一种新型诱导抗体产生的方法
【专利摘要】本发明提供了一种新型抗体产生的方法，包括制备表达融合抗原蛋白的真核表达载体。该融合蛋白包括四部分序列组成：①来源于人IgE重链编码序列的信号肽序列；②抗原蛋白序列；③来源于结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的辅助序列，该序列可以放大小鼠针对抗原蛋白的抗体应答；④能与小鼠FcrRⅡ结合的多肽序列MFSRMTSLIMGN（简称APCTS）；该序列可将蛋白抗原特定导向小鼠抗原呈递细胞（APC），从而提高抗原呈递效率。将表达融合抗原蛋白的质粒直接注射小鼠肌肉或皮内，小鼠细胞可摄入DNA、高效表达融合抗原蛋白；继之刺激动物产生针对该抗原蛋白的高亲和力抗体。产生的抗体经纯化后可用于科研和临床诊断或治疗；抗体分泌细胞也可用杂交瘤技术制备特异性单克隆抗体。
【专利说明】一种新型诱导抗体产生的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学和基因工程【技术领域】，尤其涉及到人IgE重链信号肽、小鼠FcrR II结合多肽和特异性抗原蛋白和结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II辅助序列组成的融合抗原蛋白及其表达载体以及用该表达载体进行DNA免疫制备特异性抗体。
[0002]
【背景技术】
[0003]抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。通过向动物体内注射特定的抗原，可以得到相应特异性的抗体。对这些实验动物的血液进行分离后，可以在血清中得到“多克隆抗体”。即针对相同抗原的多种不同的抗体。这种方法制备的抗体又叫做抗血清。为了获得针对某一抗原单一抗原表位的特异性抗体，需要从动物身上分离出相应的抗体分泌B淋巴细胞，然后通过与骨髓瘤细胞株相融合使之可无限增值。这种融合细胞叫做杂交瘤，可以在培养环境中不停分泌抗体。杂交瘤细胞既能像骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，该技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。通过有限稀释克隆法将单个杂交瘤细胞分离出来,这种细胞克隆方法所制备出来的抗体是完全一样的，被称为单克隆抗体。
[0004]抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的探针，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。抗原和抗体的特异性结合在体内和体外都可呈现某种反应。在体内可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，可作为药物用于治疗；抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高、性质均一、可针对特定靶点定向制备等优点，在各种疾病治疗，特别是肿瘤治疗领域的应用前景备受关注。21世纪，生物技术将与信息技术一起为全球经济发展提供强大的动力，成为全社会最重要并可能改变未来工业和经济格局的技术。抗体工程技术随着现代生物技术的发展而不断完善，并且是生物技术产业化的主力军，尤其在生物技术制药领域占有重要地位。单克隆抗体由于可精确的攻击靶分子，且具有较少的毒副作用而成为人们期望中的理想药物。因此，制备高质量的抗体成为人们在科研、诊断和治疗等领域中进行开发和研究的一种核心技术。
[0005]要得到高质量即高特异性和灵敏性的抗体，首先要有高质量的抗原用于免疫动物。在制备抗体的过程中，使用复杂的抗体纯化技术、传统的杂交瘤技术，抗体基因克隆/表达技术以及重组抗体文库的制备等，所有这些都不能改变已产生的抗体亲和力和特异性。抗体的抗体亲和力 和特异性是在动物免疫和应答反应过程中就已决定的。它与动物免疫系统接触到的抗原形式有关。抗体的纯化和筛选只能帮助选出动物已经产生的各种抗体。因此，制备高质量的抗原和设计高效的动物免疫方式是制备高质量抗体的关键。
[0006]在常规抗体制备过程中，一般都用人工合成的多肽作为抗原。由于多肽构象与相应序列在天然蛋白质中的构象不完全一致，因此用多肽刺激动物产生的抗体对相应的天然蛋白质抗原亲和力低或完全不能识别。在常规方法中，也用细菌表达的重组蛋白质作为抗原。在细菌中表达的重组蛋白，往往缺乏在真核细胞中天然蛋白经过的修饰作用。因此，细菌产生的重组蛋白液不能满足产生针对某些经过修饰(如糖基化修饰)的真核蛋白质的特异性高质量抗体。并且，用真核细胞表达抗原蛋白，一是成本高，同时对于大规模制备批量的抗原蛋白也不实际。在常规抗体制备免疫过程中往往使用佐剂。佐剂的应用也往往会改变蛋白抗原的构象。最后，有些重要的蛋白质抗原性较低，本身很难在机体刺激产生特异性抗体。因此，在制备针对各种不同的蛋白质特异性高质量抗体，需要在从抗原制备到免疫方式等各个不同的环节进行技术革新。
[0007]Richard Young首次发现结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70可以调节机体的免疫应答，建议其可以用于免疫治疗和预防。他们的研究认为热休克蛋白Hsp70含有许多协助性T细胞决定簇，可加强机体对于与之相连的其它抗原决定簇(epitope)产生特异性的抗体或细胞免疫应答(Suzue，K.& Young, R.A.: J.1mmunol.156:873-9，1996)。我们发现将结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II蛋白与特异性抗原蛋白一起制成融合蛋白，该融合蛋白注射活动物机体后可明显促进机体对其中特异性靶蛋白抗原的抗体生成应答。结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II蛋白比结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70会有更多的辅助性T细胞决定簇。它可以作为一种抗原辅助序列与天然蛋白抗原一起以融合蛋白形成对动物进行免疫。在特异性抗原免疫前，动物已受到自然界中该抗原辅助序列或同源相关蛋白的致敏作用，从而产生许多记忆性T细胞。因此，该抗原辅助序列与特异性抗原组成的融合蛋白进入机体后可迅速刺激这些已致敏的辅助性T细胞放大针对特异性抗原产生较强烈的免疫应答。抗原辅助序列也可与微生物疫苗结合在一起应用，以促进机体对于疫苗的免疫应答。
[0008]此外，Nchinda等人发现用针对树突状细胞Dec205分子的单链抗体将抗原蛋白靶向导给树突状细胞可以显著增强小鼠对抗原蛋白的免疫应答(Nchinda，G.ef al: J.clin.1nvest.118:1427-36, 2008)因此，促进抗原呈递细胞对抗原的呈递效率也是有效制备抗体的一种方式。
【发明内容】
[0009]我们的抗体制备新技术中，首先用抗原递呈细胞祀向序列(antigen-presentingcell-targeted sequence, APCTS)将特异性抗原定向输给抗原递呈细胞,从而极大地提高了其抗原呈递(presenting)能力以及显著促进后续的针对该抗原蛋白的特异性免疫应答，产生高滴度的特异性抗体和细胞免疫应答等。我们所用的APCTS是一种能特异性与抗原呈递细胞表面FcrR II结合的肽，其序列为:MFSRMTSUMG。在常规免疫方法中，抗原呈递细胞对抗原的捕捉是随机的，以至其抗原呈递效率极大地低于我们特异性靶向抗原富集新方法。
[0010]并且，我们还应用了抗原辅助(antigen helper)序列。我们的“抗原辅助”序列，充分利用动物机体在日常生活中已被自然界广泛存在的“辅助抗原” “致敏(primed)”这一特点，将靶蛋白抗原与“抗原辅助序列”制成融合蛋白抗原，这样在“抗原辅助序列”刺激的加强型特异性辅助T细胞作用下可引发有效地针对靶蛋白抗原的免疫应答。 我们的抗原辅助序列来源于结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II (CtaC)蛋白。[0011]最后，我们的新技术将人IgE重链信号肽序列、抗原呈递细胞靶向序列、特异性抗原蛋白和抗原辅助序列制成一融合抗原蛋白。用基因克隆方法将编码该融合抗原蛋白的DNA克隆到真核表达载体中去，从而得到表达该融合抗原蛋白的真核表达质粒，将该载体质粒利用DNA免疫(DNA immunization)方法使得免疫动物体内细胞中高效过量表达(overexpress)该融合抗原蛋白，这些蛋白在构象、加工和修饰方面与天然蛋白质一样。并且这些蛋白质可持续长时间在体内表达。充足的抗原蛋白质可持续刺激、诱导抗体免疫活性细胞产生针对抗原蛋白较强的特异性免疫应包括抗体生成作用。这些抗体可对天然蛋白产生高亲和力和高特异性反应。
[0012]此外，我们的技术可以用于生产高质量的一些常规方法无法或较困难得到的针对靶蛋白抗原的特异性抗体。并且，该技术可以制备产生重要的功能性抗体，如中和性抗体
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[0013]【专利附图】
【附图说明】: 图1:小鼠FcrRII结合多肽APCTS蛋白序列和DNA编码序列。
图2:用重叠PCR方法制备HS-ADCTS-VEGF-CtaC融合蛋白编码DNA示意图。
图3:用叠加PCR (overlapping PCR)方法制得的HS-APCTS-人VEGF-CtaC融合蛋白编码DNA片段，其大小约为2.7kb，与设计相符。
图4:用特异性VEGF抗体在免疫印迹方法中检测到APCTS-人VEGF-CtaC表达质粒转染的293T细胞中该融合抗原蛋白的表达。
图5: VEGF和APCTS-VEGF-CtaC融合蛋白DNA免疫家兔产生VEGF特异性抗体的比较。图6:APCTS-VEGF-CtaC融合蛋白DNA免疫小鼠制备的VEGF特异性小鼠单克隆抗体(2E8)在免疫印迹实验中对人VEGF的特异性识别作用。重组人VEGF蛋白上样量都为10ng。图7 =VEGF单克隆抗体(2E8)对VEGF诱导Huvec细胞的增殖抑制作用。
【具体实施方式】:
为了制备高质量的抗体，首先要制备高质量的抗原。同时用抗原免疫动物的方式也是决定抗体应答的重要环节。为了有效地使抗原被抗原呈递细胞(APC)所捕获，我们首先从曬菌体展示多肽文库(phage-display library)中筛选能与APC表达的FcrR II相结合的多肽片段。采用美国NEB公司生产的Ph.D.?噬菌体表面展示肽库试剂盒，按照操作说明，我们从随机肽文库中发现一短肽MFSRMTSUMG能与小鼠FcrR II结合，由此我们得到了抗原递呈细胞祀向序列(antigen-presenting cell-targeted sequence, APCTS)。
[0014]大量实验证明结核分枝杆菌产生的分泌蛋白和一些细胞膜相关蛋白含有许多辅助性T细胞表位(epitopes),可激活辅助性T细胞增强特异性抗体应答(Horwitz, M.A.ef al: Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 92:1530-34，1995)。为了筛选这种结核分枝杆菌蛋白作为融合抗原蛋白中的辅助序列，将l_3Kb长的结核分枝杆菌H37Rv DNA片段克隆到Ρ?τ_ρ1?Α融合载体中去制成一重组蛋白表达文库。载体中的PhoA基因编码碱性磷酸酶，其自身上游的信号肽序列被除去，将结核分枝杆菌DNA片段克隆到其phoA基因上游，即可在IPTG诱导融合基因上游启动子作用下介导下游融合蛋白的表达。如果结核分枝杆菌DNA编码的是分泌型或膜蛋白，则可将具有酶活性的碱性磷酸酶蛋白通过融合蛋白分泌到细胞外或进入胞周腔，从而分解底物产生颜色反应，即可鉴定出阳性克隆。采用高通量抗-PhoA亲和柱结合纯化方法从阳性克隆中纯化其阳性融合蛋白。然后用小鼠T细胞增殖实验检测筛选阳性克隆所表达的融合蛋白免疫原性。结果发现结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II蛋白的T细胞刺激作用最强。同时也证明它可以明显促进与之融合的Ph0A蛋白在小鼠诱导的特异性抗体应答反应。因此，我们选用结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II作为免疫用融合抗原蛋白中的辅助序列。[0015]进一步，采用分子克隆方法构建表达由抗原呈递细胞靶向序列、特异性抗原蛋白和辅助序列(结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II)以及FcrR II结合肽序列组成的融合蛋白表达载体。在该融合抗原蛋白的上游加上一来自人IgE重链蛋白的信号肽序列。先用叠加PCR(Overlapping PCR)方法将编码这四个蛋白质片段的基因按以下顺序进行同框(inframe)串联在一起--人IgE重链信号肽-FcrR II结合肽序列_特异性抗原蛋白序列_结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II蛋白序列。将编码这一融合抗原蛋白基因进一步克隆到真核表达载体pcDNA3.1 (+)中去制成pcDNA3.1(_)抗原表达载体。将该表达载体在大肠杆菌DH5 α细胞中进行培养扩增，制备大量纯化的质粒DNA。将该质粒DNA对Balb/c小鼠进行 DNA 免疫(Chu, T.H.T.et al: Br.J.Haematol.113:32-6，2001 )，取 50 μ g 质粒于50 μ I生理盐水中在小鼠后腿肌肉和背部皮内进行多点注射免疫；间隔2周重复DNA免疫2次。最后一次免疫2周后，在小鼠尾部取血用ELISA法测定抗原特异性抗体滴度。如制备抗原特异性单克隆抗体，则在取小鼠脾脏细胞进行融合前3天，用同一质粒转染的293Τ细胞(5Χ IO6个细胞)在小鼠腹腔进行一次加强刺激(boost)。按常规杂交瘤技术制备抗原特异性单克隆抗体。
[0016]以下将以用本发明方法制备人VEGF特异性单克隆抗体为例，通过具体实施的方式，对本发明进行举例说明，但应当理解这些实例不以任何形式限制本发明范围。
[0017]实例1:APCTS_人VEGF-结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II CtaC融合抗原蛋白真核表达载体的构建
首先采用叠加PCR (overlapping PCR)的方法合成编码该融合蛋白的DNA,具体方法如图2所示。如无特殊说明，本发明中所有分子生物学实验操作均按文献操作:Green，M.R:Molecular cloning, A Laboratory Manual (4th) , Cold Spring Harbour Press, 2012。先合成四个寡聚核苷酸引物片段:(1) 5' ATGTTTTCTCGCATGACCTCGCTCATTATGGGTAACAACTTTCTGCTGTCTTGG 3，:(2)5' TGGCTCGCGAGGTGTCACCCGCCTCGGCTTGTCACATCT
3 ' ； (3 ) 5 ' ATCGCTCGAGCTAACCTACGGGCATCGG 3 ' ； ( 4 )
5,ACTGGGTACCATGGACTGGACCTGGATA CTGTTCCTGGTG GCC GCCGCCACACGGGTGCACAGCACCTCGCTCATTATGGGT 3'。引物(I)含有APCTS的编码序列和人VEGF N端6个氨基酸残基的编码序列。引物(2)含有结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II N端6个氨基酸残基的互补编码序列和人VEGF的C端7个氨基酸残基的互补编码序列。引物(3)含有结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II C端6个氨基酸残基的互补编码序列和XhoI酶切位点，引物(4)含有人IgE重链信号肽编码序列和KpnI酶切位点以及人VEGF的N端6个氨基酸残基的编码序列。
[0018]以含全长人VEGF cDNA的质粒为模板，进行第一轮PCR反应:
VEGF 质粒(I μ g/μ I) 1μ I
引物IΙμ?
引物21μ I
【权利要求】
1.一种用于制备抗原特异性抗体的融合抗原蛋白及其重组DNA编码序列.其中所述的融合抗原蛋白具有: (1)信号肽序列:来源于人IgE重链信号肽序列； (2)能与小鼠FcrRII结合的多肽序列(见图1):其序列为MFSRMTSUMGN ； (3)特异性蛋白抗原序列:即用于制备特异性抗体的抗原蛋白序列； (4)抗原辅助序列:该序列是结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II蛋白编码序列。
2.在权利要求1所述的融合蛋白中， (5)特异性抗原蛋白序列可以在辅助序列结核分枝杆菌细胞色素C氧化酶亚基II蛋白的N端，也可以是在其C端.(6 )FcrR II结合多肽序列，可以在融合蛋白的C端，也可在信号肽之后而位于特异性抗原蛋白序列和辅助序列的上游。
3.权利要求2所述的融合抗原蛋白序列从N端到C端为:信号肽序列一FcrRII结合肽序列——特异性抗原蛋白序列——抗原辅助序列。
4.一种真核表达载体，其含有启动子/增强子控制下的编码权利要求1-3中任一项所述的融合抗原蛋白DNA序列。
5.用权利要求4所述的真核表达载体在小鼠进行DNA免疫以制备抗原特异性抗体，该抗体可以是多克隆抗体，也 可是用 杂交瘤技术或其它技术制备的单克隆抗体。
【文档编号】C12N15/62GK103524625SQ201310437663
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】吴炯, 林峰 申请人:众森源生物技术（江苏）有限公司