专利名称：抗体产生的方法
技术领域：
本发明总体涉及在表达原癌基因的动物中产生抗体生成细胞和抗 体的方法。本发明还涉及有效地产生对正常接受免疫约束诸如自身耐 受的抗原特异的抗体的方法。本发明进一步涉及产生抗体生成细胞和 抗体而不需要传统的抗体生成B细胞与骨髓瘤融合伴侣的融合。
背景技术：
抗体，尤其是单克隆抗体的应用已经根本改变了基础和临床研究 以及常规的诊断手段的各个领域。单克隆抗体的临床应用已经成为癌 症治疗药物的主要新来源。例如，称为CD20的表面蛋白的抗体己经 极大地改善了 NHL患者，以及患有抗体介导的自身免疫病的患者的预后。
高效价中和抗体的开发与患者对抗许多病毒感染的能力相关。近 来禽流感在东南亚的传播表明那些在感染中幸存的个体也是那些能够 发生有效的B细胞抗体依赖性中和反应的人。在比禽流感早一年的 SARS幸存者中显示类似的发现。据估计在美国由流行性感冒引起的年 死亡人数达到每年30,000-50,000人。全球由流行性感冒引起的死亡人 数估计比单独美国的数字高20-30倍。特别易受伤害的两个人群是幼儿 和老年人。能够被动提供的中和抗体的开发将极大地降低由流行性感 冒病毒或其他病毒诸如HIV所引起的死亡率。
到2005年5月为止，在美国市场上有18种治疗性单克隆抗体产 品。在全世界范围内，估计有500种单克隆抗体产品正在由200家以上的公司开发，用于每种衰弱性疾病的实际治疗。这些单克隆抗体产
品中大约80种正在进行临床试验。在2008年，单克隆抗体的全球市 场预计增加至167亿美元。
产生单克隆抗体的传统方法依赖于小鼠或选择的其他动物的超免 疫。然后从脾收集抗体生成细胞并与骨髓瘤细胞融合伴侣融合。通过 正向和反向选择步骤来完成对保留其抗体生成基因的细胞的选择。尽 管这已被证明是非常有效的技术，但基础生物学所赋予的限制可能导 致可获得的所有可能的特异性丢失>90%。这些限制的一些涉及称为 "自身耐受"的机制，以及达到抗体生成细胞和骨髓瘤融合伴侣之间 的成功融合所需要的某些要求。因此，在本领域中需要改进的产生抗 体的方法，该方法解决了与上述所列举的限制有关的问题，并且减少 鉴定目的抗体所需的时间量。
发明简述
本发明的一个方面涉及产生抗体生成细胞的方法，该方法通过在 可诱导过度表达MYC的动物中不过度表达MYC的条件下将抗原导入 该动物，从该动物中回收B细胞，并且在过度表达MYC的条件下培 养B细胞。
在一些实施方式中，该方法迸一步包括在使动物导入抗原的步骤 后，在动物中过度表达MYC的条件下饲养该动物的步骤。
在一些实施方式中，动物主要在所述动物的B细胞中可诱导地过 度表达MYC。
在一些实施方式中，所述动物是MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠。在 一些实施方式中，使动物导入抗原的步骤包括将编码抗原的DNA遗传 转移至动物中。在一些实施方式中，抗原包括自身抗原。在一些实施 方式中，动物进一步表达该抗原。在一些实施方式中，抗原包括HIV 蛋白，诸如gpl20或gp41。
在一些实施方式中，抗原包括来自流感病毒的抗原，诸如血凝素。 在一些实施方式中，在使动物导入抗原的步骤期间以抑制MYC表 达的抗生素饲养小鼠，以及在缺少抗生素的情况下进行培养B细胞的 步骤从而产生抗体生成细胞。在一些实施方式中，所述方法进一步包括在使动物导入抗原的步 骤之后，将小鼠从暴露于抗生素移开的步骤。在一些实施方式中，抗 生素是强力霉素。
本发明的另一方面涉及产生抗体的方法，该方法通过在可诱导过
度表达MYC的动物中不过度表达MYC的条件下使动物导入抗原，从 该动物中回收B细胞，在过度表达MYC的条件下培养B细胞，并且 从B细胞培养物中回收抗体。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在使动物导入抗原的步骤 后，在动物中过度表达MYC的条件下饲养该动物的步骤。
在一些实施方式中，动物主要在所述动物的B细胞中可诱导地过 度表达MYC。
在一些实施方式中，动物是MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠。在一些 实施方式中，使动物导入抗原的步骤包括将编码抗原的DNA遗传转移 至动物中。
在一些实施方式中，抗原包括自身抗原。在一些实施方式中，动 物进一步表达该抗原。
在一些实施方式中，抗原包括HIV蛋白，如gpl20或gp41。 在一些实施方式中，抗原包括来自流感病毒的抗原，诸如血凝素。 在一些实施方式中，抗体是人源化抗体。
本发明的另一方面涉及产生抗体的方法，该方法通过将编码B细 胞的重链或轻链基因的VDJ连接区的核酸分子导入至动物——其可诱 导地过度表达MYC并且含有防止B细胞产生的遗传修饰一~"的骨髓 来源干细胞中，将所述骨髓来源干细胞转移至受体动物中，从该受体 动物中回收B细胞，在过度表达MYC的条件下培养B细胞，并且从 B细胞培养物中回收抗体。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在将骨髓来源干细胞转移 至受体动物的步骤之后，在该受体动物中过度表达MYC的条件下饲养 该受体动物的步骤。
在一些实施方式中，该方法进一步包括在将骨髓来源干细胞转移 至受体动物的步骤之后，在该受体动物中不过度表达MYC的条件下饲 养该受体动物的步骤。
ii在一些实施方式中，来自第一步骤的B细胞是人B细胞。 在一些实施方式中，B细胞分离自人。 在一些实施方式中，人患有抗体介导的自身免疫病。 在一些实施方式中，第一步骤包括用编码VDJ邻接区的核酸分子
经逆转录病毒转导骨髓来源干细胞。
在一些实施方式中，编码VDJ连接区的核酸分子克隆自选择性地
结合目的抗原的分离的人B细胞。
在一些实施方式中，编码VDJ连接区的核酸分子是来自在得自人
供体的B细胞中发现的IgH和IgL序列的重排VDJ区的PCR扩增片段。
在一些实施方式中，所述人供体选自健康供体和患有抗体介导 的自身免疫病的患者。
在一些实施方式中，骨髓来源干细胞进一步用编码人IgH的核酸 分子和编码人IgL的核酸分子转导。
在一些实施方式中，编码人IgH的核酸分子和编码人IgL的核酸 分子是相同的核酸分子。
在一些实施方式中，编码人IgH和人IgL的一个或两个核酸分子 同样是编码VDJ区的核酸分子。
在一些实施方式中，骨髓来源干细胞来自人或小鼠。
在一些实施方式中，小鼠是MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠，其含有 选自下列的遗传修饰Rag-2一、 SCID、 DNA-PK'A、 Ku70一、 Ku80一、 XRCC和^MT一。
在一些实施方式中，受体动物是致死性照射的小鼠。
在一些实施方式中，受体动物是SCID小鼠。
在一些实施方式中，在动物体内导入选择性地结合VDJ区的抗原。
在一些实施方式中，抗体同种型是IgA或IgG。
在一些实施方式中，抗体的Fc区已被遗传修饰，以使抗体触发自 身免疫反应和相关免疫复合物沉积问题的能力降到最低。
本发明的另一方面涉及一种产生抗体生成细胞的方法，该方法通 过在可诱导地过度表达促进细胞存活和增殖的原癌基因的动物中不过 度表达该原癌基因的条件下使该述动物导入抗原，从该动物中回收B细胞，并在过度表达该原癌基因的条件下培养B细胞。
本发明的另一方面涉及一种产生抗体的方法，该方法通过在可诱 导地过度表达促进细胞存活和增殖的原癌基因的动物中不过度表达该 原癌基因的条件下使该动物导入抗原，从该动物中回收B细胞，在过 度表达该原癌基因的条件下培养B细胞，并从B细胞培养物中回收抗 体。
本发明的另一方面涉及一种产生抗体的方法，该方法通过将编码 抗原的核酸分子导入至来自动物——其可诱导地过度表达促进细胞存 活和增殖的原癌基因——的骨髓来源干细胞中，将骨髓来源干细胞转 移至受体动物中，在所述动物中过度表达该原癌基因的条件下词养该 受体动物，从该受体动物中回收B细胞，在过度表达该原癌基因的条 件下培养B细胞，并从B细胞培养物中回收抗体。
本发明的另一方面涉及一种产生抗体的方法，该方法包括将编 码促进细胞存活和增殖的原癌基因的核酸分子导入至来自动物的骨髓 来源干细胞中，将该骨髓来源干细胞转移至受体动物中，从该受体动 物中回收B细胞，将编码抗原的核酸分子导入至B细胞中，在过度表 达该原癌基因的条件下培养B细胞，并从B细胞培养物中回收抗体。
本发明的另一方面涉及一种产生抗体的方法，该方法包括将编码 促进细胞存活和增殖的原癌基因的核酸分子导入至来自动物的骨髓来 源干细胞中，将骨髓来源干细胞转移至第一受体动物中，从第一受体 动物中回收B细胞，将编码抗原的核酸分子导入至B细胞中，将该B 细胞转移至第二受体动物中，在动物中过度表达该原癌基因的条件下 饲养第二受体动物，从第二受体动物中回收B细胞，在过度表达该原 癌基因的条件下培养B细胞，并从B细胞培养物中回收抗体。
在一些实施方式中，原癌基因是MYC。
在一些实施方式中，骨髓来源干细胞已用编码抗凋亡蛋白的核酸 分子转导。
在一些实施方式中，抗凋亡蛋白是Bcl-2。 在一些实施方式中，核酸分子经逆转录病毒导入。 在一些实施方式中，骨髓来源干细胞来自人。 在一些实施方式中，骨髓来源干细胞是条件永生化的长期造血干细胞。
在一些实施方式中，受体动物是亚致死性照射的NOD/SCID小鼠。 在一些实施方式中，动物是编码人Ig基因座的核酸分子的转基因 动物。
图1示出了在TBLK6和TBLK7细胞系表面上的CD138 (Y-轴)和 CD40 (X-轴)的表达(上部图板)以及从TBLK6和TBLK7细胞系分泌的 IgM的分析(底部图板)。
图2示出了在E^i-MYC/BCR皿"sHEL转基因小鼠中出现的肿瘤和 细胞系的表面表型(上部图板)和在En-MYC/BCR皿"sHEL小鼠中出现 的肿瘤和细胞系中的免疫球蛋白产生(A)和HEL特异的效价(B)(底部 图板)。
图3示出了在急性过度表达MY后出现活化B细胞(上部图板)以 及在连续过度表达MYC期间活化B细胞的积聚(底部图板)。
图4示出了在过度表达MYC后血清中自身抗体的积聚(上部图板) 和在过度表达MYC后肾中自身抗体和免疫复合物的积聚(底部图板)。
图5示出了新HEL特异抗体保护小鼠免受致死性表达HEL的PRV 变体的攻击。
图6示出了在逆转录病毒嵌合小鼠中形成的B细胞肿瘤的表面表型。
图7示出了免疫印迹，其用表达HA的细胞溶解产物显示了得自
逆转录病毒嵌合小鼠的血清的反应性。
图8示出了得自逆转录病毒嵌合小鼠的鼠血清的血凝抑制分析。 图9示出了对通过使用过度表达MYC的小鼠获得的抗体特异性进
行人源化的两种基于逆转录病毒载体的方法。
具体实施例方式
本发明提供了产生抗体生成细胞和抗体的新方法，其克服了与传 统抗体产生有关的许多问题。 一般而言，本发明涉及在表达原癌基因 的动物中迅速产生抗体生成细胞和抗体的方法，所述动物例如，过度表达MYC或Akt的动物，特别优选过度表达MYC的动物。本文所公 开的方法允许产生单克隆抗体，而不需要将抗体生成B细胞与骨髓瘤 融合伴侣融合，从而减少了产生抗体所需的时间。本文公开的方法进 一步消除了使来自免疫小鼠的B细胞处于细胞周期中的特定阶段以便 与骨髓瘤伴侣成功地融合的需要，而这种需要在传统的抗体生成技术 中是必需的。本发明也允许有效地产生对正常接受免疫约束诸如自身 耐受的抗原特异的抗体。例如，该方法可用于产生自身抗原的单克隆 抗体。
本发明人已经证明过量的MYC可破坏B细胞对可溶性抗原的耐 受。例如，过度表达MYC的BCR^l转基因B细胞对sHEL产生强烈 的反应，并且在恶性肿瘤发生之前产生多克隆自身免疫性淋巴细胞增 生性疾病(见图3和4)。自身反应性B细胞中的MYC的过度表达能够 使B细胞不依赖于T细胞的辅助，通过MYC的能力来提供增殖和存 活信号。过度表达MYC的自身反应性B细胞的扩充群体生长成为B 细胞淋巴瘤，所述B细胞淋巴瘤仍然依赖于对其关联抗原的持续暴露 以及MYC的过度表达。从来自荷瘤小鼠的淋巴结、脾和骨髓收获的B 细胞可用于建立许多表达BCR皿转基因和分泌抗HELIgM的细胞系， 而不需要将原代细胞与骨髓瘤融合伴侣融合(见图2)。如下面所讨论的，
此方案可实际上很容易地适用于任意抗原。
使用两种其他的动物方案已获得类似的结果。一个实例是从Ars.Al
小鼠和EpMYC品系之间杂交得到的小鼠。在那些小鼠中，平均在36 日龄时出现Burkitt样淋巴瘤的生长。肿瘤由成熟、活化的B细胞组成。 那些细胞表面上表达IgM。因此，本发明人已经证明在低亲和性抗 DNA抗体的情况下，MYC过度表达可破坏自身反应性B细胞的耐受 性。第二个实例采用了MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠，其在从饮食中撤 出强力霉素后使B细胞特异性地、暂时调控性地过度表达MYC。当发 明人将小鼠在4月龄时撤离含强力霉素饮食时，小鼠的血清中积累了 活化的外周B细胞、抗核抗体，肾中有免疫复合物沉积，并且在6周 内形成了 B细胞淋巴瘤(平均为42天)。重要地是，发明人已经能够从 肿瘤建立细胞系而不需要与骨髓瘤伴侣细胞融合。
基于该系统的生物学的至少三个方面，本发明提供了产生具有已
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知特异性的抗体的新方法，其效力显著超过现有的方法。首先，自身耐受机制所施加的障碍的缺乏，使此系统能产生抗体而没有任何的免疫约束。此方法允许产生标准免疫程序(现有技术)不能达到的抗体特异性。此外，采用标准免疫方案没有简单的手段来破坏自身耐受性。第二，目的的关联抗原推动B细胞肿瘤在体内形成，并允许选择可发展成为淋巴瘤的抗体生成细胞以及产生所得单克隆抗体的细胞系。由于筛选由此得到的单克隆抗体可以直接的方式完成，因而这就加快了生长时间。第三，生成和克隆性地扩充来自这些小鼠中出现的肿瘤的抗体生成细胞系的能力消除了将抗体生成脾脏B细胞与骨髓瘤融合伴侣融合的需要。传统的融合方法的效率相当低，并且仅允许免疫后增殖
的一部分B细胞无限增殖化，并且因此，限制了可以单克隆抗体形式获得的特异性的数量。对于此低效率有许多原因(例如，需要B细胞停留在细胞周期的S期，需要保留在细胞中的来源于B细胞和骨髓瘤融合伴侣的染色体的适当数量和组合，需要在HAT和6-TG选择中存活，等等)。总之，本发明的用于生成单克隆抗体的新方法较传统方法在更短的时间框架内提供更多的抗体。利用目前可得的方式，该方法存在几种变化形式，其选择的实施方式被总结在下面。
在本发明的一个实施方式中，将用于产生抗体的合适的非人动物包括能够产生抗体并过度表达(例如，作为遗传修饰或天然或定点突变的结果)至少一种促进细胞存活和增殖的原癌基因的任何非人动物。由在本发明的方法中使用的非人动物过度表达的优选原癌基因包括但不限于MYC或Akt (肉豆蔻酰化(myrystylated))，特别优选MYC。借助于实施例，在此详细地描述过度表达MYC的小鼠，但要理解的是基于本公开将会考虑此方案的变化形式，包括使用其他合适的原癌基因和其他动物，以及执行该方案的技术细节的变化形式，并且这些变化形式被本发明包括在内。
本发明可使用任何过度表达MYC的动物。这些动物优选地包括非人动物，并且更优选地包括，啮齿动物，并且甚至更优选地包括，小鼠。特别有用的动物主要在B细胞群中过度表达MYC，如，例如，Ep-MYC小鼠品系。优选的动物也包括以可诱导的方式过度表达MYC的那些动物。在这些动物中，MYC的过度表达可以瞬时方式调控，例如，在幵始产生抗体之前被抑制。例如，MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠 品系可从出生时给予强力霉素或四环素直至它们被用来产生目的的抗 体，从而使自发性淋巴增殖性疾病的形成降到最低。可通过从小鼠的 饮食中去除强力霉素或四环素而开始过度表达MYC。适合用于本发明 的许多其他的可诱导基因表达/阻遏系统在本领域中是已知的。合适的 小鼠也可通过逆转录病毒转导和过继转移技术产生。例如，来自 TRE-MYC小鼠的骨髓细胞或纯化B细胞可用rtTA经逆转录病毒转导， 并且被转移至受体小鼠中或在体外培养。得到的细胞也可在转移或培 养之前被进一步转导(例如，用目的抗原)。
在本发明的某些实施方式中，具有过度表达MYC的细胞的动物体 内导入(例如，暴露于)抗原，并被允许对抗原发生免疫应答。例如，在 一个方面，通过本领域内熟知的将外源抗原导入到动物中的常规方法 (例如，使用类似于免疫的技术)，可以将动物暴露于目的抗原。
可选地，并且在优选的实施方式中，通过本领域中的一般技术， 可以将具有可诱导地表达MYC的细胞的动物改造为表达目的抗原，或 将表达目的抗原的细胞导入至动物中。实例包括逆转录病毒介导的骨 髓造血干细胞的转导，转基因动物的产生(或将过度表达MYC的动物
与表达该抗原的现有转基因动物杂交)，或用于递送基因至动物中的任 何其他方法。在一些实施方式中，动物在不过度表达MYC的条件下饲 养，直至需要产生抗体。然后动物可在过度表达MYC的条件下词养以 生成可产生对目的抗原特异的抗体的B细胞。本发明人相信对抗原特 异的B细胞在MYC不过度表达的情况下对该抗原是耐受的。一旦MYC 过度表达被诱导，B细胞能够破坏对该新自身抗原的耐受并生成对该 抗原特异的抗体。
来自AN-I正常细胞群(在B细胞发生期间也称为T3的群体，其被 认为是在结合自身抗原后在骨髓中被无应答化的B细胞)的细胞系可通 过多种方法产生，下面描述和举例其中的几种。在一个实施方式中， AN-I群来自从受孕起以强力霉素饲养的MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠。 根据本发明的方法，那些小鼠应该也表达特异的目的抗原。如上所讨 论的，这可容易地通过逆转录病毒介导的骨髓造血干细胞的转导、标 准的转基因方法，或用于递送基因至小鼠中的任何其他方法来完成。细胞可从大约6周龄小鼠以及野生型小鼠或仅携带转基因之一的小鼠
的脾脏中分离。细胞可在体外接种至合适的含有或不含强力霉素(50 nM)的淋巴细胞培养基(例如，RPMI 1640、 10%胎牛血清、青霉素/链霉 素、L-谷氨酰胺、2-(3巯基乙醇、丙酮酸钠、H印es和非必需氨基酸) 中。例如，细胞以大约2xl(^个细胞/ml的密度接种在24孔板中，尽 管本领域技术人员可以容易地优化或修改这些步骤。培养基一般一周 更换一次。此方法可以10-70%的效率提供细胞系，这取决于细胞的来 源和状态(即，肿瘤细胞或正常细胞，器官，等等)。可肉眼检查细胞的 克隆扩充。任何在大约14-28天时开始扩充的克隆可被缓慢地扩充至6 孔板中，并且最后扩充至组织培养瓶中。如前所述和本领域所知的， 所有多克隆细胞系可在分析之前通过有限稀释法进行单细胞克隆。
在另一个实施方式中，能够产生目的抗体的B细胞系的转化可在 体内发生。根据实施例，自受孕起以含强力霉素饮食饲养的同龄组的 MMTV-rtTA/TRE-MYC小鼠(其也表达来自cDNA编码质粒的目的抗原) 在6周龄时转换为正常鼠食。可每天检查这些小鼠的与B细胞淋巴瘤 的形成相关的临床体征(毛皮不洁、体表显著的淋巴结病、脱水、迟钝、 下肢上行性麻痹，等)。此外，小鼠可周期性地放血并检测对目的抗原 的反应性。 一旦小鼠形成肿瘤，则收集其淋巴结、脾脏、骨髓和血清。 得到的细胞悬液可用于FACS分析，如上所述，细胞可被接种以生成 细胞系，并且剩余的细胞可在10%DMSO中冷冻以便持续地获得有活 力的原代肿瘤组织。血清可用来对表达目的抗原的细胞进行染色，并 用于针对该特异抗原的免疫印迹和ELISA测定。对照小鼠一般包括野 生型小鼠和单一转基因小鼠。
在另一个实施方式中，来自画TV-rtTA/TRE-MYC小鼠(如上，自 受孕起已以含强力霉素饮食饲养)的纯化B细胞可在体外被转导以使它 们表达选择的抗原。然后被转导的细胞可过继转移至未以强力霉素饲 养的受体小鼠(例如，野生型小鼠)中，从而在转移的B细胞中诱导MYC 的过度表达。然后可每天检查小鼠的与B细胞淋巴瘤的形成相关的临 床体征，并如上所述生成细胞系。
用于建立单克隆抗体生成细胞的另一方法涉及使用来自小鼠一一 其表达选择的促进细胞存活和增殖(并且优选可调控的(可诱导的、可控的))原癌基因和编码抑制凋亡的蛋白的核酸分子的组合一一的骨髓逆 转录病毒嵌合体。在此实施方式中，示例性的组合包括但不限于
MYC-ER和Bcl-2 。后 一 种方法涉及加入4-羟基他莫西芬 (4-dydroxytamoxyfen) (40HT)以便使表达的MYC有活性。本发明人 已经使用了此构建物在涉及长期造血干细胞的条件永生化的试验中成 功地调控了 MYC功能。在此实例中，同龄组的骨髓嵌合小鼠可如下使 用富5FU的骨髓来源干细胞来生成。对于骨髓来源造血干细胞，静脉 给予5mg/小鼠5-氟尿嘧啶(5FU)，以便富集长期HSC，并在体内诱导 其增殖。5天后从股骨和胫骨收集骨髓细胞。使用低渗的裂解缓冲液裂 解红细胞。剩余的细胞在培养基中洗涤两次，并以2xl(^个细胞/ml的 浓度接种在24孔板中的DMEM培养基中，所述DMEM培养基补充有 15%热灭活的胎牛血清、青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、 重组人IL-3、 IL-6和干细胞因子(SCF)。如上所讨论的，骨髓细胞可以 在体外转导，以使它们表达选择的抗原。在首次旋转感染之前将细胞 培养24小时，将此步骤进行3次，每24小时一次。最后一次旋转感 染后的一天，通过流式细胞仪分析细胞。作为实施例，经慢病毒 (lentivirally)转导的骨髓来源HSC可以被用于重建致死性照射的小 鼠，并且可使用12周后淋巴器官中报告基因GFP的表达来追踪细胞。 在此实例中，小鼠被允许重建正常外周淋巴室(骨髓移植后8-12周)。 然后可从这些小鼠中分离脾GFP+AN-1/T3细胞，并用于体外永生化试 验，如上所述。关键性的不同在于不从系统中撤出强力霉素，而是向 培养基中加入40HT。可选地，这些分选的GFP+AN-1/T3细胞可被过 继转移至同龄组的野生型受体小鼠中，所述野生型小鼠每周用lmg/小 鼠的40HT腹膜内处理一次。每天监测小鼠中与B细胞淋巴瘤或白血 病的形成有关的临床体征的出现。可收集得到的肿瘤，并使用40HT 代替强力霉素作为MYC功能的调节剂，如本章节前面所述用于生成B 细胞系。
在另一个实施方式中，可使用条件永生化骨髓来源干细胞代替在 上述的方法中的富5FU骨髓来源干细胞。在一些实施方式中，可使用 表达上述原癌基因和编码抑制凋亡的蛋白的核酸分子的组合的细胞 系，所述原癌基因促进细胞存活和增殖(并优选可调控的(可诱导的，可
19控的))，所述组合示例为MYC-ER和Bcl-2的组合。条件永生化骨髓来 源干细胞及其产生的详细描述和实例在国际
发明者B·C·特纳, Y·雷费利 申请人:国家犾太健康中心