria)(例如结核分枝杆菌(M. tuberculosis)、牛分枝杆菌(M. bovis)、麻风分枝杆菌(M. leprae)、鸟分枝杆 菌(M. avium)、副结核分枝杆菌(M. paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis));军团菌属(Legionella)(例如嗜肺军团菌(L. pneumophila));埃细 氏菌属(Escherichia)(例如肠毒性大肠杆菌、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大 肠杆菌)；志贺氏菌属(Shigella)(例如宋内志贺氏菌(S. so皿ei)、痢疾志贺氏 菌(S. dysenteriae)、福氏志贺氏菌(S. flexneri));沙门氏菌属(Salmonella)(例 如伤寒沙门氏菌(S. typhi)、副伤寒沙门氏菌(S. paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌 (S. cholemesuis)、肠炎沙门氏菌(S. enteritidis));李斯特菌属(Listeria)(例如 单核细胞增多李斯特菌(L. monocytogenes));螺杆菌属(Helicobacter)(例如幽 门螺杆菌(H. pylori));假单胞菌属(Pseudomonas)(例如铜绿假单胞菌(P. aeruginosa));葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如金黄色葡萄球菌(S. aureus)、 表皮葡萄球菌(S. epidermidis));肠球菌属(Enterococcus)(例如粪肠球菌(E. faecalis、屎肠球菌(E. faecium));芽孢杆菌属(Bacillus)(例如炭疽芽胞杆菌(B. anthmcis));棒状杆菌(Corynebacterium)(例如白喉杆菌(C. diphtheriae))和衣 原体(Chlamydia)(例如沙眼衣原体(C. trachomatis)、肺炎衣原体(C.
18pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C. psittaci))。寄生虫的代表性实例包括，不限 于疟原虫属(Plasmodium)(例如恶性疟原虫(P.falciparum));弓形虫属
(Toxoplasma)(例如刚地弓形虫(T.gondii));利什曼原虫(Leshmania)(例如硕大 利什曼原虫(L.major));肺囊虫属(Pneumocystis)(例如卡氏肺囊虫(P.carinii)) 和血吸虫属(Schisostoma)(例如曼氏血吸虫(S.mansoni))。真菌的代表性实例 包括，不限于假丝酵母属(Candida)(例如白色假丝酵母(C.albicans))和曲霉属 (Aspergillus)。高等真核生物优选地是包括人的哺乳动物。
"同一种生物体"定义为源自共同祖先并已经遵循相同进化途径的生 物。代表性实例包括具有相同血清型或基因型的多种病毒分离株。例如， 将两个HPV-16分离株划分在这个类别中。"密切相关的生物体"定义为源自 共同祖先但在进化期间已经趋异的生物。代表性实例包括具有不同血清型 或基因型的病毒。例如，将HPV-16和HPV-18划分在这个类别中。
在优选的实施方案中，从中获得至少第一和第二核酸分子的生物体是 乳头状瘤病毒并且每种核酸分子编码一种乳头状瘤病毒多肽。"乳头状瘤病 毒"可以定义为属于乳头状瘤病毒亚科的病毒并且该术语包括非人物种来 源的动物乳头状瘤病毒以及人乳头状瘤病毒(HPV)，其中所述非人物种包 括，但不限于牛、马、兔、绵羊、犬、非人灵长类和啮齿类。目前已经鉴 定了多于100种HPV基因型(VanRanst等人，1992， J. Gen. Virol. 73， 2653; De Villiers等人，2004, Virology 324, 17-27)，其中根据致瘤潜能，已经所述 基因型划分为"低危"(LR)和"高危"(HR)血清型"。LR HPV在感染对象中引 起良性肿瘤，而HR具有恶性进展的高风险。
一般而言，乳头状瘤病毒具有一个被蛋白质衣壳包围的约7900碱基对 双链环状DNA(见例如Pfister， 1987，在The papovaviridae: The Papillomaviruses, Salzman禾卩Howley编辑，Plenum Press, New York,第1-38 页)。它们的基因组由三个功能区早期区(E)、晚期区(L)和长调控区(LCR) 组成。LCR含有转录调节序列如增强子和启动子。晚期区编码L1和L2结 构蛋白，它们分别是主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，而早期区编码在细胞 核中优势存在的控制病毒复制、转录和细胞转化的调节蛋白(E1-E7)。更具 体地，El蛋白是具有ATP依赖性解螺旋酶活性的DNA结合磷蛋白 (Desaintes禾口 Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339-347; Wilson等人， 2002, Virus Gene 24， 275-290)。 E2蛋白是调节病毒基因转录并控制DNA复制的多功能性DNA结合磷蛋白(Bechtold等人，2003, J. Virol. 77， 2021-8)。 E4编码的蛋白质结合并破坏细胞浆角蛋白网络并在病毒成熟中发挥作用。 E5蛋白的功能仍存在争论并且该蛋白质的表达往往在宿主染色体中病毒整 合期间丧失。HR HPV基因型的编码E6和E7的基因产物往往参与感染细 胞的致瘤性转化(Kanda等人，1988, J. Virol. 62, 610-3; Vousden等人，1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell等人，1987， J. Virol. 61, 3635-40)，假定通过这 些病毒蛋白分别与细胞肿瘤抑制蛋白基因产物p53和视网膜母细胞瘤(Rb) 蛋白的结合作用(这在B.N. Fields, D. M. Knipe和P.M. Howley (编辑), Virology,第3版.Lippincott-Raven Press, New York, N.Y中的Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication,第2045-2076页综述)。参与天然 HPV-16 E6多肽与p53结合的氨基酸残基已经清晰地定义为从第118至122 位残基的(+l是首个Met残基，或从优选使用的第二 Met残基开始的从第 111至115位残基)(Crook等人，1991, Cell 67, 547-556)并且参与天然HPV-16 E7多肽与Rb结合的那些氨基酸残基位于第21至26位残基(Mimger等人， 1989， EMBO J. 8, 4099-4105; Heck等人，1992， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 4442-4446)。
优选地，至少第一和第二核酸分子独立地从选自由HPV-16、 HPV-1S、 HPV-30、 HPV-31、 HPV隱33、 HPV-35、 HPV誦39、 HPV-45、 HPV-51 、 HPV-52、 HPV-56、 HPV-58、 HPV-59、 HPV-66、 HPV-68、 HPV-70禾卩HPV-85组成
的组中的高危型乳头状瘤病毒获得。
如本文中所用的"乳头状瘤病毒多肽"指由源自乳头状瘤病毒基因组/来 源的核酸分子编码的本领域确认的多肽。如与术语"多肽"相关联的上文定 义，"乳头状瘤病毒多肽"包括天然的、修饰的乳头状瘤病毒多肽和其肽。 乳头状瘤病毒来源包括，但不限于生物样品(例如从已经暴露于乳头状瘤病 毒的对象中收集的生物样品、组织切片、尸检标本和组织培养物)、培养的 细胞(例如在ATCC获得的CaSki细胞)以及在保藏机构、商业目录中获得 或在文献中描述的重组材料。众多乳头状瘤病毒基因组的核苷酸序列和所 编码多肽的氨基酸序列已经在文献中描述并且可在专业数据库例如 Genbank中获得。就一般信息而言，HPV-16基因组在Genbank中以登录号 NC 01526和K02718描述；HPV-18以登录号NC 001357和X05015描述； HPV-31以登录号J04353描述；HPV-33以登录号M12732描述；HPV-35以登录号NC 001529描述；HPV-39以登录号NC 001535描述；HPV-45以登录号X74479描述；HPV-51以登录号NC 001533描述；HPV-52以登录号NC 001592描述；HPV-56以登录号X74483描述；HPV-58以登录号D90400描述；HPV-59以登录号NC 001635描述；HPV-68以登录号X67160和M73258描述；HPV-70以登录号U21941描述并且HPV-85以登录号AF131950描述。
由第一和/或第二核酸分子编码的乳头状瘤病毒多肽可以是早期、晚期乳头状瘤病毒多肽或其任意组合。早期乳头状瘤病毒多肽包括El、 E2、E4、 E5、 E6禾卩E7，而晚期多肽可以是LI或L2。数目众多的乳头状瘤病毒血清型的早期和晚期多肽的核苷酸和氨基酸序列在技术人员可获得的文献中描述。
希望是，至少第一和第二核酸分子独立地编码选自由El、 E2、 E6和E7组成的组中的早期多肽。出于说明目的，天然HPV-16 El、 E2、 E6和E7多肽的氨基酸序列分别在SEQIDNO:l-4中给出。然而，本发明不限于这些示例性序列。实际上，所述核苷酸和氨基酸序列可以在不同的乳头状瘤病毒分离株之间变动，并且本发明的范围包括这种天然的遗传变异以及非天然的修饰，如下文所述的那些修饰。在此后给出合适的修饰的乳头状瘤病毒多肽的示例描述(例如在SEQ ID NO:5-8和64-65中)，然而(例如，
针对源自其他乳头状瘤病毒基因型的多肽，通过序列比较)调整本文中所述的修饰，属于本领域技术人员的能力范围。
在本发明中使用的合适乳头状瘤病毒El多肽包括刺激病毒复制无效的突变体，即它们刺激病毒复制的能力在统计上显著地低于相应的天然El多肽(例如小于75%,有利地小于50%，优选小于10%并且更优选小于5°/。)。对于一般指南而言，负责刺激病毒复制的结构域位于El的中央部分(例如Hugues和Romanos, 1993, Nucleic Acids Res.21, 5817-23)。在本领域技术人员可获得的文献中描述复制缺陷型El多肽的代表性实例，例如在Yasugi等人(1997， J. Virol 71， 5942-51)中。在本发明上下文中优选的修饰包括将HPV-16 El多肽第482位置处的Gly残基置换为另一种残基(优选置换为Asp残基)(例如见SEQ ID NO:5)或将HPV-18 El多肽第489位置处的Gly残基置换为另一种残基(优选置换为Asp残基)(例如见SEQ ID NO:6)。
在本发明中使用的合适E2多肽包括与天然E2多肽相比，在转录激活作用和/或复制活性方面缺陷的突变体(例如小于75%,有利地小于50%，优选地小于10%并且更优选地小于5%)。对于一般指南，负责转录激活作用和刺激复制的结构域位于E2的氨基末端部分(见dorf等人，1985， Virology,145,181-185; Kennedy等人，1991， J. Virol. 65, 2093-2097; Cole等人，1987,J. Mol.Biol. 193, 599-608; McBride等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,510-514)并且可以使用标准方法轻易地确定E2复制和转录活性的降低或缺乏(见例如Sakai等人，1996, J. Virol. 70, 1602-1611)。在本领域技术人员可获得的文献中描述用在本发明中的合适缺陷型E2突变体，例如在Demeret等人(1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777-4784)、 Sakai等人(1996， J. Virol. 70,1602-1611)、 Brokaw等人(1996, J. Virology 70, 23-29)和Ferguson等人(1996，J. Virology 70， 4193-4199)中描述。在本发明上下文中优选的修饰包括将HPV-16 E2第39位置处的Glu残基优选地置换为Ala残基(E39A)和/或将第73位置处的lie残基优选地置换为Ala残基(I73A)(例如见SEQ ID NO:7)。出于说明目的，在HPV-16 E2的第39和73位置处的Glu和lie残基分别对应于HPV-18 E2的第43和77位置处的Glu和lie残基(例如见SEQ IDNO:8)。
在本发明中使用的合适E6多肽包括在与细胞的肿瘤抑制基因产物p53结合方面无效的非致瘤性突变体。非致瘤性E6多肽的代表性实例在例如Pirn等人(1994， Oncogene 9， 1869-1876)和Crook等人(1991， Cell 67， 547-556中描述。在本上下文中优选的修饰包括HPV-16 E6中残基118至122(CPEEK)的缺失(例如见SEQ ID NO:64)或HPV-18 E6中113至117 (NPAEK)的缺失。
在本发明中使用的合适E7多肽包括在与细胞的肿瘤抑制基因产物Rb结合方面无效的非致瘤性突变体。非致瘤性E7多肽的代表性实例在例如Munger等人(1989, EMBO J. 8， 4099-4105)、Heck等人(1992， Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89， 4442-4446)和Phelps等人(1992, J. Virol. 66, 2148-2427)中描述。在本上下文中优选的修饰包括HPV-16 E7中残基21至26 (DLYCYE)的缺失(例如见SEQ ID NO:65)或HPV-18 E7中24至28 (DLLCH)的缺失。
此外，由至少第一和/或第二核酸分子编码的多肽(例如乳头状瘤病毒多肽)还可以包含额外的修饰，其中所述额外修饰有益于所编码多肽的加工、稳定性和/或溶解度的额外修饰，例如阻抑潜在切割位点、阻抑潜在位点和/或呈递在表达细胞的表面。例如，编码的多肽可以包含锚定于表达细胞的
质膜内部的合适信号。实际上，先前已知膜呈递作用改善了 I类MHC和/或II类MHC呈递，从而导致宿主免疫系统识别作用增强(见例如WO99/0388)。由于天然的早期乳头状瘤病毒多肽(E1、 E2、 E6和E7)是细胞核蛋白质(尽管不能确切地鉴定到常见核定位信号)，可能有益的是使之定位在质膜处，旨在改善其免疫原潜力并且因此改善它们在宿主对象中的治疗效力。
多肽在宿主表达细胞表面的高效膜呈递可以通过将该多肽融合于信号肽和膜锚定肽来实现。此类肽是本领域已知的。简而言之，信号肽通常存在于膜呈递或分泌的多肽的氨基端并且启动它们进入内质网(ER)。信号肽包含15至35个基本上疏水的氨基酸，所述氨基酸随后由位于ER的特异性内肽酶去除以产生成熟的多肽。膜锚定肽通常是本质上高度疏水的并且起到将多肽锚定于细胞膜中的作用(见例如Bmnden和Tooze， 1991，在Introduction to Protein Structure中，第202-214页，NY Garland)。可以在本发明上下文中使用的信号肽和膜锚定性肽的选择是繁多的。它们可以独立地从任意的分泌或膜锚定的多肽(例如细胞多肽或病毒多肽)如狂犬病病毒糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白获得或可以是合成肽。插入信号肽的优选位点是用于翻译起始的密码子的氨基端下游并且插入膜锚定性肽的优选位点是是羧基端，例如紧邻终止密码子的上游。根据需要，可以使用接头肽来将信号肽和/或膜锚定肽与编码的多肽连接。
合适在本发明中使用的膜锚定性和缺陷型El多肽的代表性实例在SEQ ID NO:5 (定义如实施例部分中所述HPV-16 SS-E1*-TMR多肽)禾口在SEQ ID NO:6 (定义如实施例部分中所述HPV-18 SS-E1 *-TMF多肽)给出。合适在本发明中使用的膜锚定性和缺陷型E2多肽的代表性实例在SEQ IDNO:7 (定义如实施例部分中所述HPV-16 SS-E2*-TMR多肽)和在SEQ IDNO:8 (定义如实施例部分中所述HPV-18 SS-E2*-TMF多肽)给出。合适在本发明中使用的膜锚定性和非致瘤性E6和E7多肽的代表性实例分别在SEQID NO:64 (定义如实施例部分中所述HPV-16 SS-E6*-TMR多肽)和在SEQIDNO:65 (定义如实施例部分中所述HPV-16 SS-E7*-TMF多肽)给出。
在特别优选的实施方案中，至少第一核酸分子和第二核酸分子编码从同一种HPV血清型中获得的两种不同乳头状瘤病毒多肽。
23在这个实施方案的优选方面，第一核酸分子编码E1多肽并且第二核酸
分子编码E2多肽或反之亦然。希望是，编码El和E2的核酸分子从HPV-16 或从HPV-18获得。优选地，第一核酸分子编码包含SEQ ID NO:5所示的 氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成、或由该氨基酸序列组成的多肽 并且第二核酸分子编码包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或基本上由该 氨基酸序列组成、或由该氨基酸序列组成的多肽。优选地，第一核酸分子 编码包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成、 或由该氨基酸序列组成的多肽并且第二核酸分子编码包包含SEQ ID NO:8 所示的氨基酸序列或基本上由该氨基酸序列组成、或由该氨基酸序列组成 的多肽。
在天然环境(例如HPV-16或HPV-18基因组)中，编码El的序列的3' 部分与编码E2的序列的5'部分重叠59个核苷酸。预计这59个100%同源 核苷酸的存在不利地影响同时表达编码El和E2的核酸分子的载体的稳定 性。同源重组可以在这些共同部分之间发生并且导致共同部分之间所含有 的核苷酸序列丢失。
根据本发明，在编码El和E2的核酸分子中存在于修饰之前的59核苷 酸重叠部分之间的100%同源性可以通过在所述核酸分子之一中简化密码 子使用模式而减低至小于75%。简并的序列的代表性实例在SEQ ID NO:9 中给出，其中在重叠59个核苷酸的El/E2内的同源性减低至69% (如
图1 中所示)并且编码HPV-16 El禾Q E2多肽的本发明优选载体包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。相同策略可以适用于HPV-18编码El和E2的序 列中存在的重叠部分。可以在编码E1的第一核酸分子中导入此类简并的序 列以替换天然重叠的59个核苷酸(例如分别是SEQIDNO:10和11)。
因此，本发明的优选载体包含第一核酸分子，其中所述第一核酸分子 包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列(其编码SEQ ID NO:5的HPV-16 El 多肽)或基本上由该核苷酸序列组成、或由该核苷酸序列组成；和第二核酸 分子，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列(其编 码SEQ IDNO:7的HPV-16 E2多肽)或基本上由该核苷酸序列组成、或由该 核苷酸序列组成。因此，本发明的另一个优选载体包含第一核酸分子，其 中所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:l 1所示的核苷酸序列(其编码SEQ ID NO:6的HPV-18 El多肽)或基本上由该核苷酸序列组成、或由该核苷酸序列组成；和第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含SEQIDNO:13所示 的核苷酸序列(其编码SEQ ID NO:8的HPV-18 E2多肽)或基本上由该核苷 酸序列组成、或由该核苷酸序列组成。更优选地，本发明的载体是MVA 载体，第一(编码El的)核酸分子置于痘苗病毒7.5K启动子的控制下并且第 二(编码E2的)核酸分子在痘苗病毒H5R启动子的控制下，并且第一和第二 核酸分子均插入所述MVA载体的缺失III中。
本发明也涉及载体，其中所述载体包含编码HPV-16E1多肽的第一核 酸分子、编码HPV-16E2多肽的第二核酸分子、编码HPV-18E1多肽的第 三核酸分子和编码HPV-18E2多肽的第四核酸分子，其中所述第一、第二、 第三和第四核酸分子不包含显示75%或大于75%同源性百分比的40个或更 多个连续核苷酸的部分。优选地，所述HPV-16E1多肽包含SEQIDNO:5 所示的氨基酸序列，所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸 序列，所述HPV-18 El多肽包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列和/或所述 HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在天然环境中，编码HPV-16和HPV-18 El的序列包含显示80%或大 于80%同源性百分比的40个或更多个连续核苷酸的几个部分。对于编码 HPV-16和HPV-18 E2的序列而言也是如此。此外，毗邻的编码El和E2 的序列在HPV-16和HPV-18基因组中的一个大约59核苷酸的部分内重叠。 在这种情况下，建议修饰编码的HPV-18 El和E2的核酸分子的序列，从 而减低与其HPV-16对应物的同源性至小于75%，尤其在两种血清型共有 的同源部分中。为此目的，可以比对HPV-16和HPV-18E1和E2基因的核 苷酸序列并且可以在核苷酸水平设计修饰旨在减低同源性至小于8、 7、 6 或优选5个连续核苷酸。另外，可以进一步修饰HPV-18E1序列以减低与 重叠HPV-18 E2序列5'末端的59核苷酸部分的同源性至小于75%。优选地， 修饰了密码子使用，但是所述修饰在氨基酸水平不翻译，除了产生如本文 中定义的修饰之外，例如产生缺陷型酶功能的修饰。分别在SEQIDNO:ll 和SEQ ID NO:13中给出可以适宜地用作第三和第四核酸分子的编码 HPV-18E1-和HPV-18E1的"简并"核苷酸序列的代表性实例。13)。本发明 的优选载体包含第一核酸分子，其中所述第一核酸分子包含SEQIDNO:10 所示的核苷酸序列(其编码SEQ ID NO:5所示的HPV-16 El多肽)或基本上 由该核苷酸序列组成、或由该核苷酸序列组成；第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID N0:12所示的核苷酸序列(其编码SEQ ID NO:7 所示的HPV-16E2多肽)或基本上由该核苷酸序列组成、或由该核苷酸序列 组成；第三核酸分子，其中所述第三核酸分子包含SEQIDNO:ll所示的核 苷酸序列(其编码SEQ ID NO:6所示的HPV-18 El多肽)或基本上由该核苷 酸序列组成、或由该核苷酸序列组成；和第四核酸分子，其中所述第四核 酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列(其编码SEQ ID NO:8所示的 HPV-18 E2多肽)或基本上由该核苷酸序列组成、或由该核苷酸序列组成。 优选地，该载体是MVA载体，第一、第二、第三和第四核酸分子导入该 MVA载体的缺失III中，第一和第三(编码E1的)核酸分子按照相反的方向 布置，各自处在痘苗病毒p7.5K启动子的控制下，并且第二和第四(编码E2 的)核酸分子按照相反的方向布置，各自处在痘苗病毒pH5R启动子的控制 下。
在另一个特别优选的实施方案中，至少第一核酸分子和第二核酸分子 编码从同一种HPV血清型(例如密切相关的HPV血清型如HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和/或HPV-52获得的两种不同的乳头状瘤病毒多肽。
在该实施方案的第一方面，从密切相关的生物体获得的同一种多肽优 选地是E2多肽。编码的E2多肽优选地被修饰，从而是膜锚定的并且对于 病毒复制无效，如本文中定义。在天然环境中，多种基因型的编码E2的序 列在核苷酸水平显示高度同源性，尤其在最保守的区域中。预计这些同源 序列的存在不利地影响共表达两种或多种(例如3、 4种或甚至更多种)E2基 因(例如来自HRHPV(如HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和HPV-52)的E2基因) 的载体的稳定性。同源重组可以在这些共同部分之间发生并且导致共同部 分之间所含有的核苷酸序列丢失，并且因此导致基因沉默。
根据本发明，在本发明载体中包含的编码E2多肽的核酸分子可以通过 简化密码子使用模式进行修饰，从而减低同源性至小于75%，尤其在高度 同源的部分中。在SSEQIDNO:13、 66、 67、 68和69中给出编码E2多肽 的简并核酸分子的代表性实例。更具体地，SEQIDNO:13编码膜呈递和复 制缺陷型的HPV-18 E2多肽，其中所述多肽的核苷酸序列己经如此设计， 从而减低与其编码E2的对应物的同源性至小于8或7个连续核苷酸。SEQ ID NO:66和67均编码复制缺陷型HPV-33 E2多肽(它在SEQ ID NO:67中 还是膜呈递的)，其中所述多肽的核苷酸序列已经如此设计，从而减低与编码E2的其余对应物的同源性至小于8或7个连续核苷酸。SEQ ID NO:68 和69均编码复制缺陷型HPV-52 E2多肽(它在SEQ ID NO:69中还是膜呈递 的)，其中所述多肽的核苷酸序列已经如此设计，从而减低与编码E2的其 余对应物的同源性至小于8或7个连续核苷酸。然而，本发明不限于这些 示例性序列并且可以基于这个原则设计编码如上文定义的E2乳头状瘤病 毒多肽的简并核酸分子的备选形式。
本发明的优选载体包含编码如本文中定义的HPV-16 E2多肽(例如包含 SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的膜呈递和复制缺陷型的E2多肽)的第一核 酸分子；编码如本文中定义的HPV-18 E2多肽(例如包含SEQIDNO:8所示 氨基酸序列的膜呈递和复制缺陷型的E2多肽)的第二核酸分子；编码如本 文中定义的HPV-33 E2多肽(例如包含SEQ ID NO:70所示氨基酸序列的膜 呈递和复制缺陷型的E2多肽)的第三核酸分子；编码如本文中定义的 HPV-52 E2多肽(例如包含SEQ ID NO:71所示氨基酸序列的膜呈递和复制 缺陷型的E2多肽)的第四核酸分子。更优选地，第一核酸分子包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列或基本上由该核苷酸序列组成；第二核酸分子包 含SEQ IDNO:13所示的核苷酸序列或基本上由该核苷酸序列组成；第三核 酸分子包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列或基本上由该核苷酸序列组 成；和/或第四核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列或基本上由 该核苷酸序列组成。更优选地，本发明的载体是MVA载体并且编码E2的 第四核酸分子插入缺失ni中。甚至更优选地，第一和第二核酸分子处在痘 苗病毒H5R启动子的控制下并且置于彼此倒置的方向上，而第三和第四核 酸分子处在痘苗病毒p7.5K启动子的控制下并且置于彼此倒置的方向上。
在该实施方案的另一个方面，从密切相关的生物体获得的同一种多肽 优选地是E6多肽、E7多肽或E6和E7多肽。E6和E7可以独立地表达或 表达为融合多肽。编码的E2多肽优选地被修饰，从而是膜锚定和非致瘤的， 如本文中定义。
在天然环境中，HPV-16和HPV-18的天然E6序列在核苷酸水平具有 63%的同源性而HPV-16和HPV-18的天然E7序列彼此57%同源。然而， 在两种情况下，HPV-16和HPV-18天然序列共享了显示80%或大于80°/。同 源性的40个或更多个连续核苷酸的几个部分(见图2)。预计这些同源序列 的存在不利地影响共表达HPV-16和HPV-18 E6和/或E7基因的载体的稳定性。同源重组可以在这些同源部分之间发生并且导致同源部分之间所含 有的核苷酸序列丢失，并且因此导致基因沉默。
根据本发明，HPV-16禾n/或HPV-18 E6和E7多肽的核酸分子可以通过 简化密码子使用模式进行修饰，从而减低同源性至小于75%，尤其在同源 部分中。在SEQ ID NO:14中给出编码HPV-18 E6多肽的简并核酸分子的 代表性实例并且在SEQ ID NO:15中给出编码HPV-18 E7多肽的简并的修 饰核酸分子的代表性实例。更具体地，已经如此设计SEQIDNO:14和SEQ IDNO:15，从而减低与HPV-16对应物的同源性至小于8、 7、 6个或优选5 个连续核苷酸，同时编码HPV-18的膜锚定和非致瘤性E6和E7多肽。然 而，可以基于这个原则设计编码如上文定义的E6和/或E7乳头状瘤病毒多 肽的简并核酸分子的备选形式。
本发明的优选载体包含编码如本文中定义的(例如膜锚定的和非致瘤 性)HPV-16 E6多肽的第一核酸分子和编码如本文中定义的(例如膜锚定的 和非致瘤性)HPV-18 E6多肽的第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含 SEQIDNO:14所示的核苷酸序列或基本上由该核苷酸序列组成。本发明的 优选载体包含编码如本文中定义的(例如膜锚定的和非致瘤性)HPV-16 E6
多肽的第一核酸分子和编码如本文中定义的(例如膜锚定的和非致瘤 性)HPV-18 E6多肽的第二核酸分子，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列或基本上由该核苷酸序列组成。更优选地，本发 明的载体是MVA载体，第一核酸分子置于痘苗病毒7.5K启动子的控制下 并且第二核酸分子在痘苗病毒H5R启动子的控制下，并且第一和第二核酸 分子均插入所述MVA载体的缺失III中。
本发明也涉及载体，所述载体包含编码HPV-16 E6多肽与HPV-16 E7 多肽的融合物的第一核酸分子和编码HPV-18 E6多肽与HPV-18 E7多肽的 融合物的第二核酸分子，其中所述第一和第二核酸分子不包含显示大约 75%或大于75%的同源性百分比的40个或更多个连续核苷酸的部分。
本发明也涉及载体，其中所述载体包含编码HPV-16 E6多肽的第一核 酸分子、编码HPV-18E6多肽的第二核酸分子、编码HPV-16E7多肽的第 三核酸分子和编码HPV-18E7多肽的第四核酸分子，其中所述第一、第二、 第三和第四核酸分子不包含显示75%或大于75%同源性百分比的40个或更 多个连续核苷酸的部分。优选地，第二核酸分子包含SEQIDNO:14或基本
28上由SEQIDNO:14组成、或由SEQ ID NO:14组成和/或第四核酸分子包含 SEQIDNO:15或基本上由SEQIDNO:15组成、或由SEQIDNO:15组成。 更优选地，本发明的载体是MVA载体，第一和第二核酸分子各自以倒置 方向置于痘苗病毒7.5K启动子的控制下并且第三和第四核酸分子各自以倒 置方向置于痘苗病毒H5R启动子的控制下，并且所述第一、第二、第三和 第四核酸分子插入所述MVA载体的缺失III中。
在另一个方面，本发明还提供一种基本上分离的核酸分子，其包含在 任意的SEQIDNO:9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 66、 67、 68或69所示的 核苷酸序列、基本上由所述核苷酸序列组成或由所述核苷酸序列组成。
在本发明的另一个实施方案中，本发明载体中所包含的第一和第二和 (若存在)第三和第四核酸分子处于适合在宿主细胞或对象表达所编码多肽 的形式，这意指将它们置于对其表达必需的调节序列的控制下。
如本文中所用，术语"调节序列"指允许、有助于或调节给定宿主细胞 中核酸分子表达(包括该核酸或其衍生物之一(例如mRNA)的复制、重复、 转录、剪接、翻译、稳定性和/或运输至此宿主细胞)的任意序列。在本发明 的上下文中，调节序列与待表达的核酸分子"有效连接"，例如它们处于允 许在宿主细胞或对象内表达的一种功能性联系中。此类调节序列是本领域 熟失口(见例如Goeddel, 1990，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego)。本领域技术人员应当理解， 调节序列的设计可能取决于这类因素，如载体类型、宿主细胞、想要的表 达水平等。
启动子是特别重要的并且本发明包括了指导核酸分子在多种类型宿主 细胞中表达的组成型启动子和指导仅在某些宿主细胞中(例如组织特异性 调节序列)或应答于特定事件或外源因素时(例如因温度、营养添加物、激素 或其他配体)表达的那些启动子的用途。用于真核系统中组成型表达的合适 启动子包括病毒启动子，如SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动 子或增强子(Boshart等人，1985， Cell 41, 521-530)、腺病毒早期和晚期启动 子、单纯疱疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)启动子和逆转录病毒长末端重 复序列(例如MoMuLV和罗氏肉瘤病毒(RSV) LTR)以及细胞的启动子如 磷酸甘油激酶(PGK)启动子(Hitzeman等人，1983， Science 219, 620-625; Adra 等人，1987,Gene 60， 65-74)。用于驱动痘病毒载体中核酸分子表达的合适启动子包括痘苗病毒的7.5K、 H5R、 TK、 p28、 pll或KlL启动子。备选 地，可以使用人造启动子如Chakrabarti等人(1997， Bio技术s 23, 1094-1097)， Hammond等人(1997, J. Virological Methods 66， 135國138)和Kumar和Boyle (1990， Virology 179， 151-158)中描述的那些人造启动子以及早期与晚期痘 病毒启动子之间的嵌合启动子。
诱导型启动子受外源性供应的化合物调节，并且包括，不限于锌诱导 型金属硫蛋白(MT)启动子(Mc Ivor等人，1987， Mol. Cell Biol. 7, 838-848)、 地塞米松(Dex;)-诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(:MMTV)启动子、T7聚合酶启动 子系统(WO 98/10088)、蜕皮激素昆虫启动子(No等人，1996， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93， 3346-3351)，四环素抑制型启动子(Gossen等人，1992， Proc. Natl.Acad. Sci. USA 89, 5547-5551)\四环素诱导型启动子(Kim等人，1995， J. Virol. 69, 2565-2573)、RU486诱导型启动子(Wang等人，1997, Nat. Biotech. 15， 239-243和Wang等人，1997，Gene Ther. 4, 432-441)、雷帕霉素诱导型启 动子(Magari等人，1997， J. Clin. Invest 100, 2865-2872)和来自大肠杆菌的 lac、 TRP和TAC启动子。在本发明上下文中使用的调节序列也可以是组织 特异性的，以驱动核酸分子在需要治疗益处的特定组织中表达。合适的启 动子可以取自肿瘤细胞中偏好性表达的基因。此类基因可以通过展示和比 较基因组杂交法鉴定(见例如US 5,759,776和5,776,683)。
本领域技术人员将认识到，控制本发明载体中所包含的核酸分子表达 的调节元件还可以包含用于宿主细胞或对象中正确起始、调节和/或终止转 录(例如聚腺苷酸转录中止序列)、mRNA运输(例如核定位信号序列)，加工 (例如剪接信号)、稳定性(例如内含子和非编码性5'和3'序列)和翻译(例如三 重体前导序列、核糖体结合位点、Shine-Dalgamo序列等)的额外元件。
在另一个方面，本发明提供包含上述载体的感染性病毒粒子。这里将 不试图详细地描述已知用于产生感染性病毒粒子的多种方法。 一般，此类 病毒粒子通过如此方法产生，所述方法包括步骤(a)在适宜的细胞系中导入 病毒载体，(b)在合适的条件下培养该细胞系，从而允许产生所述感染性病 毒粒子，从所述细胞系的培养中回收产生的感染性病毒粒子并且任选地纯 化所述回收的感染性病毒粒子。
当病毒载体具有缺陷性时， 一般通过使用辅助病毒在互补细胞系中产 生感染性颗粒，其中所述辅助病毒以反式方式提供无功能的病毒基因。例如，用于弥补缺失E1的腺病毒载体的合适细胞系包括293细胞(Graham等 人，1997， J. Gen. Virol. 36， 59-72)，、 PER-C6细胞(Fallaux等人，1998, Human Gene Ther. 9, 1909-1917)和HER96细胞。适于增殖痘病毒载体的细胞是禽 细胞，并且最优选地是从鸡胚制备的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，其中所述 鸡胚从受精卵获得。生产者细胞可以在常规发酵反应器、烧瓶和培养皿中， 在适宜的温度、pH和氧含量条件下培养。
感染性病毒粒子可以从培养上清液或从裂解后的细胞回收。它们可以 根据标准技术(如在例如W096/27677、 W098歸24、 W098/22588 、 WO98/26048、 WO00/40702、 EP1016700和WO00/50573中描述的层析、超 离)进一步纯化。
在另一个方面，本发明提供包含上述核酸分子、载体或感染性病毒粒 子的宿主细胞。如本文中所用的术语"宿主细胞"定义了可以或已经是本发 明载体或感染性病毒粒子的受者的任意细胞和此类细胞的子代。该术语应 当广义地理解，从而包括分离的细胞， 一组细胞以及细胞的特定组织形式， 例如在组织或器官中。此类细胞可以是原代、转化的或培养的细胞。
本发明上下文中的宿主细胞包括原核细胞(例如大肠杆菌、芽孢杆菌 属、李斯特菌属)、低等真核细胞如酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和其他真核细胞如昆虫细胞、植物和高等真核细胞，特别优选哺乳 动物细胞(例如人或非人细胞)。合适宿主细胞的代表性实例包括，但不限于 BHK(乳仓鼠肾)细胞、MDCK细胞(Madin-Darby犬肾细胞系)、CRFK细胞 (Cmndell猫肾细胞系)、CV-I细胞(非洲猴肾细胞系)、COS (例如COS-7)细 胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠NIH/3T3细胞、HeLa细胞和Vero细 胞。术语"宿主细胞"也包括能够弥补本发明复制缺陷型载体(例如腺病毒载 体)的至少一个缺损功能的互补细胞，如上文所提及的那些细胞。
宿主细胞可以用于通过重组手段产生由本发明的载体或感染性颗粒中 所包含核酸分子编码的多肽。此类技术是本领域熟知(见例如Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley, 1987画2002;禾口 Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual最新版,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
在另一个方面，本发明提供包含上述核酸分子、载体、感染性病毒粒子或宿主细胞(如本文也称作"活性物质")或其任意组合的组合物。有利地， 该组合物是包含治疗有效量的活性物质和可药用介质的药物组合物。
如本文中所用的术语"可药用介质"意图包括与药物施用兼容的任意和 全部的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、分散介质、包衣剂、抗菌剂和抗真 菌剂和吸收延迟剂等。如本文中所用，"治疗有效量"是足以减缓通常与对 象中想要治疗或预防的病理状况关联的一种或多种症状的剂量。当涉及预 防性用途时，该术语意指足以预防或延迟对象中建立病理状况的剂量。例 如，治疗有效量可以是足以在治疗的对象中诱导或增强受免疫应答的那个 量或是足以减轻、改进、稳定、逆转、延缓或延迟病理状况进展(例如对象 中损害或肿瘤的尺寸縮小或退化损害，感染的对象中病毒感染的逆转)的那
希望地，本发明的组合物包含在所用的剂量和浓度上无毒的一种或多 个载体和/或稀释剂。此类载体和/或稀释剂优选地选自通常用来配制处于全 身性或粘膜施用的单位剂量或多剂量形式的组合物的那些载体和/或稀释 剂。合适载体可以溶剂、含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、 液体聚乙二醇等)的分散介质、植物油或其合适的混合物。稀释剂优选地是 等渗的、低渗的或略微高渗的，并且具有相对低的离子强度。合适稀释剂
的代表性实例包括无菌水、生理盐水(例如氯化钠)、Ringer's溶液、葡萄糖、 海藻糖或蔗糖溶液、Hank's溶液和其他生理平衡盐水溶液(见例如最新版 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro， Lippincott, Williams&Wilkins)。适当地调节并缓冲本发明组合物的pH，旨在适合用在 人或动物中，优选地在生理性或略微碱性的pH (在大约pH 7.5至大约pH 9 之间，特别优选大约8或8.5的pH)。合适的缓冲液包括磷酸盐缓冲液(例 如PBS)、碳酸氢钠缓冲液和/或Tris缓冲液。
本发明的组合物可以处于多种形式，例如冷冻的、固体(例如干燥粉碎 的或冻干形式)或液体(例如含水的)。活性物质外加任意额外所需成分的固 体组合物可以从经受真空干燥和冷冻干燥的其先前经无菌过滤的溶液获 得。根据需要，它可以贮存在通过使用前添加合适媒介物而立即重构的无 菌安瓿中。
特别优选的组合物(尤其当活性物质是腺病毒载体)在lM蔗糖、150mM NaCl、 ImM MgCl2、 54 mg/1 Tween 80、 10 mM Tris， pH 8.5中配制。另一种优选的组合物在10 mg/ml甘露醇、1 mg/ml HSA、 20 mM Tris、 pH 7.2 和150mMNaCl中配制。此类制剂特别适合在至少2个月时间范围内在冷 冻(例如-70。C、 -40°C、 -20。(:)或冷藏(例如4。C)温度保护本发明组合物的稳定性。
该组合物也可以含有一种或多种可药用赋形剂用于提供希望的药用属 性或药代动力学属性，例如包括调节或维持pH、渗透性、黏性、透明度、 颜色、无菌性、稳定性、释放至或吸收进入人或动物对象。稳定组分的代 表性实例包括聚山梨酯80、 L-精氨酸、聚乙烯吡咯垸酮、海藻糖和可以用 来获得溶解度、稳定性和半寿期的希望属性的聚合物如聚乙二醇(Davis等 人，1978, Enzyme Eng. 4, 169-173; Burnham等人，1994, Am. J. Hosp. Pharm. 51,210-218)。增稠剂包括羧甲基纤维素钠、山梨醇和葡聚糖。该组合物也 可以含有本领域已知促进穿透或跨粘膜屏障或在特定器官种运输的物质。 例如，适用于阴道施用的组合物可以逐步地包含用来增加粘膜孔径的一种 或多种吸收增强剂。
另外，本发明的组合物包含适合给人类全身性或粘膜性施用的一种或 多种佐剂。术语"佐剂"指这样的化合物，其具有增强针对特定抗原的免疫 应答的能力。佐剂可以被送递至抗原部位处或其附近。体液免疫的增强一 般由针对该抗原所产生的抗体的滴度显著提高(通常大于IO倍)表现。细胞 免疫的增可以通过阳性皮肤试验、细胞毒T细胞测定、IFNY或IL-2的 ELIspot测定法测量。优选地，在本发明中施用的佐剂能够刺激针对活性物 质的免疫，尤其通过toll样受体(TLR)如TLR國7、 TLR國8禾tl TLR-9。有用佐 剂的代表性实例包括，不限于铝胶、矿物油乳液如弗氏完全佐剂和不完全 佐剂(IFA)、脂多糖或其衍生物(Ribi等人，1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY， p407漏19)、皂武如QS21 (Sumino等人，1998, J.Virol. 72, 4931-9; WO 98/56415)、咪唑喹啉化合物如咪喹莫特(Suader, 2000， J. Am Acad Dermatol. 43， S6-S11)、 m-咪唑并(4， 5-c)奎诺酮-4-胺衍生物(AldaraTM)和相关化合物 (Smorlesi, 2005，Gene Ther. 12, 1324-32)、胞嘧啶磷酸鸟苷寡脱氧核苷酸如 CpG (Chu等人，1997， J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel等人，2003， J. Immunol. 171 : 2358-2547)和阳离子肽如IC-31(Kritsch等人，2005， J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-70)。本发明的核酸分子，载体，感染性颗粒或组合物可以通过多种施用模 式施用，包括全身、局部和粘膜施用。全身施用可以通过任意方式进行， 例如通过皮下、皮内、肌内、静脉内、腹膜内、血管内、动脉内注射。注 射可以用常规注射器或注射针或本领域可获得的任何其他装置进行。粘膜 施用可以通过口腔、鼻、呼吸道内、肺内、阴道内或肛门内途径进行。局 部施用可以使用经皮肤手段(例如贴剂等)进行。特别优选用病毒载体和感染 性颗粒作为活性物质的肌内或皮下施用。
适宜剂量可以根据已知因素变动，如具体活性物质的药代动力学特征、 年龄、健康和待治疗的对象的重量、待治疗的病理状况、症状的特征和范 围、同时治疗的种类、治疗的频率、预防或治疗的需求和/或所需的作用。 剂量还将根据所选的具体施用途径计算。对确定适宜治疗剂量必需的计算 的进一步修正由开业医生在相关环境影响下常规地进行。就一般指导而言，
腺病毒粒子的合适剂量是从约105至约1013iu (感染单位)，希望是从约107 至约1012iu并且优选地从约108至约10"iu。痘苗病毒粒子的合适剂量是从 约104至约10^pflj(蚀斑形成单位)，希望是从约105至约109pfo并且优选地 从约106至约5xl08pfti。载体质粒可以在10吗与20 mg之间并且优选在 100吗与2mg之间的剂量上施用。另外，施用可以根据标准方法、剂量或 方案，在几小时、几日和/或几周范围内以单个剂量或备选地以多个剂量进 行。此外，施用可以通过大丸剂注射或连续输注方式进行。例如，对象可 以用上述核酸分子、载体、感染性颗粒或组合物的至少2次(例如从2次至 IO次)施用进行治疗。优选地，第一系列施用在从几日至4周的时间段内依 次地实施，随后在1至6个月范围内实施第一系列施用(例如1或2次施用)， 随后是所述第一系列的最后施用。第二系列的每次施用之间的时间段可以 是从几日至4周。在优选的实施方案中，第一系列施用包括以周间隔的三 次依次施用并且第二系列施用包括在4至6个月内的一次施用，随后是所 述第一系列。作为一般指导，对于MVA载体，优选的施用途径是以包含 于106与5x 106pfo之间的MVA颗粒/粒子剂量的皮下方式。
本发明的核酸分子、载体、感染性颗粒、宿主细胞或组合物可以导入 对象中，以治疗或预防多种病理状况，包括遗传疾病、先天疾病和获得性 疾病。本发明也涉及本发明核酸分子、载体、感染性颗粒、宿主细胞或组 合物用于制备用于治疗或预防此类病理状况的药物的用途。它特别适宜于
34治疗或预防感染性疾病(例如病毒性和/或细菌性感染)、癌症和免疫缺陷 病。如本文中所用的术语"癌症"包括因不想要的细胞增殖所致的任意癌变 状况，包括弥散或局限性肿瘤、转移、癌变息肉和肿瘤前损伤(例如瘤形成)。 在本发明上下文中构思的感染性疾病包括与如上所述致病微生物感染 相关的任意病况。在本发明上下文中构思的癌症包括，而不限于恶性胶质 瘤、肉瘤、黑素瘤、肥大细胞瘤、癌以及乳腺癌、前列腺癌、睾丸癌、卵 巢癌、子宫内膜癌、子宫颈癌(尤其与乳头状瘤病毒感染相关的那些子宫颈 癌)、肺癌(例如包括巨细胞、小细胞、鳞状细胞和腺癌)、肾癌、膀胱癌、
肝癌、结肠癌、肛癌、胰腺癌、胃癌、胃肠癌、口腔癌、喉癌、脑和CNS 癌、皮肤癌(例如黑素瘤和非黑素瘤)、血癌(淋巴瘤、白血病，尤其当它们 在实体组织中发育时)、骨癌、视网膜母细胞瘤和甲状腺癌。
在优选的实施方案中，本发明用于预防性或治疗性治疗与乳头状瘤病 毒(尤其HRHPV)感染相关的病况，如持续性感染、恶变前和恶性病变。"持 续性感染"指在没有实现病毒根除的感染对象中乳头状瘤病毒感染的无症 状期。 一般观察不到临床体征。恶变前损害的实例包括，不限于可以在多 种组织中检测到的低度、中度或高度的上皮内瘤形成如CIN(颈部上皮内瘤 形成)、外阴上皮内瘤形成(VIN)、肛门上皮内瘤形成(AIN)、阴茎上皮内瘤 形成(PIN)和阴道上皮内瘤形成(ValN)。恶性病变的实例包括，不限于子宫 颈癌、肛门癌、阴道癌、阴茎癌和口腔癌。编码乳头状瘤病毒多肽的本发 明核酸分子、载体、感染性颗粒、宿主细胞或组合物特别定义用于治疗恶 变前损害、尤其CIN2/3损害或恶性病变，尤其子宫颈癌。在另一个实施方 案中，本发明也可以用于预防性或治疗性治疗与肝炎病毒(例如HBV或 HCV)感染相关的病况，如持续性感染、慢性或fblgurant hepatitis和肝癌。
活性物质可以单独施用或根据需要与常规治疗用药程式(例如放疗、化 疗和/或手术)结合使用。使用标准药物、剂量和治疗法，根据标准方法送递 常规治疗用药程式至动物或人对象中，并且此类用药程式可以在施用本发 明活性物质之前、期间和/或之后进行。例如，为处理与相关HCV感染的 病况，本发明的方法或用途优选地与例如蛋白酶抑制剂(例如丝氨酸蛋白酶 抑制剂如Vertex公司的VX950)、聚合酶抑制剂、解螺旋酶抑制剂、抗纤维 变性药、核苷类似物、TLR激动剂、siRNA、反义寡核苷酸、抗HCV抗体、 免疫调节剂、治疗性疫苗和在治疗HCV相关性肝癌(例如通常通过肝动脉
35中化学栓塞法施用的阿霉素或阿霉素碘油与动物胶的混合物)中常规使用
的抗肿瘤药联合。 一个特别合适的组合包括用PEG化的IFN-a (IFN-a2a或 IFN-(x2b)和/或利巴韦林治疗，优选地持续24至48周，此后施用本发明的 活性物质。为治疗与乳头状瘤病毒感染相关的病况，本发明的方法或用途 可以与烧蚀术如电圈切除术联合。本发明的方法或用途也可以与免疫刺激 物如细胞因子(例如IL-2、 IL-7、 IL画15、 IL-18、 IL画21、 IFNg)或自杀基因产 物(例如在Caruso等人，1993， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90， 7024-28中描述 的HSV-1胸苷激酶；在WO 99/54481中描述的FCU-I )或表达此类多肽的 载体联合实施。
在另一个实施方案中，本发明的方法或用途根据包括依次施用激发组 合物和增强组合物的激发/增强治疗用药程式实施。 一般，激发性和增强组 合物使用包含或编码至少一个共同抗原结构域的不同媒介物。本发明的方 法或用途可以包括施用激发性组合物1至10次，随后施用增强性组合物1 至10次。希望是，注射间隔期是l日至12个月。优选的用药程式包括独 立地依次施用激发物3或4次，由3至10日(例如1周)的间隔时间分隔， 随后在终末施用激发物后1至几周施用增强物1或2次。另外，激发性和 增强性组合物可以在相同部位或在备选部位通过相同施用途径或通过不同 施用途径施用。例如，可以通过粘膜途径施用基于多肽的组合物，而优选 地注射基于载体的组合物，例如皮下注射MVA载体、肌内注射DNA质粒 和腺病毒载体。本发明的载体、感染性颗粒或组合物可以用来激发或增强 或激发并增强治疗的对象的免疫应答。在一个实施方案中，用本发明的质 粒载体进行激发并且用本发明的痘苗病毒感染性颗粒增强。在另一个实施 方案中，用本发明的腺病毒感染性颗粒进行激发并且用本发明的痘苗病毒 感染性颗粒增强。仍在另一个实施方案中，用本发明的痘苗病毒感染性颗 粒进行激发并且用本发明的腺病毒感染性颗粒增强。
本发明已经以说明性方式进行描述，并且应当理解已经使用的术语意 图本质上是描述性而非限制性的。显然，本发明的众多修改和变体在上述 教授内容的影响下是可能的。因此应当理解在所附权利要求书的范围内， 本发明可以按照不同于本文具体所描述的方式实施。
以上所提及的专利、出版物和数据库条目的全部公开内容出版物特别 地通过引用方式以相同程度完整并入本文，如同专门且个别地说明通过引用方式并入每份这种单独的专利、出版物和条目。 附图简述
图1说明(A)存在于天然HPV-16 El序列末尾的59个核苷酸(a)与存在 于天然HPV-16 E2序列开始处的59个核苷酸(b)之间的序列比对结果以及 (B)存在于天然HPV-16 El序列末尾或天然HPV-16 E2序列开始处的59个 核苷酸(a)与SEQ ID NO:9 (b)之间的序列比对结果。
图2说明(A)在HPV-16与HPV-18 E6-编码序列之间和(B)在HPV-16 E6-编码序列与SEQ IDNO:14之间的序列比对/比对结果。
以下实施例起到说明本发明的作用。
实施例
下文所述的构建根据详述于Maniatis等人(19S9， Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY)中的一般基因 工程技分子克隆技术或当使用试剂盒时根据制造商推荐实施。PCR扩增技 术是本领域技术人员已知的(见例如1990年Academic Press出版社Innis、 Gelfand、 Sninsky和White出版的《PCR方案-方法和应用指南》(PCR protocols-A guide to methods and applications))。携带氨节青霉素抗性基因的 重组质粒在补充有100 pg/ml抗生素的琼脂或液体培养基上的大肠杆菌 C600 (Stratagene)、 BJ5183 (Hanahan, 1983， J. Mol. Biol. 166， 557-580)和 NM522中复制。重组痘苗病毒的构建根据以上所提及文献和Mackett等人 (1982, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 79， 7415國7419)和Mackett等人(1984, J. Virol. 49， 857-864)中所属领域内的常规技术进行。使用大肠杆菌的选择基 因gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)(Falkner和Moss, 1988， J. Virol. 62, 1849-1854)来促进重组痘苗病毒的选择。
实施例1:构建表达HPV-16 El和E2基因(MVATG17410)的MVA载体 a)构建编码HPV-16 E2基因的重组MVA载体(MVATG 17408) 克隆HPV16E2基因
从分离自CaSki细胞(ATCC CRL-1550)的基因组DNA中克隆编码 HPV-16 E2的核苷酸序列。使用引物OTG16809 (SEQ ID NO:16)和OTG16810(SEQIDNO:17)扩增E2基因。所得片段由BamHI和EcoRI消 化并插入由相同酶限制性处理过的pGEX2T(Amersham Biosciences),产生 pTG17239。对克隆的E2基因测序显示与(GenbankNC-01526中描述的)HPV 16 E2原型序列相比，存在5个突变。两个突变是沉默的，并且使用 QuickChange位点定向诱变诱变(Stratagene)校正三个非沉默突变(T2101, S219P, K310T)，产生pTG 17268。 修饰HPV-16E2多肽
并入pTG 17268的E2核苷酸序列通过位点定向诱变法修饰，旨在产生 名为edE2f的HPV-16 E2变体(E39A和173A)。更具体的，通过将位置39 中的Glu残基置换为Ala来取消E2的复制功能，并且通过将位置73中的 He残基置换为Ala来取消其反式激活功能。所得质粒pTG17318包含编码 :^^-16￡2*的修饰的序列。
HPV-16 E2f通过在氨基端融合于信号肽并且在羧基融合于衍生自狂犬 病病毒(PG株；Genbank ay009097)糖蛋白的膜锚定序列而进一步修饰，从 而指导HPV-16 E2+在表达宿主细胞中呈递在质膜表面上。使用以下引物: OTG17500(SEQIDNO:18)、 OTG17501 (SEQ ID NO:19)、 OTG17502(SEQ ID NO:20)、 OTG17503 (SEQ ID NO:21)、 OTG17504 (SEQ ID NO:22)和 OTG17505 (SEQ IDNO:23)，通过三重PCR再装配出编码名为SS-E2*-TMR 的膜呈递的E2缺陷型变体的核苷酸序列(SEQIDNO:12)。将再装配的序列 插入pBS-衍生性载体(Stratagene)，以产生pTG17360，并随后克隆在痘苗 病毒转移质粒中e pH5R启动子下游(Rosel等，1986, J Virol. 60, 436-449)， 产生pTG17408。
设计转移质粒旨在允许通过同源重组于MVA基因组的缺失III中插入 待转移的核苷酸序列。它源自质粒pTGlE(在Braun等人，2000,Gene Ther. 7， 1447-57中描述)，其中向所述pTGlE克隆包围MVA缺失III的侧翼序列 (BRG3和BRD3)，其中所述侧翼序列通过PCR从MVATGN33.1 DNA获得 (Sutter和Moss， 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51)。该转移质粒 也含有(Lausanne大学R. Wittek友好提供的)早晚期痘苗病毒人造启动子pi 1K7.5的控制下的维多利亚水母(Aequorea victoria)增强型绿色荧光蛋白 (eGFP基因，从Clontech公司的pEGP-Cl分离)与大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷 酸核糖转移酶基因(gpt基因)之间的融合。黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的合成能够使GPT+重组MVA在含有霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养 基(Falkner等，1988, J. Virol. 62， 1849-54)中形成蚀斑并且eGFP能够使得重 组MVA蚀斑可见到。选择标记eGFP-GPT置于处于相同方向的同源序列 两个之间。当实现了克隆性选择时，在无选择作用下允许eGPP-GPZ重组 MVA生长时，通过几次传代轻易消除该选择标记。
构建表达HPV-16SS-E2、TMR基因的重组MVA
通过在感染MVATGN33.1(M010.1 pfb/细胞)并以pTG17408(根据标准 磷酸钙DNA沉淀法)转染的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组开展 MVATG 17408病毒的产生。通过在含有霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择 培养基存在下的三轮蚀斑纯化进行病毒的选择。如上所述，随后通过在非 选择培养基中传代消除选择标记。通过PCR验证不存在亲代MVA混杂。
通过蛋白质印迹法进行E2表达的分析。CEF用MOI 0.2的 MVATG17408感染并且24小时后，收获细胞。使用商业化抗E2单克隆抗 体TVG271 (Abeam)进行蛋白质印迹分析。检测到具有55 kD表观分子量的 蛋白质的表达，同时E2、TMR的理论分子量是48.9kDa。用内切糖苷酶F 处理细胞提取物后，观察到重组蛋白的大小降低，表明从MVATG17408 表达的E2* TMR多肽是N-糖基化的。
b)构建编码HPV-16E1基因的重组MVA，其中所述HPV-16 El基因在与 HPV-16E2基因(MVATG 17409)交叠的部分中是简并的
从CaSki细胞DNA(ATCC CRL-1550)克隆了编码HPV-16 El多肽的核 苷酸序列。更具体地，El基因分EIa(nt 1-1102)和EIb(nt 1001 to 1950)两个 部分扩增。使用引物OTG16811 (SEQ ID NO:24)和OTG 16814 (SEQ ID NO:25)来扩增EIa片段，其中所述Ela片段由BamHI和EcoRI消化并插入 由相同酶限制性处理的pGEX2T，产生pTG17240。使用OTG16813 (SEQ ID NO:26)和OTG 16812 (SEQ ID NO:27)产生Elb片段，并由Bamffl和EcoRI 消化，随后插入pGEX2T,产生pTG 17241。与(GenbankNC-01526中描述 的)HPV 16 El原型序列相比，测序显示存在4个突变。 一个突变是沉默的， 并且三个存在于Ela中的非沉默突变(K130Q， N185T和T220S)由位点定向 诱变诱变法校正。随后通过克隆在BsrGI和EcoRI消化的pTG 17241中的 己校正Ela片段而重新装配出完整的El基因。所得的质粒命名为 pTG17289。在HPV-16基因组中，El基因的最后59个核苷酸与E2基因的头59 个核苷酸相同。为了在编码El和E2的MVA载体的生产步骤期间规避不 稳定性问题，通过密码子使用修饰法修饰E1编码序列的这个部分，从而减 低与E2编码序列的序列同源性。使用简并引物OTG17408 (SEQ IDNO:28) 和OTG17409 (SEQ ID NO:29)，通过扩增El基因的3'末端获得简并序列 (SEQ ID NO:9)。所得扩增片段由Nsil和BglII消化并插入由相同酶限制性 处理过的pTG 17289，产生pTG17340。
HPV-16简并El序列也借助位点定向诱变法突变，通过将HPV-16 El 的位置482中的Gly残基置换为Asp残基(G482D，本文中又命名为El*)， 旨在消除所编码E1多肽的复制功能，从而产生pTG17373。
通过与衍生自狂犬病病毒(ERA分离株；在GenbankNM38452中描述) 糖蛋白的信号肽和膜锚定肽融合，还修饰了 HPV-16 degf序列，从而指导 所编码的多肽在细胞质表面表达。使用以下引物OTG 17560 (SEQ ID NO:30)、 OTG17561 (SEQ ID NO:31)、 OTG17562 (SEQ ID NO:32)、 OTG17563 (SEQ ID NO:33)、 OTG17564 (SEQ ID NO:34)和OTG17565 (SEQ IDNO:35)，通过三重PCR重构SS-Eldeg*-TMR序列(SEQ ID NO:10)。所 得的片段插入pBS-衍生的载体(Stratagene),产生pTG17404。 SS-E ldeg* -TMR序列随后克隆在痘苗病毒转移质粒中p7.5K启动子下游(Cochran等， 1985, J. Virol. 54， 30-7)，产生pTG17409。
MVATG1 7409病毒的产生通过如上所述的同源重组在CEF中进行。 c)构建编码HPV-16 El和E2基因的重组MVA载体(MVATG 17410)
从pTG1740分离已测序并受p7.5K启动子控制的SS-E ldeg* -TMR序 列并插入pTG17408，产生pTG17410。
MVATG1 7410病毒的产生通过如上所述的同源重组在CEF中进行。
实施例2:构建编码HPV-18 El和E2基因(MVATG17582)的MVA载体
将HPV-18El和E2基因重构为合成基因并且设计寡核苷酸从而(i)旨在 降低由天然HPV-16和HPV-18序列所共有的同源部分之间的同源性百分比 至小于75% (比对HPV-16和HPV-18的El和E2基因的序列并设计寡核苷 酸从而旨在减低同源性至小于5个连续核苷酸)(ii)降低在天然HPV-18 El 序列3'端和在HPV-18 E2序列5'端均存在的59个核苷酸部分之间的同源性至小于75。/。并且(ii)导入取消HPV-18 El和E2基因产物之酶功能的突变 (El : G489D， E2 : E43A和177A)。
HPV-18 degEP序列通过装配50个寡核苷酸重构并克隆在pBS载体 中，产生pTG 17473。使用引物OTG15315 (SEQ IDNO:36)、OTG17881 (SEQ ID NO:37)、 OTG17882 (SEQ ID NO:38)、 OTG17883 (SEQ ID NO:39)、 OTG17884 (SEQ ID NO:40)和OTG17885 (SEQ ID NO:41)，通过三重PCR 随后将El序列融合于来自麻疹病毒F蛋白的信号序列克隆 (SS-18Eldeg、TMF)。所得的片段(SEQ IDNO:ll)克隆在MVA转移载体中 处于p7.5K启动子的控制下，以产生pTG17521。
HPV-18 degE2"^序列通过装配26个寡核苷酸重构并克隆在pBS载体 中，产生pTG 17498。使用引物OTG17875 (SEQ ID NO:42)、OTG17876 (SEQ ID NO:43)、 OTG17877 (SEQ ID NO:44)、 OTG17878 (SEQ ID NO:45)、 OTG17879 (SEQ ID NO:46)和OTG17880 (SEQ ID NO:47)，通过三重PCR 进行与狂犬病病毒(ERA株；Genbank n。 M38452)糖蛋白的信号肽和膜锚定 肽的融合。将SS-18E2、TMR盒插入痘苗病毒转移质粒中p7H5R启动子下 游，产生pTG17552。最后，从pTG17521分离p7.5K-SS-Eldeg、TMF盒并 插入pTG17552,产生pTG17582。
重组MVATG17521、 MVATG17552和MVATG17582的产生如上所述 进行。
实施例3:构建表达HPV-16和HPV-18 El和E2基因的多价MVA载体 (MVATG 17583)
将p7.5K-SS-18Eldeg*-TMF盒和pH5R-SS-18E2*-TMR盒导入 pTG17410(含有p7.5K-SS-16Eldeg*-TMR盒和pH5R-SS-16E2、TMR)并且 将所得转移质粒命名为pTG17583。 MVATG 17583的产生如上所述进行。
实施例4:构建表达HPV16和HPV18 E6和E7基因的多价重组病毒
MVATG 16327是表达HPV-16和HPV-18 E6和E7多肽的膜锚定型和 非致瘤性变体的重组MVA病毒。将E6和E7核苷酸序列突变，旨在消除 其致瘤属性(E6f和E7*)，并且融合于编码适宜信号肽和膜锚定肽的序列 (E6*tm， E7*tm)。更具体地，HPV-18 E7^^分别在其氨基端和羧基端与麻疹病毒F糖蛋白的信号肽和膜锚定肽融合，其中HPV-16 E6*、 HPV-16 E7* 和HPV-18 ￡6*与从狂犬病病毒糖蛋白的信号肽和膜锚定肽衍生的信号肽 和膜锚定肽融合。另外，通过密码子使用修饰法进一步修饰HPV-18 E6和 E7核苷酸序列，从而减低与其HPV16对应物的同源性。为此目的，比对 天然HPV 16和HPV 18基因的序列并且进行密码子简并以减低同源性至小 于5个连续核苷酸。在该载体中，HPV-16和HPV-18 E6序列在彼此相反 的方向上均置于p7.5K启动子的控制下，其中HPV-16和HPV-18 E7序列 由H5R启动子驱动并且将全部表达盒插入MVA基因组的切除III区域。
a) 构建HPV-16E7nm表达盒
如WO99/03885中所述，从Caski细胞分离并修饰HPV-16 E7基因， 从而编码一种非致瘤性和膜呈递的E7多肽(16E7^mR)。通过缺失氨基酸残 基21-26(ADLYCYE)进行非致瘤性突变，并且通过将￡7*突变的序列分别 在其5'端和3'端与编码从狂犬病病毒(ERA株；Genbank登录号M38452)糖
蛋白克隆的信号肽和膜锚定性肽的序列融合进行膜呈递。将所得的序列克 隆处在早期晚期pH5R启动子(Rosel等，1986. J. Virol. 60， 436-9)的控制下 并将该盒导入pBS衍生的载体，产生pTG16161。
b) 克隆HPV-16E6nm和HPV-18E6hm表达盒
如WO99/03885中所述，分离并修饰HPV-16 E6基因，从而编码一种 非致瘤性和膜呈递的E6多肽。通过缺失氨基酸残基118-122(ADLYCYE) 进行非致瘤性突变，并且通过将E6+突变的序列分别在其5'端和3'端与编码 从狂犬病病毒(PG strain; Genbank登录号ay009097)糖蛋白衍生的信号肽和 膜锚定性肽的序列融合进行膜呈递。这通过在含有被一个BamHI位点隔开 的信号肽和膜锚定性肽序列的载体中插入所述E6+突变序列进行，从而产 生pTG 16097。
通过装配寡核苷酸OTGl 5174 (SEQ ID NO:48)、 OTG1 5175 (SEQ ID NO:49)、 OTG1 5176 (SEQ ID NO:50)、 OTG15177 (SEQ ID NO:51)、 OTG15178(SEQIDNO:52)、 OTG15179 (SEQ ID NO:53)、 OTG15180(SEQ IDNO:54)和OTG15181 (SEQ ID NO:55)，产生了合成性HPV-18 E6序列。
如此设计寡核苷酸，从而引起编码氨基酸残基113-117(非致瘤性突变 ANPAEK)密码子缺失并且简化密码子使用，旨在减低与HPV-16 E6基因的 同源性(简并的序列)。所得的合成性序列随后分别在其5'端和3'端与编码从
42狂犬病病毒糖蛋白基因衍生的信号肽和膜锚定性肽的序列融合以提供如
SEQ ID NO:14所示的序列，从而产生pTG16160。将HPV-16 E6*tmR和 HPV-18 degE6*tmR序列以相反方向插入，每个序列均处在p7.5K启动子的 控制下。将表达盒随后导入pTG16161以产生pTG 16215。
c) 克隆HPV-18 E7*tmF表达盒
通过过装配寡核苷酸OTG14773 (SEQ ID NO:56)、 OTG14774 (SEQ ID NO:57)、 OTG14775 (SEQ ID NO:58)、 OTG14776 (SEQ ID NO:59)、 OTG14777 (SEQ ID NO:60) and OTG14778 (SEQ ID NO:61)，产生了合成性 HPV-18 E7序列。如此设计寡核苷酸，从而引起编码氨基酸残基24-28(非 致瘤性突变ADLLCH)密码子缺失并且简化密码子使用，旨在减低与 HPV-16 E7基因的同源性(简并的序列)。所得的合成性序列随后分别在其 5'端和3'端与从麻疹病毒F蛋白基因衍生的信号肽和膜锚定性肽的编码序 列融合(在EP 0305229中描述)。将所得的序列(SEQ ID NO:15)克隆处在 pH5R启动子的控制下并将表达盒导入pBS衍生的载体以产生pTG 16015。
d) 构建转移质粒pTG 16327
转移质粒pTG6019 (其在WO99/03885的实施例2中描述)含有位于 MVA缺失III侧翼的同源序列。此质粒如下修饰。通过引物OTG 15040 (SEQ IDNO:62)和OTG15041 (SEQ ID NO:63)杂交所获得的合成性多接头被导入 由BamUl和Sad消化的pTG6019，产生pTG 16007。从(在EP 1 146 125的 实施例2中描述的)pTG14033分离含有置于早期晚期pH5R启动子控制下 的编码大肠杆菌gpt的表达盒的Sacl-Sacl片段并且导入经Sacl消化的pTG 16007，产生pTG16093。黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的合成能够使GPT+ 重组MVA在含有霉酚酸、黄嘌呤和次黄嘌呤的选择培养基(Falkner等人， 1988. J.Virol. 62, 1849-54)中形成蚀斑。选择标记GPT置于处于相同方向的 同源序列两个之间。当实现了克隆性选择时，在无选择作用下允许 eGPP-GPZ重组MVA生长时，通过几次传代轻易消除该选择标记。
从pTG16015分离含有HPV-18 degE7*TMF表达盒的HindIII-SmaI片 段并导入经相同酶消化的pTG 16093，产生pTG16105。另一方面，pTG16215 由Sail和EcoR消，用T4 DNA聚合酶处理，并且将含有HPV-16 E7*tmR、 HPV-16 E6*tmR和HPV-18 degE6*TMR表达盒的所得片段导经Smal消化 的pTG16105，产生pTG16327(图2)。e) MVATG16327的产生
通过在原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组开展MVATG16327的产 生。为此目的，在事先以MOI 0.1 pfb/细胞感染MVATGN33.1的CEF上根 据标准磷酸钙DNA沉淀法转染pTG 16327。通过在含有霉酚酸、黄嘌呤和 次黄嘌呤的选择培养基存在下，在CEF上的3轮蚀斑纯化进行病毒的选择。 随后通过在非选择培养基中传代消除选择标记。通过PCR验证不存在亲代 MVA混杂。
通过蛋白质印迹法进行基因表达的分析。CEF用MOI 0.2的 MVATG16327感染并且24小时后，收获细胞。使用分别针对HPV-16与 HPV-18 E6和E7蛋白的兔多克隆抗体，开展蛋白质印迹分析。结果显示 全部HPV多肽正确地从MVATG16327中表达。
f) 研究MVATG16327的遗传稳定性
在以MOI 10、fb/细胞和10 fb/细胞感染的CEF上将MVATG16327 传5代。对从第5代研究用原液分离的100个病毒克隆评价遗传稳定性。 使用两种方法确定表达盒的结构的PCR扩增法，和借助蛋白质印迹法的 抗原检测。PCR分析的结果显示99c/。克隆含有目的表达盒。免疫检测法显 示97%的克隆表达4种抗原HPV-16和HPV-18的E6*tm和E7*tm多肽。
这些分析表明在5次传代后，从MVATG 16327衍生的97%的克隆是 一致的，表明该构建体的良好遗传稳定性。
实施例5:构建表达HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和HPV-52E2基因的多价 MVA载体
编码HPV-33 E2多肽的合成基因由Geneart(Regensburg, Germany)合 成。如此设计该合成性序列，从而(i)减低与源自HPV-16, HPV-18和HPV-52 的E2基因的同源性百分比至小于75 %(若可能，縮小同源部分至小于6个 连续核苷酸)和(ii)导入取消HPV-33基因产物之酶功能的突变(E39A和 173 A)。
HPV-33 degE2+序列随后与编码狂犬病病毒(ERA株，Genbank n。 M38452)糖蛋白的信号肽和膜锚定性肽的核苷酸序列融合。使用引物TG1 8962 (SEQ ID NO:72)、 OTG18963 (SEQ ID NO:73)、 OTG18964 (SEQ ID NO:74)、 OTG18965 (SEQ ID NO:75)、 OTG1 8966 (SEQ ID NO:76) and OTG18967 (SEQ ID NO:77)，通过三重PCR进行该步骤。将编码 SS-33degE2*-TMR多肽的所得片段(SEQ ID NO:67)克隆在MVA转移载体 中处于p7.5K启动子的控制下，并且如上所述产生病毒粒子。
编码HPV-52 E2多肽的合成基因由Geneart(Regensburg， Germany)合 成。如此设计该合成性序列，从而(i)减低与源自HPV-16、HPV-18和HPV-33 的E2基因的同源性百分比至小于75 %(优选地縮小同源部分至小于6个连 续核苷酸)和(ii)导入取消HPV-52基因产物之酶功能的突变(E39A和I73A)。
使用引物OTGl8968 (SEQ ID NO:78)、 OTGl8969 (SEQ ID NO:79)、 OTGl 8970 (SEQ ID NO:80)、 OTG18971 (SEQ ID NO:81)、 OTGl 8972 (SEQ ID NO:82)和OTGl 8973 (SEQ ID NO:83)，通过三重PCR随后将合成性 HPV-52 E2*deg序列融合于编码麻疹病毒F蛋白的信号肽和膜锚定性肽的 核苷酸序列(产生SS-52E2*deg-TM)。
将编码SS-52E2*deg-TMF多肽的所得片段(SEQ ID NO:69)克隆在 MVA转移载体中p7.5K启动子下游，并且如上所述产生病毒粒子。
将编码膜呈递的且酶缺陷型HPV-18 E2多肽的pH5R-SS-18E2*-TMR 盒(从pTG17552分离)、编码膜呈递的且酶缺陷型HPV-33 E2多肽的 p7.5K-SS-33degE2*-TMR盒、编码膜呈递的且酶缺陷型HPV-52 E2多肽的 7.5K-SS-52degE2*-TMF盒导入(含有pH5R-SS-16E2*-TMR盒的)TG17408 并且如上所述产生病毒粒子。
权利要求
1.一种载体，其至少包含编码第一多肽的第一核酸分子和编码第二多肽的第二核酸分子，其中-所述第一和第二核酸分子分别获得自第一和第二天然核酸序列，其在一40个或更多个连续核苷酸的部分显示大约80％或大于80％的同源性百分比，和-该载体中包含的所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75％。
2. 根据权利要求1的载体，其中第一核酸分子或第二核酸分子或第一 和第二核酸分子的密码子使用模式至少在所述的40个或更多个连续核苷酸 同源部分内被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75%。
3. 根据权利要求2的载体，其中密码子使用模式在核苷酸水平被修饰 并且所述的修饰在氨基酸水平是沉默的。
4. 根据权利要求2或3的载体，其中密码子使用模式被修饰以使得第 一与第二核酸分子之间的同源部分限制在小于8个连续核苷酸。
5. 根据权利要求4的载体，其中密码子使用模式被修饰以使得第一与 第二核酸分子之间的同源部分限制在小于5个连续核苷酸。
6. 根据权利要求1至5任一项的载体，其中所述载体是腺病毒载体。
7. 根据权利要求6的载体，其中所述腺病毒载体是复制缺陷型的。
8. 根据权利要求1至5任一项的载体，其中所述载体是痘病毒载体。
9. 根据权利要求8的载体，其中所述痘病毒载体从选自由哥本哈根株、 Wyeth株、NYVAC和高度减毒的改良Ankara (MVA)株组成的组中的痘苗 病毒获得。
10. 根据权利要求1至9任一项的载体，其中第一和第二核酸分子独立 地编码选自由免疫原性多肽和抗肿瘤多肽组成的组中的多肽。
11. 根据权利要求1至10任一项的载体，其中第一和第二核酸分子从 同一种生物体或从密切相关的生物体获得。
12. 根据权利要求ll的载体，其中所述生物体是乳头状瘤病毒并且第 一和第二核酸分子中每一种核酸分子编码乳头状瘤病毒多肽。
13. 根据权利要求12的载体，其中第一和第二核酸分子独立地从选自由HPV-16、 HPV画18、 HPV誦30、 HPV画31、 HPV画33、 HPV-35、 HPV-39、 HPV-45、 HPV-51、 HPV隱52、 HPV-56、 HPV-58、 HPV-59、 HPV-66、 HPV國68、 HPV-70和HPV-85组成的组中的高危型乳头状瘤病毒获得。
14. 根据权利要求12或13的载体，其中第一和第二核酸分子独立编码 选自由E1、 E2、 E6和E7组成的组中的早期乳头状瘤病毒多肽。
15. 根据权利要求12至14任一项的载体，其中第一核酸分子和第二核 酸分子编码从同一种HPV血清型获得的至少两种不同的乳头状瘤病毒多 肽。
16. 根据权利要求15的载体，其中第一核酸分子编码El多肽并且第 二核酸分子编码E2多肽。
17. 根据权利要求16的载体，其中第一核酸分子编码包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽并且第二核酸分子编码包含SEQ ID NO:7所 示氨基酸序列的多肽。
18. 根据权利要求16的载体，其中第一核酸分子编码包含SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽并且第二核酸分子编码包含SEQ ID NO:8所 示氨基酸序列的多肽。
19. 根据权利要求16至18任一项的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。
20. 根据权利要求17或19的载体，其中第一核酸分子包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列并且其中第二核酸分子包含SEQ ID NO:12所示 的核苷酸序列。
21. 根据权利要求18的载体，其中第一核酸分子包含SEQ ID NO:ll 所示的核苷酸序列并且其中第二核酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核苷 酸序列。
22. 根据权利要求20或21的载体，其中所述载体是MVA载体，第一 核酸分子置于痘苗病毒7.5K启动子的控制下并且第二核酸分子在痘苗病毒 H5R启动子的控制下，并且第一和第二核酸分子均插入所述MVA载体的 缺失III中。
23. 根据权利要求16的载体，其中所述载体包含编码HPV-16E1多肽 的第一核酸分子、编码HPV-16 E2多肽的第二核酸分子、编码HPV-18E1 多肽的第三核酸分子和编码HPV-18 E2多肽的第四核酸分子，并且其中所述第一、第二、第三和第四核酸分子不包含显示75%或大于75%同源性百 分比的40个或更多个连续核苷酸的部分。
24. 根据权利要求23的载体，其中所述HPV-16 El多肽包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的 氨基酸序列，所述HPV-18E1多肽包含SEQIDNO:6所示的氨基酸序列和 /或所述HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
25. 根据权利要求24的载体，其中所述载体包含含有SEQ ID NO:IO 所示核苷酸序列的第一核酸分子、含有SEQIDNO:12所示核苷酸序列的第 二核酸分子、含有SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的第三核酸分子和含有 SEQIDNO:13所示核苷酸序列的第四核酸分子。
26. 根据权利要求23至26任一项的载体，其中所述载体是MVA载体， 所述第一、第二、第三和第四核酸分子被导入MVA载体的缺失m中，第 一和第三核酸分子置于相反的方向上，各自处在痘苗病毒p7.5K启动子的 控制下，并且第二和第四核酸分子置于相反的方向上，各自处在痘苗病毒 pH5R启动子的控制下。
27. 根据权利要求12至14任一项的载体，其中所述第一核酸分子和所 述第二核酸分子至少编码从密切相关的HPV血清型获得的同一种多肽。
28. 根据权利要求27的载体，其中密切相关的HPV血清型是HPV-16、 HPV-18、 HPV-33和/或HPV-52。
29. 根据权利要求28的载体，其中从密切相关的生物体获得的所述同 一种多肽是E2多肽。
30. 根据权利要求29的载体，其中所述载体包含编码HPV-16E2多肽 的第一核酸分子、编码HPV-18E2多肽的第二核酸分子、编码HPV-33E2 多肽的第三核酸分子和编码HPV-52 E2多肽的第四核酸分子。
31. 根据权利要求30的载体，其中所述HPV-16 E2多肽包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述HPV-18 E2多肽包含SEQ ID NO:8所示的 氨基酸序列，所述HPV-33 E2多肽包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列， 所述HPV-52 E2多肽包含SEQ IDNO:71所示的氨基酸序列。
32. 根据权利要求30或31的载体，其中所述第一核酸分子包含SEQID NO:12所示的核苷酸序列、所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:13所示的核 苷酸序列、所述第三核酸分子包含SEQ ID NO:67所示的核苷酸序列并且所述第四核酸分子包含SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列。
33. 根据权利要求28或28的载体，其中从密切相关的生物体获得的所述同一种多肽是E6多肽、E7多肽或E6和E7多肽。
34. 根据权利要求33的载体，其中第一核酸分子编码HPV-16E6多肽并且第二核酸分子编码HPV-18 E6多肽，其中第二核酸分子包含SEQ IDNO:14所示的核苷酸序列。
35. 根据权利要求33的载体，其中第一核酸分子编码HPV-16E7多肽并且第二核酸分子编码HPV-18 E7多肽，其中第二核酸分子包含SEQ IDNO:15所示的核苷酸序列。
36. 根据权利要求34或35的载体，其中所述载体是MVA载体，第一核酸分子置于痘苗病毒7.5K启动子的控制下并且第二核酸分子在痘苗病毒H5R启动子的控制下，并且第一和第二核酸分子均插入所述MVA载体的缺失III中。
37. 根据权利要求33的载体，其中所述载体包含编码HPV-16E6多肽的第一核酸分子、编码HPV-18E6多肽的第二核酸分子、编码HPV-16E7多肽的第三核酸分子和编码HPV-18 E7多肽的第四核酸分子，其中所述第一、第二、第三和第四核酸分子不包含显示75%或大于75%同源性百分比的40个或更多个连续核苷酸的部分。
38. —种基本上分离的核酸分子，其包含SEQIDNO:9、 10、 11、 12、13、 14、 15、 66、 67、 68或69任一所示的核苷酸序列。
39. —种宿主细胞，其包含根据权利要求38的核酸分子或根据权利要求1至37任一项的载体。
40. —种药物组合物，其包含治疗有效量的根据权利要求38的核酸分子、根据权利要求1至37任一项的载体或根据权利要求39的宿主细胞和可药用介质。
41. 权利要求40的药物组合物，其中所述组合物包含适合给人类全身性或粘膜性施用的一种或多种佐剂。
42. 权利要求41的药物组合物，其中所述佐剂是咪唑喹啉化合物。
43. 根据权利要求38的核酸分子、根据权利要求1至37任一项的载体、根据权利要求39的宿主细胞或根据权利要求40至42任一项的组合物在制备用于治疗或预防感染性疾病、癌症或免疫缺陷病的药物中的用途。
44. 根据权利要求43的用途，所述药物用于预防性或治疗性治疗与乳头状瘤病毒感染相关的病况，如持续性感染、恶变前和恶性病变。
45. 根据权利要求43或44的用途，其中按照激发-增强治疗模式实施所述用途，并且其中所述载体或组合物用来激发或增强或激发并增强对象的免疫应答。
全文摘要
本发明提供用于表达至少第一和第二核酸分子的载体，其中所述第一和第二核酸分子在40个或更多个连续核苷酸的部分显示大约80％或大于80％的同源性百分比，并且中所述第一核酸分子和/或所述第二核酸分子被修饰，以使得所述的同源性百分比减低至小于75％。本发明也涉及基本上分离的核酸分子，其包含如SEQ ID NO9-15和66-69任一所定义的核苷酸序列。还提供包含此种核酸分子或载体的宿主细胞和药物组合物以及它们用于治疗或预防目的的用途。
文档编号C12N15/86GK101688223SQ200880016061
公开日2010年3月31日 申请日期2008年1月29日 优先权日2007年5月15日
发明者D·施密特, N·西尔韦斯特雷 申请人:特兰斯吉恩股份有限公司