抗sars疫苗的制作方法

专利名称：抗sars疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及病毒学领域，具体而言涉及SARS冠状病毒基因组的核苷酸序列以及这些序列中的部分片段用于制备DNA疫苗，表达相应的蛋白质的用途。也涉及这些蛋白用于疾病预防和治疗的用途。
背景技术：
自从2002年11月在我国广东省发现第一例严重急性呼吸系统综合症(SARS)以来，在过去的半年多的时间里，全球感染人数和地区不断增加。根据来自世界卫生组织网站的数据，截至2003年6月6日，全球累计报告病例达到8404人，遍及32个国家和地区，夺去了779人的生命。
严重急性呼吸系统综合症是一种新型的传染性很强的呼吸系统疾病，英文名称为Severe Acute Respiratory Syndrome，简称SARS。它不同于以往出现的非典型肺炎。以往的非典型肺炎(Atypical Pneumonia，ATP)通常是可以治疗的，而且很少有生命危险。而严重急性呼吸系统综合症的传染性很强，而且会产生呼吸窘迫而死亡。对于严重急性呼吸系统综合症的病原研究发现了一种新的冠状病毒，并命名为SARS冠状病毒。
冠状病毒最先于1937年从鸡身上分离出来。于1968年由一个叫秦瑞的科学家在电子显微镜下发现冠状病毒的外膜呈日冕状或者皇冠状突起，由此命名为“冠状病毒”。
1975年病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异，目前冠状病毒分为冠状病毒和环曲病毒两个属。
冠状病毒科的分类代表株为禽传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)其它成员有
人冠状病毒(Human coronavirus)鼠肝炎病毒(Murine virus hepatitis，MHV)猪血凝性脑脊髓炎病毒(Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus)猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteri tis virus，TGEV)初生犊腹泻冠状病毒(Neonatal calf diarrhea coronavirus，BCV)大鼠冠状病毒(Rat coronavirus，RCV)火鸡蓝冠病毒(Turkey bluecomb virus)猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus)可能成员有犬冠状病毒(Canine coronavirus)大鼠涎目腺炎病毒(Sialodacryoadenitis virus of rat)人肠道冠状病毒(Human enteric coronavirus)冠状病毒的理化特征冠状病毒大约60-220纳米直径，外形呈皇冠状，故称为冠状病毒。冠状病毒由单一的核糖核酸(RNA)构成，这种RNA和N蛋白共同组成病毒。其遗传物质是RNA，有三个结构蛋白，属糖蛋白。它的特点是，RNA和RNA之间重组率非常高，出现变异正是由于这种很高的重组率。重组后，RNA变了，其序列发生了变化；蛋白也变了，蛋白的氨基酸序列也变了。
冠状病毒的流行病学到目前为止，大约15种不同冠状病毒株被发现，有些可使人发病，另一些可使牛，猪，鼠，猫，狗和鸟类发病，特别是鸡瘟疫和犬瘟疫。犬瘟疫表现为一种急性胃肠道传染病，其临床特征为腹泻。病原是冠状病毒，主要存在于病犬的胃肠道内，并随粪便排出，污染饲料和周围环境。因此，犬冠状病毒主要经消化道感染。病毒对外界环境的抵抗力较强。粪便中的病毒可存活6～9天，污染物在水中可保持数天的传染性。因此，犬群中一旦发生本病，很难在短时间内控制其流行和传播。病毒对热敏感，紫外线、来苏儿、0.1％过氧乙酸及1％克辽林等都可在短时间内将病毒杀死。
冠状病毒可感染人和家禽、家畜，可引起家禽的传染性支气管炎、鼠肝炎、猪脑脊髓炎、猫传染性腹膜炎等。冠状病毒引起的人类疾病有两类，首先是呼吸道感染，其次是肠道感染。
对冠状病毒的病毒分离工作难度很大，需用人胚脏细胞、气管及鼻粘膜细胞，经器官培养方能分离。增殖病毒亦很困难，也要用上述材料。
该病毒对温度很敏感，33℃生长良好，35℃就受到抑制。由于这个特性，由它引起的疾病流行多发生在冬季和早春季节。
对冠状病毒目前尚无特异的预防和治疗药物。
特异性预防，即针对性预防措施应当是疫苗。疫苗的研制是有可能的，但需要时间较长，解决病毒繁殖问题是其难题。
非特异性预防措施即卫生部已公布的预防春季呼吸道传染病措施，如保暖、洗手、通风、勿过度疲劳及勿接触病人，少去人多的公共场所等。治疗主要是对症治疗。冠状病毒感染在全世界非常普遍，人群中普遍存在冠状病毒抗体，成年人高于儿童。各国报道的人群抗体阳性率不同，我国人群以往冠状病毒中和抗体阳性率在30％至60％。呼吸道冠状病毒感染通过空气飞沫传播，感染高峰在秋冬和早春。有报道认为不同病毒的流行有不同的周期性，一般间隔2至3年流行一次。冠状病毒感染引起的免疫应答较差，再次感染较常见。
冠状病毒的临床特点冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。冠状病毒感染的潜伏期一般为2至5天，平均为3天。典型的冠状病毒感染呈流涕、不适等感冒症状。不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，OC43株引起的症状一般比229E病毒严重。有报道冠状病毒感染可以出现发热、寒战、呕吐等症状。病程一般在1个星期左右，临床过程轻微，没有后遗症。
冠状病毒还可以引起婴儿、新生儿急性肠胃炎，主要症状是水样大便、发热、呕吐，每天10余次，严重者可以出现血水样便。文献报告冠状病毒的感染可以产生以下临床症状1)呼吸系统感染，包括重症急性呼吸系统综合症(SARS)；
2)肠道感染(婴儿偶尔发生)；3)神经系统症状(很少)。
冠状病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷气、接触传染。临床上，多数冠状病毒引起轻度和自愈性疾病，但少数可有神经系统并发症。
2003年4月16日，世界卫生组织正式确认引起SARS的病原体是冠状病毒的一个变种，将其命名为“SARS冠状病毒”。它与流感病毒有亲缘关系，但又非常独特，从前从未在人类身上发现。如前所述，冠状病毒是一类直径为80～220纳米的球状正链RNA囊膜病毒。其囊膜上有形状类似日冕的棘突，故命为冠状病毒。进一步研究表明，囊膜上一般有两种糖蛋白S蛋白，M蛋白。其中S蛋白负责诱导病毒囊膜与宿主细胞膜的膜融合，激发机体产生中和抗体的体液免疫和细胞免疫反应。病毒内包有病毒的遗传物质RNA，长约26～32kb，在所有RNA病毒中是最长的。另有核衣壳蛋白，称为N蛋白，它与病毒RNA的复制和出芽有关。当冠状病毒进入到宿主细胞中，首先翻译合成病毒的RNA聚合酶。在RNA聚合酶的指导下完成病毒感染的早期事件，进而实现病毒的转录、复制、翻译和新病毒的组装。基因组包含了数目不等的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，在各个ORF之间有基因重叠区或基因间隔区。在所有的冠状病毒基因结构中，基因顺序是一致的5′-RNA聚合酶基因-S蛋白基因-E蛋白基因-M蛋白基因-N蛋白基因-3′，SARS冠状病毒也不例外。但此病毒与已知的冠状病毒又有很大的不同。冠状病毒可引起人和许多动物的呼吸道、消化道、肝脏和神经系统产生疾病，根据病毒的血清学特性和核苷酸序列的同源性将冠状病毒分为3群群一包括人呼吸道冠状病毒229E、猪传染性胃肠炎病毒、猫肠道冠状病毒和犬冠状病毒等；群二的成员有人呼吸道冠状病毒OC43、牛冠状病毒、猪凝血性脑脊髓炎病毒等；群三含有禽传染性支气管炎病毒等。将SARS冠状病毒的基因序列与已知的3个病毒群进行比较，并绘制几种重要的结构蛋白的系统进化树，发现SARS病毒与其他群中的任何一个都不紧密相关。
作为一种烈性传染病的病原体的SARS冠状病毒变异很快，研究该病原体的遗传信息、结构和增殖周期对于制备疫苗和设计寻找药物十分重要，也迫切需要诊断用试剂和方法。

发明内容
本发明的发明人测定了一种SARS冠状病毒的病毒株的基因组序列，也提供了这种序列的一些用途。
第一个方面，本发明提供了SARS冠状病毒的基因组序列。从患非典型肺炎死亡的病人的病变组织中提取总RNA，合成cDNA，对SARS冠状病毒的病毒株基因组进行测序，发现该基因组含有的核苷酸数目为29760个，表示在SEQ ID NO1中。在本发明的优先权文件中已经记载了与该序列相比在其5’端缺少15个核苷酸的序列，其中记载的序列共有29745个核苷酸。本发明提供的SARS冠状病毒基因组序列已经收录在GenBank中，Accession No.AY390556[gi41323719]。
对SARS病毒基因组序列的初步分析表明，该病毒至少含有11个开放阅读框(ORFs)，分别编码病毒的刺突蛋白(spike，S)、膜蛋白(membrane，M)、包膜蛋白(envelope，E)和核壳蛋白(nucleocapsid，N)，和一个可产生数个蛋白的orflab。其中S蛋白是一种重要的抗原决定蛋白。在细胞中S和M蛋白插入内质网，同时N蛋白与复制好的RNA相联，然后这一蛋白-RNA复合体连接在M蛋白上一起进入内质网，参见Tin-Yun Ho，Shih-Lu Wu，et al.Antigenicity and receptor-bindingability of recombinant SARS coronavirus spike protein.Biochemical andBiophysical Research Communications 313，2004，938-947。
第二个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括选自a.SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列；b.与SEQ ID NO1所示的序列相比，具有至少90％的序列同源性的天然多核苷酸序列；和，与a)或b)互补的多核苷酸序列。
第三个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸是采用下列引物，以SARS冠状病毒的基因组序列为模板，经过PCR扩增制备的。
第一组引物上游引物5’ACA GGA TCC AAG AAC ATG TTTATT TTC TTA TT 3’，下游引物5’AGA TCT GAA TTC TAT CCA ATAGGA ATG TCG CAC TC 3’；第二组引物上游引物5’ATT GGA TCC ACC ATG GGC TGTCTT ATA GGA GCT GAG C 3’，下游引物5’ATG GAT CCG AAT TCTGGC TGT GCA GTA ATT GAT CT 3’；第三组引物上游引物5’CAA GGA TCC GTT ATG TAC TCATTC GTT TCG 3’，下游引物5’ACA AGA TCT GAA TTC TTT AAGCTC CTC AAC GGT AA 3’；第四组引物上游引物5’ACA GGA TCC ATC ATG GCA GACAAC GGT AC 3’，下游引物5’AAC AGA TCT GAA TTC GCA ATCCTG AAA GTC CTC ATA 3’；第五组引物上游引物5’ATT GGA TCC GTC ATG GAC AATAAC CAG AAT GGA GGA CG 3’，下游引物5’AAC AGA TCT GAATTC ATT CTG CAC AAG AG 3’；第六组引物上游引物5’ACA CCA TGG AAT TCG ACA TGGCTA TTT CAC CGA AG 3’，下游引物5’CAG GTA CCG GAT CCAATA TTG CAG CAG TAC GCA C 3’。
扩增的模板为是具有表示在SEQ ID NO1中的核苷酸序列的分子，例如cDNA分子。扩增方法和条件是本技术领域已知的，可以参考《分子克隆实验指南》(J Sambrook E.F.Fritsch T.Maniatis，Molecular Cloning，a Laboratory Mannual，2nded，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)进行。
第四个方面，本发明提供了分离的多肽片段，该分离的多肽片段是由本发明的第一个方面的SARS冠状病毒的基因组序列的多核苷酸编码的，也即SEQ ID NO1所示核酸序列编码的多肽。
第五个方面，本发明提供了分离的多肽片段，该分离的多肽片段是由本发明第三个方面所述的分离的多核苷酸编码的。
第六个方面，本发明提供了分离的多核苷酸，它们是与本发明第三个方面所述的分离的多核苷酸具有至少90％的序列同源性的天然多核苷酸序列。
第七个方面，本发明提供了分离的多肽片段，它们是与本发明第四个方面所述的分离的多肽片段具有至少90％的序列同源性的天然多多肽序列。
第八个方面，本发明提供了与本发明中所述的分离的多肽片段能够特异性结合的抗体。在一个实施方案中，这些抗体是单克隆抗体。
第九个方面，本发明提供了含有本发明中所述的分离多核苷酸和多肽片段和药学上可以接受的载体的药物组合物。
第十个方面，本发明提供了含有本发明中所述的分离多核苷酸的检测试剂盒。
第十一个方面，本发明提供了含有本发明中所述的分离多核苷酸的重组腺病毒。
第十二个方面，本发明提供了含有上述第十一个方面所述的重组腺病毒的疫苗。
上述方面是本发明的简要概括，本发明并不限于这些。本发明的其他部分的说明，以及在不背离本发明精神和实质，或者在利用本发明进行的简单修改和改进在本发明的范围之内。
在本发明的一个实施方案中，发现了六个片段编码的多肽或者蛋白可以在体内激发针对SARS冠状病毒的免疫反应，所以将这些片段可以作为DNA疫苗使用。它们是本发明第三个方面中利用六组引物，以SARS冠状病毒的基因组序列为模板，经过PCR扩增制备的多核苷酸，分别记作SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6和SEQ ID No7。
对于本发明所述的DNA疫苗，其中SEQ ID NO1的核苷酸序列，也可以包括与该核苷酸序列的同源性大于90％的序列，优选是包括选自SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ IDNo6和SEQ ID No7的核酸片段或者与其同源性大于90％的核酸片段。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种蛋白质疫苗，该疫苗含有将SEQ ID NO1的核苷酸序列进行表达所得到大多肽或者蛋白质片段。
发明人认识到SEQ ID NO1所编码的产物具有免疫源性，具有一定的生物活性，具有应用价值。在本发明中，采用任何读码方式，从SEQ ID NO1所得到的翻译产物均在本发明范围之内。对SEQ ID NO1所揭示的序列，在翻译中，可以阅读部分序列，阅读的起点可以不同，所得到的产物均在本发明之内。将对应于SEQ ID NO1全长的氨基酸序列记为SEQ ID NO8。
本发明包括分离的多肽序列，包含选自下列氨基酸序列a)SEQ ID NO8的氨基酸序列；b)具有至少90％的序列与SEQ ID NO8的氨基酸序列相同的天然氨基酸序列；c)SEQ ID NO8的氨基酸序列中的生物活性片段；和d)SEQ ID NO8的氨基酸序列中的免疫原性片段。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种蛋白质疫苗，其中含有序列SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQID No6和SEQ ID No7所编码的蛋白质，将这些蛋白质中的氨基酸序列分别表示为SEQ ID No9、SEQ ID No10、SEQ ID No11、SEQ ID No12、SEQ ID No13和SEQ ID No14。
在又一个实施方案中，是基于SEQ ID No1所设计的DNA片段或者RNA片段，它们可以作为诊断用探针，也可以作为基因芯片的组成部分使用。更进一步而言，或是治疗用分子，比如反义RNA分子，其与本发明公开的SARS病毒全基因组序列相同或者具有互补性，也可以与本发明公开基因组序列部分相同或者互补，比如在SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ ID No6和SEQ IDNo7中所表示的片段。依据本发明的基因组信息设计可以与其结合从而阻止SARS病毒的复制、转录或者翻译过程的各种核酸分子或其片段，以及将设计的核酸分子或其片段插入各种载体进行表达或者直接使用均包括在本发明之中。
在一个实施方案中，本发明所述核苷酸序列被插入载体中。载体的种类不加限制。载体可以导入宿主细胞中，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。进一步而言，宿主细胞表达SARS病毒的有关蛋白质。核酸探针，包含至少15个核苷酸，可与含有SEQ ID No1所列的核苷酸序列的核酸序列进行特异杂交。
进一步而言，本发明的核酸探针可以用可探测标记进行标记，可以用于SARS感染的检测，提高了检测的灵敏性。
本发明的基因组测序将有助于人类和潜在的动物宿主中的SARS病毒感染的诊断(使用PCR和免疫试验)，有助于抗病毒药物的开发(包括中和抗体)，并且有助于鉴定用于疫苗开发的推定的抗原决定簇。基因组信息也有助于制备基因芯片，用于检测和诊断。
本发明还尤其提供了SARS冠状病毒的基因组序列中的特有的含有29个核苷酸的序列，即SEQ ID No1中的第27891位到第27919位的核苷酸序列，命名为SEQ ID No15，其序列如下CCTACTGGTTACCAACCTGAATGGAATAT以该序列为基础，可以制备用于检测的试剂盒等。
本发明提供的技术方案总结如下1.一种分离的多核苷酸，选自下述序列a.SEQ ID NO1的多核苷酸序列；b.具有至少90％的序列与SEQ ID NO1的序列相同的天然多核苷酸序列；和，a)或b)互补的多核苷酸序列。
2.一种分离的多核苷酸序列，编码包含一段选自下列氨基酸序列的多肽a.SEQ ID NO8；b.具有至少90％的序列与SEQ ID NO8的氨基酸序列相同的天然氨基酸序列；c.SEQ ID NO8的氨基酸序列中的生物活性片段；和，d.SEQ ID NO8的氨基酸序列中的免疫原性片段。
3.一种分离的多核苷酸，选自a.选自SEQ ID NO2-7的多核苷酸序列；b.具有至少90％的序列与选自SEQ ID NO2-7的序列相同的天然多核苷酸序列；和，c.与a)或b)互补的多核苷酸序列。
4.一种分离的多肽序列，包含选自下列氨基酸序列a.SEQ ID NO8的氨基酸序列；b.具有至少90％的序列与SEQ ID NO8的氨基酸序列相同的天然氨基酸序列；c.SEQ ID NO8的氨基酸序列中的生物活性片段；和，d.SEQ ID NO8的氨基酸序列中的免疫原性片段。
5.一种能够对SARS病毒产生免疫反应的分离的多肽片段，选自a.选自SEQ ID NO9-14的多核苷酸序列；b.具有至少90％的序列与选自SEQ ID NO9-14的序列相同的天然多核苷酸序列。
6.一种能与上述第4项所述的多肽特异结合的分离抗体。
7.一种能与上述第5项所述的多肽特异结合的分离抗体。
8.上述第6项中的分离抗体是单克隆抗体。
9.上述第7项中的分离抗体是单克隆抗体。
10.一种药物组合物，含有有效量的上述第4项所述的多肽，和药学上可接受的载体。
11.一种药物组合物，含有有效量的上述第5项所述的多肽，和药学上可接受的载体。
12.一种药物组合物，含有有效量的上述第1项所述的多核苷酸，和药学上可接受的载体。
13.一种药物组合物，含有有效量的上述第2项所述的多核苷酸，和药学上可接受的载体。
14.一种药物组合物，含有有效量的上述第3项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
15.一种药物组合物，含有与药学上可接受的载体相结合的上述第6项所述的抗体。
16.一种药物组合物，含有与药学上可接受的载体相结合的上述第7项所述的抗体。
17.一种药物组合物，含有与药学上可接受的载体相结合的上述第8项所述的抗体。
18.一种药物组合物，含有与药学上可接受的载体相结合的上述第9项所述的抗体。
19.一种用于检测样品中SARS病毒存在的诊断试剂盒，含有上述第1项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
20.一种用于检测样品中SARS病毒存在的诊断试剂盒，含有上述第2项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
21.一种用于检测样品中SARS病毒存在的诊断试剂盒，含有上述第3项所述的多核苷酸和药学上可接受的载体。
22.一种用于检测样品中SARS病毒存在的探针，含有至少20个连续多核苷酸，该序列与样品中的SARS病毒多核苷酸序列互补，所述探针在该探针与SARS病毒多核苷酸之间形成杂交复合体的条件下，特异性与SARS病毒多核苷酸杂交。
23.一种用于检测样品中SARS病毒存在的探针，含有SEQ IDNO15的多核苷酸序列。
24.一种检验样品中SARS病毒的多核苷酸的方法，所述SARS病毒多核苷酸具有上述第1项所述的多核苷酸序列，该方法包括a.用探针杂交样品，此探针含有至少20个连续多核苷酸，包含与样品中的SARS病毒多核苷酸序列互补的序列，所述探针在该探针与SARS病毒多核苷酸之间形成杂交复合体的条件下，特异性与SARS病毒多核苷酸杂交；和，b.检测所述杂交复合体存在与否，如果存在，可选择性检测所述杂交复合体的量。
25.一种检验样品中SARS病毒的多核苷酸的方法，所述SARS病毒多核苷酸具有上述第2项所述的多核苷酸序列，该方法包括a.用探针杂交样品，此探针含有至少20个连续多核苷酸，包含与样品中的SARS病毒多核苷酸序列互补的序列，所述探针在该探针与SARS病毒多核苷酸之间形成杂交复合体的条件下，特异性与SARS病毒多核苷酸杂交；和，b.检测所述杂交复合体存在与否，如果存在，可选择性检测所述杂交复合体的量。
26.一种检验样品中SARS病毒的多核苷酸的方法，所述SARS病毒多核苷酸具有上述第3项所述的多核苷酸序列，该方法包括a.用探针杂交样品，此探针含有至少20个连续多核苷酸，包含与样品中的SARS病毒多核苷酸序列互补的序列，所述探针在该探针与SARS病毒多核苷酸之间形成杂交复合体的条件下，特异性与SARS病毒多核苷酸杂交；和，b.检测所述杂交复合体存在与否，如果存在，可选择性检测所述杂交复合体的量。
27.上面第24项所述的方法，其中探针含有至少30个连续的核苷酸。
28.上面第25项所述的方法，其中探针含有至少30个连续的核苷酸。
29.上面第26项所述的方法，其中探针含有至少30个连续的核苷酸。
30.上面第24项所述的方法，其中探针含有至少50个连续的核苷酸。
31.上面第25项所述的方法，其中探针含有至少50个连续的核苷酸。
32.上面第26项所述的方法，其中探针含有至少50个连续的核苷酸。
33.一种检测生物样品中编码SARS病毒蛋白质的多核苷酸的方法，包括以下步骤a.上述第1项的多核苷酸与生物样品中的核酸物质杂交，形成杂交复合体；和，b.检测所述杂交复合体，其中所述杂交复合体的存在与所述生物样品中编码SARS病毒蛋白质的多核苷酸的存在相关。
34.一种检测生物样品中编码SARS病毒蛋白质的多核苷酸的方法，包括以下步骤a.上述第2项所述的多核苷酸与生物样品中的核酸物质杂交，形成杂交复合体；和，b.检测所述杂交复合体，其中所述杂交复合体的存在与编码所述生物样品中SARS病毒蛋白质的多核苷酸的存在相关。
35.一种检测生物样品中编码SARS病毒蛋白质的多核苷酸的方法，包括以下步骤a.上述第3项所述的多核苷酸与生物样品中的核酸物质杂交，形成杂交复合体；和，b.检测所述杂交复合体，其中所述杂交复合体的存在与编码所述生物样品中SARS病毒蛋白质的多核苷酸的存在相关。
36.一种有效抵抗人SARS病毒感染的疫苗，包含具有选自SEQ IDNO1-7的序列的肽，和药学上可接受的载体。
37.一种有效抵抗人SARS病毒感染的疫苗，包含具有选自SEQ IDNO8-14的序列的肽，和药学上可接受的载体。
38.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；和b.至少一个多肽片段，选自刺突蛋白、小膜蛋白、小包膜蛋白和核衣壳蛋白。
39.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；和b.两个多肽片段，选自刺突蛋白、小膜蛋白、小包膜蛋白和核衣壳蛋白。
40.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；和b.三个多肽片段，选自刺突蛋白、小膜蛋白、小包膜蛋白和核衣壳蛋白。
41.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；和b.多个多肽片段，选自刺突蛋白、小膜蛋白、小包膜蛋白和核衣壳蛋白。
42.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；b.SARS病毒的刺突蛋白；和c.小包膜蛋白。
43.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；b.SARS病毒的刺突蛋白；和c.小膜蛋白。
44.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；b.SARS病毒的刺突蛋白；c.小膜蛋白；和d.小包膜蛋白。
45.一种表达SARS病毒蛋白质的重组腺病毒，包括a.腺病毒，其中它的序列中负责复制的部分已被删除，因此裂解此腺病毒不能复制它自身；b.小包膜蛋白；
c.小膜蛋白；和d.核衣壳蛋白。
46.一种SARS疫苗，含有上述第38项所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
47.一种SARS疫苗，含有上述第39项所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
48.一种SARS疫苗，含有上述第40项所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
49.一种SARS疫苗，含有上述第41项所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
50.一种SARS疫苗，含有上述第42项所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
51.一种SARS疫苗，含有上述第43所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
52.一种SARS疫苗，含有上述第44所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
53.一种SARS疫苗，含有上述第45所述的重组腺病毒，和药学上可接受的载体。
54.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第46项所述的疫苗。
55.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第47项所述的疫苗。
56.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第48项所述的疫苗。
57.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第49项所述的疫苗。
58.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第50项所述的疫苗。
59.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第51项所述的疫苗。
60.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第52项所述的疫苗。
61.一种调节针对人SARS病毒感染的免疫反应的方法，包含施用有效量的上述第53项所述的疫苗。
62.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第46项所述的疫苗。
63.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第47项所述的疫苗。
64.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第48项所述的疫苗。
65.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第49项所述的疫苗。
66.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第50项所述的疫苗。
67.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第51项所述的疫苗。
68.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第52项所述的疫苗。
69.一种免疫受试者抵抗SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第53项所述的疫苗。
70.上述第62项所述的方法，其中所述受试者是人类。
71.上述第63项所述的方法，其中所述受试者是人类。
72.上述第64项所述的方法，其中所述受试者是人类。
73.上述第65项所述的方法，其中所述受试者是人类。
74.上述第66项所述的方法，其中所述受试者是人类。
75.上述第67项所述的方法，其中所述受试者是人类。
76.上述第68项所述的方法，其中所述受试者是人类。
77.上述第69项所述的方法，其中所述受试者是人类。
78.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第46项所述的疫苗。
79.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第47项所述的疫苗。
80.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第48项所述的疫苗。
81.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第49项所述的疫苗。
82.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第50项所述的疫苗。
83.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第51项所述的疫苗。
84.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第52项所述的疫苗。
85.一种治疗受试者SARS病毒感染的方法，包含给所述受试者施用上述第53项所述的疫苗。
86.上述第78项所述的方法，其中所述受试者是人类。
87.上述第79项所述的方法，其中所述受试者是人类。
88.上述第80项所述的方法，其中所述受试者是人类。
89.上述第81项所述的方法，其中所述受试者是人类。
90.上述第82项所述的方法，其中所述受试者是人类。
91.上述第83项所述的方法，其中所述受试者是人类。
92.上述第84项所述的方法，其中所述受试者是人类。
93.上述第85项所述的方法，其中所述受试者是人类。
发明详述本发明的发明人对在2003年1月31日并死亡于2003年2月10日的SARS患者进行了第一例尸解病理研究，确定死亡原因，并进行病原学研究。方法对非典型肺炎死亡病人进行尸体解剖，病变组织进行超薄切片电镜观察，对病变组织抽提总RNA合成cDNA，并测定SARS冠状病毒全基因组序列。结果尸解检查观察到肺组织广泛性实变，肺水肿，肺出血，肺灶性出血性梗死。病变肺组织超薄切片电镜观察到病毒颗粒存在于II型肺泡上皮细胞内。序列测定检出完整的SARS冠状病毒全基因组序列(序列命名为GZ02102003)，即本发明中SEQ IDNO1中所揭示的序列。
发明人所进行的上述研究的详细情况如下1.1病人死者女，62岁，广州市居民，2003年1月31日开始发热，流涕，咽痛，咳嗽，2月4日因病情加重，出现呼吸困难等症状，诊断为非典型肺炎随即转院至广州市第八人民医院救治，病情未见好转，呼吸困难进一步加重，于2003年2月10日0点15分因呼吸心跳停止死亡。我们于第二天(2003年2月11日)15点在第一军医大学南方医院对尸体进行了病理学解剖。
1.2电镜检查将肺组织用1％锇酸固定30分钟，PBS洗涤后用梯度丙酮脱水，环氧树脂包埋。超薄切片后用铀铅双重染色，电镜观察。
1.3病毒全序列测定与分析1.3.1总RNA的提取使用美国Invitrogen公司TRIZOL Reagent试剂盒。参照试剂盒使用说明进行。
1.3.2cDNA合成和全序列测定用ThermoScript(Invitrogen，USA)和随机引物合成cDNA。根据已公开的SARS冠状病毒全序列设计覆盖SARS病毒全基因的PCR引物，每对PCR引物扩增约1kb长的产物，相邻引物对有约200碱基长的重叠区。PCR反应为39个循环25ul总体积，反应条件为前14个循环退火温度每循环下降0.5℃。PCR产物的测序使用ABI Big Dye Terminator试剂在ABI377机器上进行。所测定序列的组合使用源于University of Washington的“Phred，Phrapand Consed”程序。
结果2.1大体解剖 肺组织广泛性实变(尤以左肺上叶下部，下叶，右肺全肺为重)肺水肿，肺出血，肺灶性出血性梗死。病变的肺组织呈脱屑性间质性肺炎改变，实变的肺泡腔内充满大量脱落和增生的肺泡上皮、水肿液、肺泡隔及肺泡腔内见数量不等的单核巨噬细胞及淋巴细胞浸润，部分肺泡腔内、胸膜可见中性粒细胞浸润。双肺肺泡腔内广泛性透明膜形成伴局灶性肺泡壁坏死。部分肺泡上皮内检见病毒包涵体。肺支气管上皮脱落，部分小支气管壁内及周围见有淋巴细胞、单核细胞及中性粒细胞浸润。肺间质充血，出血，毛细血管扩张，腔内含单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，肺间质小动脉及小静脉内皮细胞肿胀、增生，内皮下水肿，血管中膜及外膜可见单核细胞及淋巴细胞浸润，部分小血管内可见透明血栓。肺门淋巴结内血管高度扩张充血，皮、髓质分界不清，副皮质区有较多的单核样细胞，髓质内淋巴组织减少。胸腔积血200ml，肺动脉主干血栓形成。
2.2电镜检查电镜结果显示，在II型肺泡上皮细胞内可见冠状病毒样颗粒(见

图1)。
2.3序列测定与分析发明人测定的SARS冠状病毒序列全长为29760个碱基，命名为GZ02102003，以指明该序列是从一位死亡于2003年2月10日的患者肺组织标本中检出。经与GeneBank上登录的其它SARS冠状病毒全序列进行比对(至2003年6月6日止，共有17条SARS冠状病毒全序列登录在GeneBank上，其中序列ZJ01有多处明显错误，不能完成序列比对)，发现该序列除存在少量的SNP外，多出一段29个核苷酸序列(CCTACTGGTTACCAACCTGAATGGAATAT)，序列比较结果参见表一.17株SARS冠状病毒全序列比较。这29个核苷酸序列的存在完全改变了ORF10和ORF11的蛋白编码框，并且也存在于果子狸SARS病毒中，而从2003年3月后发病的病人体内检出的SARS冠状病毒均丢失了上述的29个核苷酸序列，显示这一株从1月份发病的患者体内分离测定的SARS冠状病毒与果子狸SARS冠状病毒存在高度的关联性。据此，发明人相信人类所感染的SARS病毒来源于果子狸。
表一.17株SARS冠状病毒全序列比较备注表一中仅表示出非同义变异。每一个核苷酸的位置是以TOR2SARS-CoV序列为基础表示。氨基酸取代，相应蛋白质或者开放阅读框也表示出来。
473 494 502 509 652 937 1180 1206 1384 1476 2601 3165 3274 3326 3626 4220 4250 4876 4952 5251 5427 5547 5591 5594 5681TOR2 T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGCUHK-SU10 T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGSIN2748T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGSIN2500T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGHKU-39849 T T A G G A GTCACAATTATTTCAAAAGUrbani T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGTW1T T A G G A GTCATGATTATTTCAAAAGSIN2677T T A G G A GTCGTAATTATTTCAAAAGSIN2774T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGZJ01 G A T G G A GTMATAATTATTTCAAAAGSIN2679T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGBJ01 T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGBJ03 T T A G G A GTCATACTTATTTCCCCCGBJ02 T T A G G A GTCATAATTATTACAAAATBJ04 T T A G G A TTCATAATTATTTCAAAAGCUHK-W1T T A G G A GTCATAATTATTTCAAAAGGZ02102003 T T A T G A GCCATAACCGTTTAAAAAG
6148 6612 6929 7643 7665 7702 7731 7746 7919 7930 7954 8387 8417 8502 8559 8562 8573 8816 8947 9096 9177 9332 9333 9405 9480 9855T G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C A T C C T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G T G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G A A A A G C G T G G T T A G C T C T C T T T CT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T CT G G C T C C G C G T G G T T T C T C T T C C T TT G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C C T TT G G C T C C G C G T G G T T T C T C T T C C T TA G G C T C C G C G T G G T T G C T C T T C T T TT G G C T C C T C G T G G T T G C T C T T C C C CT T A C T C C G C G T G G G C G T A T C T C C C C
10030 10324 10551 10588 10729 11492 11718 11972 11975 12151 12518 12519 12983 12989 12996 13027 13029 13388 13464 13476 13499G A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A AG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A A C A A G A T C A C G A G C T T A TG A A A C T A G A T A T A C C A TG A A C C T A G A T A T A C C A TG A A A C T A A A T A T A C C A TG A G A C T A G T T A T A C C A TG A A A A T C G A T A T A C C A TG A A A C T A G A T A T A C C A TA A A A C T A G A T A T A C C A T
13500 14043 14997 15540 15573 16628 17137 17499 17540 17570 17804 17852 18070 18182 18288 18971 19070 19090 19844 20369 20454T T A A C T C T T C C G C C T A C A G GT T A A C T C T T C T G C C T A C A G GT T A A C T C T T C C G C C T A T A G GT T A A C T C T T C C G C C T A T A G GG T A A C T C T T C C A C C T A C A G GT T A A T T C T T C C G C C T G C A G GT T A A C T C T T C C G C C T A C A G GT T A A C T C T T C C G C C T A T A G GT T A A C T C T T C C G C C A A T A G GT A T -T C T T A T C C G C C T A C A G GT T A A C T C T T C C G C A T A C A G GT T A A C T C T G C C G C C T A C G G GT T A A C T C T G C C G C C T A C G T GT T A A C T C T G T C G C C T A C G G GT T A A C T C T G C C G C C T A C G G GT T A A C T C T G C T G C C T G C A G GT T A A C C C T G C C G C C T A C A G G
20462 20710 20787 20846 20854 20864 20900 20975 20998 20178 21245 21293 21339 21485 21494 21644 21680 21727 21297 22151 22213T G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT N A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A A A T CT G A G A A C T G C A C A C G A A A C T CT G C G A C C T G G A C A C A C A A A T CT G A G C A C T G G C C C C G A C G A T CT G A G A A C T G G A C A C G A A A A T CT G A A A A C T A G A C A T G A A A A C T
22228 22428 22523 22528 22595 22999 23180 23226 23798 23829 23877 24075 24078 24499 24572 24878 24984 25304 25305 25575 25679T G A A C T C G C T C G A G T T A A G T AT G A A C T C T C T C G A G T T A G G T AT G A A C T C T C T C G A G T T A G G T AT G A A C T C T C T C G A G T T A G G T AT G A A C T C T C T C G A G T T A G G A AT G A A C T C T C T C G A G T C A G G T AT G A A C T C T C T C G A G T T A G G T AT G A A C T C T C T C G A G T T A G G T AT G A A C T C T T T C G A G T T A G G T AT G A A T T C T C T C G A G T T A G G T AT G A A C T T T C T C G A G T T A G G T AC G A A C T C T C T C G A G T T A G G T CC G A A C T C T C T C C C G T T A G A T AC A G A C T C T C T C G A G T T A G A T AC G A A C T C T C T C G A T T T A G G T AC G A A C T C T C T C G A G T T A G G T AC A G G C T C T C G C G A G C T G G G T A
25785 25850 25990 2603 26056 26192 26434 26483 26592 26606 26863 27117 27249 27749 27789-27944 27817-27821 27834A A C T A G G T T C T A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G G T C T A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T C T A C AAACTT - TA A C T A G A T T C T A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T T T A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T C C A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T C T A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T C T G C - CTCTA TA A C T A G G T T C T A C AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T C T A C A AAACTT CTCTA TA A C T A G G T T C T A C AAACTT CTCTA TA A C T C G G T T C T A T AAACTT CTCTA CA A C T C G G T T C T A T AAACTT CTCTA CA A T T A G G T T C T A T AAACTT CTCTA CA A C T A G G T T C T A T AAACTT CTCTA CA A C T A G G T T C T A C AAACTT CTCTA CC T C A A G G T C C T A C AAACTT CTCTA C
27891-2791928125 28509 28574 28575 28615 28732 29283C A T G A G GC A T G A T GC A T G A G GC A T G A G GC A T G A G GC A T G A G GC A T G A G GC A T G A G GC A G A A G GC - T G A G GC A T G A G GC A T G A G GC A T G T G GC A T G A G GC A T G A G GC A T G A G GCCTACTGGTTACCAACCTGAATGGAATAT T A T G A G A

序列分析的一个重要结果是GZ02102003所独有的29个碱基改变了ORF10和11的氨基酸编码，结果如图2A和图2B所示。
发明人的方法的独特之处在于采用从该病人的尸解病变肺组织标本中直接建构总cDNA并用SNP测序方法测定SARS冠状病毒的全序列。
本研究最重要的发现在于检测到为这一病人所携带的SARS冠状病毒株所独有的29个核苷酸序列(CCTACTGGTTACCAACCTGAATGGAATAT，见表1)。这一发现的重要意义在于以下三个事实1)这一段序列仅存在于发明人目前所能找到的最早的SARS死亡病人标本中，其它完成全序列测定的SARS冠状病毒均来源于2003年3月份以后发病的病人且无一例外的丢失了这一段序列(见表1)。2)这一段序列的存在完全改变了ORE10和11(见图2A和图2B)。3)这一段序列同时存在于从野生动物果子狸体内分离到SARS冠状病毒。所以我们认为这段序列从果子狸到人体以及在人体上随时间的迁移规律使得我们有理由相信人类所感染的SARS病毒来源于果子狸。
附图简述图1是病变肺组织超薄切片电镜观察。
图2A是ORF10和图2B是ORF11比较。
图3是PCR终产物。DNA Marker从下到上依次为1.100bp；2.250bp；3.500bp；4.750bp；5.1000bp；6.2000bp；7.2500bp；8.5000bp；9.7500bp；10.10000bp；11.15000bp。PCR片段从左到右依次为S全长；S1片段；S2片段；E蛋白；M蛋白；N蛋白；PXN片段。
图4质粒pMD18-T(由Takara公司提供)。
图5S1、S2、E、M、N、和X2的pMD18-T克隆图谱。
图6pcDNA3.1(+)/(-)图谱。
图7酶切确认pcDNA3.1(+)/(-)(S1、S2、E、M、N和X2)克隆。
图8A-8D是本发明的部分核苷酸序列的抗原性实验结果。图8A中是只表达S蛋白(刺突蛋白)的腺病毒载体，S1。图8B中是表达S蛋白和E蛋白的腺病毒载体，S2。图8C中是表达S蛋白，M蛋白和E蛋白的腺病毒载体，S3G。图8D中是表达E蛋白，M蛋白和N蛋白的腺病毒载体，S3N。
图9是本发明的部分核苷酸序列的抗原性实验结果。实验采用表达S蛋白，M蛋白和E蛋白的腺病毒载体，即S3G作为疫苗进行；用PBS作为对照。
具体实施例方式
下面以实施例的方式对本发明进行说明，但是正如本技术领域的技术人员所理解的那样，这些实施例仅仅用于说明本发明而不是为了限定本发明。本发明仅仅受所附权利要求的限制。
实施例1.SARS病毒基因片段的获取SARS病毒RNA提取1.1材料1.1.2含SARS病毒的肺组织取自广东省一位因感染SARS而死亡的女患者。
1.2.3TRIZOL Reagent购自GIBCOBRL公司，为总RNA提取试剂盒。
1.2方法1.2.1取冻存于-80℃冰箱中的患者肺组织约100mg，置于洁净的玻璃研钵中研碎。
1.2.2取出1ml TRIZOL试剂置于玻璃研钵中，轻轻吹打，使研碎的肺组织溶于TRIZOL试剂后，用1.5ml离心管收集。
1.2.3将离心管置于室温中5分钟，向离心管中加入0.2ml氯仿，用手剧烈振摇后，再将离心管置于室温中3分钟。
1.2.4 4℃离心15分钟，12000g/分钟。
1.2.5收集离心后含RNA的上层水相，加入0.5ml异丙醇，室温放置15分钟。
1.2.6 4℃离心10分钟，12000g/分钟。
1.2.7去掉上清，用75％的乙醇洗涤RNA沉淀物一次。
1.2.8待RNA沉淀物在空气中晾至微干后，加入50ml无RNA酶污染的无菌水溶解。
cDNA合成2.1材料2.1.1 cDNA合成试剂盒RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1，购自宝生物公司。
2.1.2 SARS RNA由南方医院感染内科提取。
2.2方法2.2.1反应混合物MgCl4.0μl缓冲液 2.0μldNTP2.0μlRNAase抑制剂0.5μlRandom引物 1.0μlOrligo dT引物 1.0μlRNA模板 1.0μlTranscriptase酶 1.0μl水 7.5μl2.2.2反应程序第1步37℃孵育50分钟第2步50℃孵育2分钟第3步37℃孵育5分钟第4步重复第2步、第3步5次第5步95℃孵育3分钟PCR扩增3.1材料3.1.1 PCR试剂盒KaTaRa Ex Taq，购自宝生物公司3.1.2 cDNA由本公司自行合成3.2方法3.2.1反应混合物10X Ex Taq缓冲液1.0μl
dNTP混合物 0.8μlcDNA模板 1.0μl随机引物 0.5μl随机引物 0.5μlTaq酶0.05μl水 6.15μl3.2.2反应程序第1步94℃孵育3分钟第2步94℃孵育30秒钟第3步58℃孵育20秒钟第4步72℃孵育40秒钟(注根据扩增片段的分子量大小，孵育时间从40秒到4分钟不等。)第5步重复第2步、第3步和第4步34次第6步72℃孵育5分钟。
结果见图3中。
实施例2.SARS病毒相关抗原基因片段的克隆一、6个抗原基因片段的PCR扩增所有的PCR引物(见表二)在设计时都带有ATG(start codon)，并且所有的PCR产物都在3’末端有终止子(stop codon)，这样就使得所有的片段在克隆到相关的载体后得到有效的表达。这些引物由华大基因上海鼎安生物科技有限公司合成，分别按每个OD用200ul的minipore无菌水溶解后，再稀释5倍后当成工作浓度，在PCR反应时按10X使用。
用Takara公司提供的PCR试剂盒，PCR的模板为(pGEM T Easyclones)相应pGEM-T Easy的克隆。PCR反应的条件1/10体积的两个引物，10～50ng的模板，dNTP，1/10体积的10倍PCR缓冲液，2个单位的Taq酶，加无菌水至工作体积(10到25ul)，PCR的程序为94℃4分钟，然后94℃30秒-58℃30秒-72℃2分钟30秒的30个循环，之后再一个72℃10分钟。所做的PCR反应均用Eppendorf公司的PCR机器进行。
所得的PCR终产物如图3所示。
二、6个抗原基因片段pMD18-T克隆的构建用Qiagen公司提供的PCR Purification Kit将以上所得的PCR产物分别纯化，继而与pMD18-T(Takara公司的TA克隆载体，见图4)按2∶1到5∶1范围的摩尔浓度比、10到20ul的总体积、单位连接酶来进行连接，之后转化到DH5α的感受态细胞，继而在有100ug/mlAmpicillin和IPTG/X-gal的LB培养基上挑选白色的菌落，分别将这些菌落用4mlLB(100ug/ml Ampicillin)培养后提取质粒(用Qiagen公司的miniprep extraction kit)，继而进一步酶切(用BamHI和EcoRI来切S1、S2、E、M和N克隆，用KpnI和EcoRI来切X2克隆)来确定所得的克隆是否带有正确大小的插入片段(见图5)。然后将有正确大小插入片段的克隆送到华大基因上海鼎安生物科技有限公司进行插入片段的测序，最终确定克隆片段的正确与否。
三、6个抗原基因片段pcDNA3.1克隆的构建测序确证后的S1、S2、E、M和N等5个pMD18-T克隆，分别用BamHI和EcoRI酶切后，将样品跑电泳将插入的克隆片段和pMD18-T分离开，并用Qiagen公司的gel extraction kit来分离纯化相应的插入片段S1、S2、E、M和N，最后将这些片段分别克隆到BamHI和EcoRI酶切并纯化后的pcDNA3.1(+)(见图6)载体；而X2pMD18-T克隆则用EcoRI和KpnI来进行酶切，继而克隆到用EcoRI和KpnI来酶切并纯化后的pcDNA3.1(-)(见图6)载体上。所得到的这些重组的pcDNA3.1(+)/(-)(S1、S2、E、M、N和X2)克隆(见图7)将作为DNA疫苗可能的候选，进行动物的试验来检验。
表二PCR引物及相应的PCR反应的模板和对应的PCR产物

表三、6个片段克隆的设计

实施例3.编码SARS冠状病毒(CoV-SARS)的E蛋白、M蛋白、S蛋白、X蛋白和N蛋白的核苷酸序列的抗原性，用小鼠作实验为了有效地控制SARS的发生发展，对该病毒疫苗的研究显得尤为重要。相对于常规的减毒、灭活疫苗来说目前为止，DNA疫苗的优势是比较显著的，这种创新疫苗产品没有免疫原性，而且具有多效性，免疫作用时间长，制造和使用方便，贮藏运动简单，生产成本较低。对于有可能发生的DNA疫苗质粒整合到动物基因组中的现象目前也未见报导。
复合腺病毒载体系统被用于测定编码小包膜蛋白(E)、小膜蛋白(M)、刺突蛋白(Spike)或糖蛋白(S)和核壳蛋白(N)的核苷酸序列的抗原性。所有的腺病毒载体都含有E3和所有E4 ORF6缺失，除了ORF6之外。
本发明提供的DNA疫苗是以复合腺病毒载体系统为载体。在其中插入编码SARS病毒蛋白S的基因片段而构建成S1疫苗，在其中插入编码SARS病毒蛋白S和E的基因片段而构建成S2疫苗，插入编码E、M和N蛋白的基因片段而构建成S3N疫苗，在其中插入编码S、E和M蛋白的基因片段而构建成S3G疫苗。
用上述疫苗在小鼠中进行实验，每个候选疫苗按照108thpfu的剂量注射一组小鼠(6只)。接种后，每两周取血样一次。用ELISA检测S蛋白、E蛋白的抗体。
实验结果表示在图8A-8D中，其中S1是只表达刺突蛋白的复合腺病毒载体(图8A)；S2是表达S蛋白和E蛋白的所述载体(图8B)；S3G是表达S蛋白、M蛋白和E蛋白的所述载体(图8C)；S3N是表达E蛋白、M蛋白和N蛋白的所述载体(图8D)。S2裂解液是表达S蛋白和E蛋白的破裂的细胞。此细胞是转染了表达S蛋白和E蛋白的载体的人A549肺癌细胞。该细胞基质作为免疫目标，用于包被ELISA板的孔。HC4裂解液含有无关的抗原，用作对照。
实施例4.S3N疫苗在小鼠中的重复实验采用前述方法制备的S3N疫苗进行重复实验，以腹腔注射的接种途径进行。
实验材料1.本实验所用的动物为C57小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，养于本实验室动物房，12小时昼夜交替。小鼠雌雄各半，8周大小，首次取血时体重介于19g和29g之间。
2.SARS IgG抗体ELISA检测盒购于北京华大吉比爱生物技术有限公司。
实验方法1.动物实验过程1)给药C57小鼠，8周大小，分2组，每组十个。各组于0周和8周分别腹腔注射疫苗S3N和PBS对照。S3N疫苗溶于PBS，至浓度为108pfu/ml PBS，每只小鼠注射0.5ml。
2)血清制备分别于0周(注射前)、2周、4周、6周、8周(注射前)、10周、12周和16周，眼眶取血约100μl，血样室温静置1小时，离心制取血清，血清样品存于-20℃待测。
3)血清中SARS抗体检测本实验运用的抗SARS抗体ELISA检测技术是在北京华大吉比爱生物技术有限公司生产的ELISA检测试剂盒的基础上进行修改Himani Bisht，Anjeanette Roberts，et al.Severe acute respiratorysyndrome coronavirus spike protein expressed by attenuated vacciniavirus protectively immunizes mice.PNAS April 27，2004，vol.101 no.17 6641-6646；黄文林，刘然义，黄必军，黄嘉凌。携带Spike基因片段的重组腺病毒的构建及其诱导抗SARS-CoV免疫反应。
2.具体步骤a.试剂盒的每个试验孔和溶于PBS(pH7.5)的5％BSA在37℃环境中孵育60分钟。
b.用试剂盒所带洗液洗板5次后，加入倍比稀释的血清样品(1/50稀释起)和阴阳性对照物，37℃孵育60分钟。
c.用试剂盒所带洗液洗板5次后，各孔加入下列混合物0.5μg/ml羊抗鼠IgG-HRP+0.2％tween20+1％BSA溶于PBS，37℃孵育60分钟。
d.用试剂盒所带洗液+0.05％tween20洗板5次后，按试剂盒说明进行显色反应。控制显色反应的时间(5-10分钟)。
e.双波长测量，450nm，630nm下表所列为DNA SARS疫苗的具体注射和取血日程


实验结果本实验用ELISA的方法检测第0、4、8、10和12周各小鼠血清中的抗SARS IgG的滴度，在此各样品进行倍比稀释。所测结果如图所示，结果表明1.Ad-S3N在注射后第四周既可诱导小鼠的体液免疫反应；2.第8周的Ad-S3N再次注射可加强小鼠的体液免疫反应，滴度高达3000。结果参见图9。
实施例5.检测SARS DNA疫苗S2，S3N，S3G对大鼠的免疫作用实验中的DNA疫苗是以腺病毒为载体，在其中插入编码SARS病毒蛋白S和E的基因片段而构建成S2疫苗，插入编码E、M和N蛋白的基因片段而构建成S3N疫苗，在其中插入编码S、E和M蛋白的基因片段而构建成S3G疫苗。DNA疫苗有不同的接种方式，在此我们首先采用腹腔注射的接种途径。
实验目的检测SARS DNA疫苗S2，S3(N)，S3(G)对大鼠的免疫诱导作用。
实验材料1.本实验所用的动物为SD大鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，养于本实验室动物房，12小时昼夜交替。大鼠为雄性，体重约200g。
2.SARS IgG抗体ELISA检测盒购于北京华大吉比爱生物技术有限公司。
实验方法1.动物实验过程1)给药SD大鼠，约200g，雄性，分4组，3个给药组每组3个，第四组为PBS注射组含一个大鼠。各组于0周和8周分别腹腔注射疫苗S2，S3(N)，S3(G)和PBS对照。各种疫苗分别溶于PBS，注射剂量为109pfu/只。
2)血清制备分别于0周(注射前)、4周8周(注射前)、10周、12周和16周，剪尾取血约200μl，血样室温静置1小时，离心制取血清，血清样品存于-20℃待测。
3)血清中SARS抗体检测本实验运用的SARS抗体ELISA检测技术是在北京华大吉比爱生物技术有限公司生产的ELISA检测试剂盒的基础上进行修改，参见前文。
2.具体步骤a.试剂盒的每个试验孔和溶于PBS(pH7.5)的5％BSA在37℃环境中孵育60分钟。
b.用试剂盒所带洗液洗板5次后，加入倍比稀释的血清样品(1/50稀释起)和阴阳性对照物，37℃孵育60分钟。
c.用试剂盒所带洗液洗板5次后，各孔加入下列混合物0.5μg/ml羊抗大鼠IgG-HRP+0.2％tween20+1％BSA溶于PBS，37℃孵育60分钟。
d.用试剂盒所带洗液+0.05％tween20洗板5次后，按试剂盒说明进行显色反应。控制显色反应的时间(5-10分钟)。
e.双波长测量，450nm，630nm下表所列为各DNA SARS疫苗的具体注射和取血日程


实验结果本实验用ELISA的方法检测第0、4周各大鼠血清中的抗SARS IgG的滴度，在此各样品进行倍比稀释。所测结果如图所示，结果表明Ad-S3G可诱导大鼠的体液免疫反应，第四周的滴度达到200以上。结果参见图10。
序列列表<110>深圳市清华源兴生物医药科技有限公司<120>抗SARS疫苗<130>CGCNS41571<150>CN03142873.8<151>2003-06-17<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>29760<212>DNA<213>SARS冠状病毒(SARS-CoV)<400>1atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac 120gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct 180tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc 240gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca 300cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg 360gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt 420ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa 480cgttctgatg ccttaagcac caatcactgc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg 540gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc 600gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt 660
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权利要求
1.一株SARS病毒的全基因组序列，其包括在SEQ ID No1中列出的核苷酸序列。
2.一种DNA疫苗，其中包括根据权利要求1所述的核苷酸序列或与该核苷酸序列的同源性大于90％的序列。
3.根据权利要求2所述的DNA疫苗，其中包括SEQ ID No1、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5、SEQ IDNo6、SEQ ID No7的核酸片段或者与其同源性大于90％的核酸片段。
4.一种蛋白质疫苗，其中含有权利要求1-3中任一项所述的核苷酸序列所编码的蛋白质。
5.一种治疗用RNA分子，其与权利要求1所述的SARS病毒全基因组序列具有互补性，可以与其结合从而阻止SARS病毒的复制、转录或者翻译过程。
6.一种载体，包含根据权利要求1所述的核苷酸序列。
7.含有根据权利要求6所述的载体的宿主细胞，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中所述的细胞表达SARS病毒的有关蛋白质。
9.核酸探针，包含至少15个核苷酸，可与含有SEQ ID No1所列的核苷酸序列的核酸序列进行特异杂交。
10.根据权利要求9所述的核酸探针，其中所述探针用可探测标记进行标记，可以用于SARS感染的检测。
全文摘要
本发明涉及SARS冠状病毒基因组的核苷酸序列，以及这些序列中的部分片段用于制备DNA疫苗，或表达相应蛋白质的用途。此外，本发明也涉及这些蛋白质用于疾病预防和治疗以及制备抗体的用途。
文档编号C12N15/63GK1572875SQ200410048309
公开日2005年2月2日 申请日期2004年6月17日 优先权日2003年6月17日
发明者周向军, 董剑云 申请人:深圳市清华源兴生物医药科技有限公司