专利名称：人抗狂犬病抗体及其用途的制作方法
人抗狂犬病抗体及其用途本申请是中国发明专利申请No. 200680007172. 5的分案申请。相关信肩、本申请要求2005年2月2日提交的美国临时专利申请60/649，512的优先权，该专利申请的全部内容引入本文作为参考。在本说明书全文中引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容均全文弓I入本文作为参考。
背景技术：
狂犬病是一种由弹状病毒科(狂犬病毒属(lyssavirus))的RNA病毒感染引起的急性进行性脑炎。尽管在发达国家中人类狂犬病死亡极少(在美国每年通常不到5例死亡)，但是在(例如)印度报告了相当多的死亡例数，在印度有50，000人死于该病，并且有超过500，000人得到治疗。甚至在美国，每年也有15，000到40，000人接受抗狂犬病治疗。一般来说，狗是该病的主要宿主，但是其他哺乳动物如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸也是常见的宿主。该病毒从动物宿主向人的传播通常是通过咬伤或抓伤穿过皮肤而发生的。由于狂犬病在人类中几乎总是致命的，甚至怀疑感染也必须用积极的接触后治疗方案来治疗。人类狂犬病的接触后治疗包括适当的伤口处理、抗狂犬病血清免疫球蛋白浸润到伤口内和伤口周围的局部给药、以及通常在几天和几周内给予多剂量的狂犬病疫苗(关于狂犬病预防的综述，参见，例如，Rupprecht和Gibbons等人,N Engl J Med 351 :25(2004))。适当的伤口处理可以减少存活的进入患者的病毒量。抗狂犬病血清免疫球蛋白浸润该区域可以与狂犬病病毒结合，并且有助于清除狂犬病病毒，由此减少病毒载量(通过被动免疫)。给予多剂量的狂犬病疫苗(主动免疫)的方式通常是在第一次给药后进行加强免疫，可使患者产生有效的主动免疫，包括体液和细胞应答。当前抗狂犬病血清免疫球蛋白的来源是从被接种的人类供体的血液中获得的。抗狂犬病血清免疫球蛋白的其他来源，例如马或鼠，被认为是不可接受的。当前狂犬病疫苗的来源是在细胞系中产生以及化学灭活并冻干。尽管这些药剂如果及时施用是非常有效的，但是仍然存在一定的障碍。例如，这些抗狂犬病药剂的生产厂家极少，而且它们仍然较昂贵，特别是在最需要它们的发展中国家。另外，人抗狂犬病血清免疫球蛋白由于是从人类供体的血清中获得的，因此必须高度纯化以防止任何偶然物质的传播。而且，抗狂犬病疫苗需要劳动密集的细胞培养和大量的灭活和纯化步骤。因此，需要改进的治疗和预防狂犬病感染的免疫疗法。
发明内容
本发明通过提供特异性结合广泛多种狂犬病病毒分离株并且抑制该病毒感染细胞的能力的重组完全人类的抗狂犬病单克隆抗体解决了上述问题。在一个实施方案中，这通过所述抗体在体外中和(即抑制或阻断)狂犬病病毒的能力(例如通过RFFIT测定)得到了证明。在另一实施方案中，这通过抗体在受试者如动物或人体内抑制狂犬病病毒感染力的能力得到了证明。
本发明的人单克隆抗体可以以实际上不受限制的量并且以高度纯化的形式高效制备。因此，这些抗体适合预测、诊断和/或治疗接触或怀疑已经接触狂犬病的个体。本发明的抗体特别有利于狂犬病的接触后预防(PEP)，因为它们不需要人抗狂犬病血清免疫球蛋白的供体来源。这些抗 体可以用本领域公知的用于制备人抗体的多种技术生产。例如，如在本文中例举的，这些抗体可以在表达人免疫球蛋白基因片段的转基因动物例如含有人Ig基因座的转基因小鼠中产生。而且，这些抗体可以单独施用，或者(例如)与抗狂犬病疫苗或其他抗体联合施用，以提高感染狂犬病病毒的受试者(例如动物和人)的存活率。因此，本发明提供了几个优点，包括但不限于如下几点-完全人类重组抗狂犬病抗体，用于预测、诊断和/或治疗受试者中的狂犬病病毒或进行狂犬病病毒接触后预防(PEP)，例如防止或抑制受试者中由狂犬病病毒介导的发病率或死亡率；-组合物(例如药物)和/或试剂盒，其中包含一种或多种完全人类重组抗狂犬病抗体，该抗体可以单独使用或者与商售疫苗联合使用，以治疗受试者的狂犬病感染和/或进行PEP ;和-改进的被动免疫治疗方法，用于治疗感染狂犬病病毒(例如需要狂犬病病毒接触后预防(PEP))的受试者，该方法可以单独使用或者与主动免疫疗法(狂犬病疫苗)联合使用。在一个实施方案中，本发明的人单克隆抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒G糖蛋白特异性结合。特定抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒G糖蛋白N末端一半内的表位特异性结合。其他一些特定抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒C末端结构域内的表位特异性结合。这些表位可以存在于例如狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸1-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-524 内，或其任意间隔、部分或范围内。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端一半内的表位，即大约在氨基酸残基19-422之间。在另一实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含氨基酸残基336-442。在一个实施方案中，狂犬病G糖蛋白包含氨基酸残基336以及其变化，如取代或缺失。在一个相关实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位包含线性表位、构象表位、不连续表位或这些表位的组合。在另一相关实施方案中，狂犬病G糖蛋白的表位由抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、抗原位点次要A、或这些抗原位点的组合例如抗原位点III和次要位点A组成。在另外一些实施方案中，人单克隆抗体或其抗原结合部分的特征为以小于约IOxlO-6M的Kd与狂犬病病毒特异性结合。在一个具体实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以至少约10χ1(Γ7Μ、至少约10χ1(Γ8Μ、至少约10χ1(Γ9Μ、至少约ΙΟχΙΟ,Μ、至少约10χ1(ΓηΜ或至少约IOxlO-12M的Kd或甚至更有利的Kd与狂犬病病毒(例如，狂犬病病毒G糖蛋白)特异性结合。在各种其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与克隆 17C7(SEQ ID NO :1)、6G11 (SEQ ID NO :15)、5G5、2B10 或 1E5产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列。
在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与克隆 17C7(SEQ ID NO :2)、6G11 (SEQ ID NO :16)、5G5、2B10 或 1E5产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列。在再另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区和可变轻链
区，该可变重链区包含与克隆 17C7 (SEQ ID NO :1)、6G11 (SEQ ID NO : 15)、5G5、2B10 或 1E5产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的氨基酸序列，该可变轻链区包含与克隆17C7 (SEQ ID NO :2)、6G11 (SEQ ID NO :16)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %、99 %或99 %以上相同的氨基酸序列。在某些其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合与被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体结合的表位重叠的表位，和/或与克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体竞争结合狂犬病病毒或其部分。该抗体或其抗原结合部分的可变重链和轻链区一般包括一个或多个互补决定区(⑶R)。这些⑶R包括⑶R1、⑶R2和⑶R3区。在特定实施方案中，可变重链⑶R与克隆17C7(SEQ ID NOs :3，4，5)、6G11 (SEQ ID NO s : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 产生的抗体的⑶R(也示于表I中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。在另外一些特定实施方案中，可变轻链 CDR 与克隆 17C7 (SEQ ID NOs :6，7，8)、6G11 (SEQ ID NOs =20,21,22)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区CDR(也示于表2中)至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同。因此，本发明的特定抗体或部分包含可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包含与克隆 17C7(SEQ ID NO s :3，4，5)、6G11 (SEQ ID NOs : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 产生的抗体的可变重链区⑶R至少80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上相同的一个或多个互补决定区(CDR)，该可变轻链区包含与克隆17C7 (SEQ ID NOs :6，7，8)、6G11 (SEQID NOs :20, 21,22)、5G5、2B10或1E5产生的抗体的可变轻链区CDR至少80%、85%、90%、95 %、98 %、99 %或99 %以上相同的一个或多个⑶R。该抗体或其抗原结合部分的可变重链区也可以包括与克隆17C7 (SEQ ID NOs :3，4，5)、6G11(SEQ ID NO s : 17，18，19)、5G5、2B10 或 1E5 产生的抗体的可变重链区的 CDR 至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同的全部三个CDR，和/或与克隆17C7(SEQID NOs :6，7，8)、6G11(SEQ ID NOs :20，21，22)、5G5、2B10 或 1E5 产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80%、85%、90%、95%或99%或99%以上相同的全部三个CDR。在本发明的另一实施方案中，人抗体或其抗原结合部分(a)包括由人VH3-30-3或VH3-33基因编码(即，是其产物)或衍生的重链可变区；和/或(b)包括由选自VkL6、Vk L11、Vk L13、Vk L15或Vk L19的人Vk基因编码或衍生的轻链可变区。本发明的人单克隆抗体包括全长抗体，例如包含效应结构域(例如Fe结构域)，以及抗体部分或片段，如单链抗体和Fab片段。该抗体还可以与多种治疗剂(例如抗病毒药或毒素)和/或标记物连接。在另一方面，本发明提供了包含杂交瘤克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体(在此也称作“17C7”，“6G11”，“5G5”，“2B10”和“1E5”)的抗原结合部分的分离的多肽。
在另一方面，本发明提供了如下分离的核酸，其包括编码与SEQ ID N0s:13或23至少75%、80%、85%、90%、95%、99%或99%以上相同的抗体重链可变区的序列。本发明也提供了如下分离的核酸，其包括编码与SEQ ID NO s :14或24至少75%、80%、85%、90^^95^^99%或99%以上相同的抗体轻链可变区的序列。本发明还提供了包括单独(例如从一个或多个载体表达)的任意上述核酸或其组合的表达载体，以及包含这种表达载体的宿主细胞。适合表达本发明的抗体的宿主细胞包括多种真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞、骨髓瘤细胞或植物细胞。在另一方面，本发明提供了组合物和试剂盒，其包括一种或多种如本文所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒特异性结合并且抑制该病毒感染哺乳动物细胞的能力。该组合物或试剂盒还可以包括一种或多种与狂犬病病毒特异性结合的抗体(例如人单克隆或多克隆抗体)或其抗原结合部分。在一个实施方案中，多克隆抗体或其抗原结合部分与狂犬病病毒G糖蛋白特异性结合。在一个特定 实施方案中，该组合物或试剂盒包括以下两者(a)与第一种狂犬病病毒分离株特异性结合的分离的人单克隆抗体；和(b)与第二种狂犬病病毒分离株特异性结合的分离的人单克隆抗体。本发明还提供治疗受试者的狂犬病病毒病的方法，包括以有效抑制狂犬病病毒病例如狂犬病病毒介导的症状或发病率的量，给受试者施用如本文所述的(即，与狂犬病病毒特异性结合的)分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。本发明的人单克隆抗体或其部分(和包含该抗体或其部分的组合物)可以通过多种合适的方式给受试者给药，例如静脉内(IV)、皮下(SC)、优选肌肉内(IM)。该抗体或其抗原结合部分可以单独给药或与另外一种治疗剂例如第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分联合给药。在一个实例中，该第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分与第二种狂犬病病毒分离株特异性结合，该第二种狂犬病病毒分离株不同于与第一种抗体结合的分离株。在另一实例中，该抗体与另外一种药物如抗病毒剂一起给药。在另一实例中，该抗体与多克隆Y-球蛋白(例如人Y-球蛋白)一起给药。在另一实例中，该抗体在狂犬病病毒疫苗之前、之后或同时给药。另一方面，本发明提供了制备与狂犬病病毒特异性结合的抗体或其抗原结合部分的方法。在一个实施方案中，该方法包括用包含狂犬病病毒例如活的或灭活的病毒的组合物免疫具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，以及从该动物中分离抗体、抗体产生细胞或抗体编码核酸。狂犬病病毒可以通过(例如)化学处理和/或冻干来灭活。该方法可以进一步包括评价该抗体与狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的
彡口口 本发明也提供了通过在宿主细胞中表达编码人抗体的核酸(例如编码抗体的抗原结合区部分的核酸)制备抗体或其抗原结合部分的方法。在另一方面，本发明提供了包含上述核酸的杂交瘤或转染瘤。本发明还提供了一种制备表达与狂犬病病毒特异性结合的抗体的杂交瘤的方法，包括用包含狂犬病病毒或狂犬病病毒G糖蛋白的组合物免疫具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物；从该动物中分离脾细胞；由该脾细胞产生杂交瘤；以及选择产生与狂犬病病毒或其狂犬病病毒蛋白质特异性结合的抗体的杂交瘤。用人单克隆抗体治疗人类具有几个优点。例如，这些抗体在人体中比非人抗体免疫原性更低。治疗也很迅速，因为该抗体一到达感染部位并直接中和致病的狂犬病病毒，即可发生狂犬病病毒灭活。人抗体也比非人抗体更有效地定位于人体肉的适当部位。此外，该治疗对于狂犬病病毒是特异性的，是重组和高度纯化的，并且与传统疗法不同，避免了污染偶发物质的潜在可能性。本发明涉及下述内容第I项.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒特异性结合并且抑制该病毒感染细胞的能力。第2项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在快速荧光灶抑制试验(RFFIT)中中和狂犬病病毒。 第3项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体在受试者体内抑制狂犬
病病毒。第4项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的神经元病理状况；防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的脑脊髓炎；或防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的麻痹。第5项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述狂犬病病毒是选自下组的分尚株CVS_11分尚株、ERA分尚株、Pasteur病毒分尚株、灰狐(德克萨斯州)分尚株、灰狐(亚利桑那州)分离株、北极狐(阿肯色州)分离株、臭鼬(北方中部)分离株、臭鼬(南方中部)分离株、浣熊分离株、丛林狼(德克萨斯州)分离株、狗(德克萨斯州)分离株、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田纳西州)分离株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科罗拉多州)分离株、蝙蝠(鼠耳蝠；华盛顿)分离株、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亚利桑那州)分离株、蝙蝠(东美油蝠；阿拉巴马州)分离株、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴马州)分离株、蝙蝠(银毛蝠；华盛顿)分离株、蝙蝠(大棕蝠；宾夕法尼亚州)分离株、猫鼬(纽约/波多黎各)分离株、狗(阿根廷)分离株、狗(Sonora)分离株、狗(加蓬)分离株、狗(泰国)分离株、及其组合。第6项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体与狂犬病病毒G蛋白或其片段内的一个或多个表位特异性结合。第7项.第6项的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位位于狂犬病病毒G蛋白的氨基酸 19-524、19-439、19-422 或 336-342 之间。第8项.第6项的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位包括选自抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、抗原位点次要A及其组合的抗原位点。第9项.第6项的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位选自线性表位、构象表位、不连续表位及其组合。第10项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以至少约 ΙχΚΓΜ'ΙχΙΟ Μ'ΙχΚ^Μ'ΙχΙΟ,Μ'ΙχΙΟΑΜ'ΙχΚΓ12。M 或更好的 Kd 与狂犬病病毒的 G蛋白或其片段特异性结合。第11项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可变重链区氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。第12项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可变轻链区氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。第13项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可变重链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。第14项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可变轻链 区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。第15项.第13项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分还包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO 16(6G11)的可变轻链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。第16项.一种分离的人抗体或其抗原结合部分,它与狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特异性结合，该表位与被克隆17C7、6G11、5G5、2B10或1E5产生的抗体结合的表位重叠。第17项.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特异性结合，该表位与被人血清免疫球蛋白或鼠单克隆抗体MAb 1112-1 (A. T. C. C.登记号HB 10751)结合的表位重叠。第18项.第17项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与人血清免疫球蛋白或鼠单克隆抗体MAb 1112-1 (A.T.C.C.登记号HB 10751)竞争结合狂犬病病毒G蛋白。第19项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一个或多个至少80%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。第20项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :20-22 (6G11)的一个或多个至少80%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。第21项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一个或多个至少95%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。第22项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一个或多个至少95%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。第23项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中可变重链区包含与SEQ ID NOs 3-5(17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一个或多个的可变重链区⑶R至少80%相同的三个⑶R。第24项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区包含与SEQ ID NOs 6-8(17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :22-22 (6G11)中的一个或多个的可变重链区⑶R至少80%相同的三个⑶R。
第25项.一种与狂犬病病毒特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分(a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因编码或衍生的重链可变区；且(b)包含由选自Vk L6、Vk L11、V κ L13、V κ L15、或V κ L19的人Vk基因编码或衍生的轻链可 变区。第26项.第25项的抗体，其中重链可变区由VH3-33基因编码或衍生，并且轻链可变区由Vk L13编码或衍生。第27项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分抑制狂犬病病毒与哺乳动物细胞的结合。第28项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制狂犬病病毒G蛋白与哺乳动物细胞的结合。第29项.第I项的抗体，其中所述抗体是全长抗体。第30项.一种分离的多肽，其包含上述任一项的抗体的抗原结合部分。第31项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含效应结构域。第32项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含Fe结构域。第33项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是单链抗体。第34项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是Fab片段。第35项.第I项的抗体或其抗原结合部分，其还包含标记或毒素。第36项.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的上述任一项的抗体或其抗原结合部分。第37项.一种组合物，其包含两种或多种上述任一项的抗体，其中所述抗体与狂犬病病毒的不同表位结合。第38项.一种分离的核酸，其编码与狂犬病病毒结合的人抗体的可变区，包含与SEQ ID Ν0:13 或 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :27 至少 90%相同的序列。第39项.一种表达载体，其包含第38项的核酸。第40项.一种宿主细胞，其包含第38项的核酸。第41项.一种狂犬病疫苗，其包含分离的狂犬病G糖蛋白或其片段。第42项.一种试剂盒，其包括一种或多种如第I项所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，和用于治疗狂犬病病毒介导的疾病的说明。第43项.一种治疗受试者的狂犬病病毒疾病的方法，该方法包括以有效抑制狂犬病病毒疾病症状的量给受试者施用上述任一项的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。第44项.第43项的方法，其中所述受试者是人。第45项.第43项的方法，其中给受试者静脉内、肌肉内或皮下施用所述抗体或其抗原结合部分。
第46项.第43项的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分与第二治疗剂联合施用。第47项.第46项的方法，其中所述第二治疗剂是第二种人抗体或其抗原结合部分。第48项.第46项的方法，其中所述第二治疗剂是抗病毒剂。第49项.第46项的方法，其中所述第二治疗剂是狂犬病病毒疫苗。第50项.第49项的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。 第51项.一种适合治疗哺乳动物中狂犬病病毒相关疾病或紊乱的组合物，其包含在药学上可接受的载体中的第I项的人抗体或其抗原结合片段。第52项.第51项的组合物，其中该组合物还包含第二种与狂犬病病毒结合的人抗体。第53项.一种治疗哺乳动物中狂犬病病毒相关疾病或紊乱的方法，包括给该哺乳动物施用两种或多种与狂犬病病毒结合的抗体或其片段，使狂犬病病毒对细胞的感染力受到抑制。第54项.第53项的方法，其中所述与狂犬病病毒结合的抗体或其片段是选自17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的人单克隆抗体。第55项.一种鉴定与狂犬病病毒或其糖蛋白特异性结合的抗体或其片段的方法，包括使该抗体接触上述任一项的狂犬病G蛋白。第56项.第55项的方法，其中所述抗体是人抗体血清、多克隆抗体或单克隆抗体。第57项.第55项的方法，其中所述抗体与线性表位、构象表位或其组合特异性结
口 ο第58项.第55项的方法，其中确定所述抗体与一种以上的狂犬病病毒株具有交叉反应性。第59项.一种根据第54项的方法鉴定的抗体或其片段。第60项.一种重组狂犬病G蛋白，其包含是线性表位、构象表位或其组合的表位，并且在导入哺乳动物体内时能够诱导中和抗体。第61项.第60项的糖蛋白，其中所述哺乳动物是人、灵长类动物或小鼠。第62项.第61项的糖蛋白，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的转基因小鼠。通过下面的详述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
图I显示重组抗狂犬病人抗体(即克隆17C7)的重链和轻链可变区的氨基酸序列。这些序列分别对应于SEQ ID N0:1和2。标出了各链的互补决定区(⑶R)，其对应于SEQ ID NOs :3、4 和 5(重链)和 6、7 和 8(轻链)。图2显示重组抗狂犬病人抗体(即克隆6G11)的重链和轻链可变区的氨基酸序列。这些序列分别对应于SEQ ID N0:15和16。标出了各链的互补决定区(⑶R)，其对应于SEQ ID NOs 17U8 和 19(重链)和 20,21 和 22 (轻链)。图3是狂犬病病毒G重组糖蛋白的示意图，示出了为表位作图研究而分析的片段。通过免疫沉淀和免疫印迹法测定，确定人抗体17C7与氨基酸残基19-422内的表位结合。图4显示通过RFFIT测定，与人血清(hRIG)相比较，当HuMab 17C7从I : 5连续稀释到I : 390625时，中和狂犬病病毒。图5，ERA-N和ERA-CO糖蛋白在293T细胞中表达，在密码子优化时容易表达(A)，在细胞表面上表达时能够被17C7结合(B-D)。图6显示HuMab 17C7识别狂犬病G外功能区(A)，在非还原条件下(B)以及对于ERA株的G蛋白(C)识别。 图7显示根据ELISA⑷和免疫印迹法(B)，HuMab 17C7识别N336K和N336D突变ERA糖蛋白。图8显示HuMab 17C7中和细胞的ERA假病毒感染(A-B)，以及ERA G蛋白的各种突变在17C7结合方面的后果(C-D)。图9显示ERA G蛋白的各种突变在17C7结合方面的后果(A-B)。发明详沭为了清楚地理解说明书和权利要求书，下面提供了如下定义。定义本文使用的术语“狂犬病病毒”是指由狂犬病病毒的RNA编码的病毒体或其部分，例如蛋白质部分，如狂犬病病毒G糖蛋白。术语“抗狂犬病病毒抗体”是与狂犬病病毒或狂犬病病毒产生的或相关的蛋白质、碳水化合物、脂质或其他成分相互作用(例如结合)的抗体。“狂犬病病毒G糖蛋白抗体”是与狂犬病病毒的G糖蛋白或其片段结合的抗体。抗狂犬病病毒或G糖蛋白抗体可以结合表位，例如构象或线性表位，或该病毒或其组分的部分或片段。术语“人抗体”是具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文所述的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。抗狂犬病病毒抗体或其抗原结合部分可以单独施用或与第二种药剂联合施用。受试者可以是感染了或怀疑感染了狂犬病病毒或具有狂犬病病毒介导的疾病的症状(例如神经病理状况、脑脊髓炎、或抗狂犬病免疫球蛋白血清滴度)的患者。这种治疗可以用来治愈、康复、减轻、缓解、改变、矫正、改善、缓和、好转或影响感染和与感染有关的疾病、疾病的症状或患该病的倾向。对于狂犬病病毒感染的临床处理，“治疗”通常被理解为在发病之前预防或防止可能产生的感染。有效治疗狂犬病病毒感染的抗狂犬病病毒抗体的量或“治疗有效量”是在单剂量或多剂量施用于受试者后有效抑制受试者的狂犬病病毒感染、疾病或其后遗症的抗体量。该抗体或抗体片段的治疗有效量可能根据诸如疾病状态、创伤部位、狂犬病病毒株或分尚株、狂犬病病毒的动物载体、个体的年龄、性别和体重、以及该抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力等因素而不同。治疗有效量也是抗体或抗体部分的治疗有益效果超过任何毒性或不利效果的量。抗体抑制可测量参数的能力可以在用于预测在人体中的效力的动物模型系统中评价。例如，如实施例中所述，抗狂犬病病毒抗体保护仓鼠免遭狂犬病病毒致死性攻击的能力可以预测其在人体中的效力。或者，也可以通过技术人员公知的试验在体外检测该化合物调节狂犬病病毒/细胞相互作用例如结合、感染、毒力等的能力来评价抗体或抗体组合物的这种性质。体外试验包括结合试验如ELISA和中和试验。抗狂犬病病毒抗体有效预防疾病的量或该抗体的“预防有效量”是指在单剂量或多剂量施用于受试者后有效预防或延缓狂犬病病毒发病或复发或抑制其症状的量。但是，如果需要较长的保护间期，可以施用增加的剂量或更频繁的给药。例如表示两种状态之间量的差异的术语“拮抗”、“诱导”、“抑制”、“加强”、“提高”、“增加”、“降低”等是指两种状态之间的差异，例如统计学或临床显著的差异。术语“特异性结合”或“与...特异性结合”是指抗体与狂犬病病毒或其部分以至少IxlO-6M的亲和力结合的能力，和/或与狂犬病病毒或其部分以至少两倍于对非特异性抗原的亲和力的亲和力结合的能力。“抗体”是包含至少一个或两个重(H)链可变区(在此缩写为VH)和至少一个·或两个轻(L)链可变区(在此缩写为VL)的蛋白质。VH和VL区可以进一步再分为高变区，称为“互补决定区”(CDR)，高变区散布在被称为“构架区”(FR)的更加保守的区域中。构架区和⑶R的范围已经准确定义(参见，Kabat, E. A.等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department ofHealth and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242，1991，和 Chothia，C.等，J. Mol. Biol. 196 :901-917，1987，引入本文作为参考)。优选地，每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列FR1，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。抗体的VH或VL区还可包括全部或部分重链或轻链恒定区。在一个实施方案中，该抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和轻链例如通过二硫键链间连接。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区包含与抗体相互作用的结合结构域。抗体的恒定区一般介导该抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统第一成分(Clq))的结合。术语“抗体”包括IgA, IgG, IgE, IgD, IgM型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是K或λ型。术语“免疫球蛋白”是指由基本由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括 K、λ、a (IgAl 和 IgA2)、Y (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、δ (IgD)、ε (IgE)和μ (IgM)恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd和214个氨基酸)的NH2-末端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，C00H-末端由K或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50KD和446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和上述其他恒定区基因之一如Y (编码约330个氨基酸)编码。术语“免疫球蛋白”包括具有来自人或非人来源的CDR的免疫球蛋白。免疫球蛋白的构架可以是人、人源化或非人的构架，例如经修饰降低了在人体中的抗原性的鼠构架，或合成构架例如共有序列。成熟的免疫球蛋白/抗体可变区一般不含前导序列。免疫球蛋白/抗体根据它们的恒定区可以进一步区别为不同类别(例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和亚类或同种型(例如IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”或“部分”)是指与狂犬病病毒或其组分(例如G糖蛋白)特异性结合的抗体的一部分，例如这样一种分子其中一条或多条免疫球蛋白链不是全长的，但是其与狂犬病病毒或其组分特异性结合。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合部分的例子包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’ )2片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两条Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(V)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341 544-546,1989);和(vi)分离的互补决定区(CDR)，其具有足以特异性结合(例如)可变区的抗原结合部分的构架。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分，例如Fv片段的两个结构域VL和VH，可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够形成一条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见，例如 Bird 等(1988) Science242 :423-426 ；和 Huston 等(1988) Proc. Natl. Acad. Sci.USA85 :5879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体部分用本领域技术人员公知的常规技 术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些部分进行实用性筛选。术语“单特异性抗体”是指对特定靶标例如表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，后者在本文使用时是指具有单一分子组成的多种抗体或其部分的制剂。本文使用的术语“重组”抗体是指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库中分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体，或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任意其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组抗体包括人源化、CDR移植的、嵌合、体外(例如通过噬菌体展示)产生的抗体，并且可以任选地包含来源于人种系免疫球蛋白序列的恒定区。术语“基本相同”(或“基本同源”)是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的与第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同(例如具有相似的侧链，例如保守氨基酸置换)的氨基酸残基或核苷酸，从而该第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。对于抗体来说，第二抗体与第一抗体具有相同的特异性并且具有第一抗体的至少50 %的亲和力。两个序列之间“同源性”的计算如下进行。为了最佳比较目的将这些序列进行比对(例如为了最佳比对可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。为了比较目的而比对的参比序列的长度至少为参比序列长度的50%。然后比较相应氨基酸位点或核苷酸位点处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位点被与第二序列中相应位点处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这些分子在该位点处相同(此处所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以用数学算法来实现。两个氨基酸序列之间的百分同一性用已经整合入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch,J. Mol. Biol. 48 =444-453,1970的算法进行确定，其中使用Blossum 62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。本文使用的术语“在低严格性、中严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗漆的条件。进行杂交反应的指南可见Current Protocols in MolecularBiology，J ohn Wiley & Sons,N. Y. 6. 3. 1-6. 3. 6，1989，在此引用作为参考。该文献中描述了水性和非水性方法，可以使用其中任意一种。此处所指的具体杂交条件如下1)低严格性杂交条件约45°C下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后至少在50°C下用O. 2X SSC, O. 1%SDS洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可以提高至55°C) ；2)中严格性杂交条件约45°C下6X SSC，然后在60°C下用O. 2X SSC, O. 1% SDS洗涤一次或多次；3)高严格性杂交条件约45°C下6X SSC，随后在65°C下用O. 2X SSC, O. 1% SDS洗涤一次或多次；4)极高严格性杂交条件在65°C下O. 5M磷酸钠，7% SDS，随后在65°C下用O. 2X SSC, I % SDS洗涤一次或多次。应当理解，此处所述的抗体及其抗原结合部分可以具有另外的保守或非必需氨基酸置换，这对多肽功能没有实质性影响。具体置换是否被耐受，即是否不会不利地影响需要的生物学性质如结合活性，可以如Bowie等，Science，247 :1306-1310，1990所述确定。“保守氨基酸置换”是指将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨
基酸残基家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。“非必需”氨基酸残基是可能相对于多肽如结合剂如抗体的野生型序列而改变，但基本不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基则导致这样的改变。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的同样的含义。尽管下面描述了合适的方法与材料，但是在本发明的实践或试验中也可以使用与此处所述相似或等同的方法与材料。如有冲突，以本说明书包括定义为准。另外，这些材料、方法和实施例都只是说明性的，不是限制性的。概述狂犬病病毒是引起人类致死性脑炎的RNA病毒。本文提供了用于治疗和预防狂犬病病毒感染的动物、特别是人类受试者、更特别的是需要接触后狂犬病治疗或接触后预防(PEP)的人的方法和组合物。该组合物包括识别狂犬病病毒的蛋白质和其他分子组分(例如脂质、碳水化合物、核酸)的抗体，包括识别狂犬病病毒G糖蛋白的抗体或其部分。特别是提供了重组完全人类单克隆抗体。在某些实施方案中，在表达人免疫球蛋白基因区段的小鼠中产生这些人单克隆抗体(下文描述)。也提供了抗狂犬病病毒抗体的组合。新方法包括给受试者施用可与狂犬病病毒结合的抗体(及其抗原结合部分)，以抑制受试者的狂犬病病毒介导的疾病。例如，本文所述的人单克隆抗狂犬病病毒抗体能够中和狂犬病病毒并且抑制终末期狂犬病感染和脑炎。在其他实例中，可以施用抗狂犬病病毒抗体(例如抗狂犬病病毒G糖蛋白单克隆抗体)的组合，以抑制狂犬病病毒介导的疾病。人单克隆抗体可以在狂犬病感染的创伤部位局部给药(浸润)，任选地随后给予抗狂犬病疫苗。I.抗体的产生免疫原
通常,用狂犬病病毒和/或狂犬病病毒表达的抗原免疫动物，以产生抗体。为了产生抗狂犬病病毒抗体，一般用灭活的狂犬病病毒免疫动物。例如，可以通过化学处理和/或冻干来灭活狂犬病病毒，几种狂犬病病毒疫苗可以购买到。结合和中和狂犬病病毒的抗狂犬病病毒抗体能够与狂犬病病毒的特定表位例如狂犬病病毒G糖蛋白相互作用。例如，抗狂犬病病毒G糖蛋白抗体能够结合狂犬病病毒G糖蛋白的N末端区或C末端区或其蛋白质或片段的内部区域内的表位(参见实施例4和图5)或其组合。在一个实例中，结合和中和狂犬病病毒的抗体与狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸19-422内的表位例如线性表位结合。在另一实例中，鉴定了一种抗体，该抗体与狂犬病病毒G糖蛋白的氨基酸19-422内的线性表位和/或构象表位结合。如本文所 述，这些表位也可以用来鉴定其他与狂犬病结合的抗体。在HuMAb小鼠中产生人单克隆抗体可以用无法用于多克隆抗体的方法产生单克隆抗体。多克隆抗血清在动物与动物之间不同，而单克隆制剂则表现出均一的抗原特异性。鼠系统可用于产生单克隆抗体，免疫方案、分离和融合脾细胞的技术和产生杂交瘤的方法和试剂是众所周知的。单克隆抗体可以用多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，Nature, 256 :495，1975的标准体细胞杂交技术。总的参见Harlow, E.和Lane, D. Antibodies :A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988。虽然这些标准技术是已知的，但是希望使用人源化或人抗体而不是鼠抗体来治疗人类受试者，因为人体会对来自小鼠和其他物种的抗体产生免疫应答。对鼠抗体的免疫应答被称为人抗鼠抗体或HAMA应答(Schroff，R.等，Cancer Res.，45，879-885，1985)，是在人体中弓I起血清病并且导致鼠抗体从个体循环中被快速清除的情况。已经证明人体中的免疫应答是针对鼠免疫球蛋白的可变区和恒定区的。对于人体施用，人单克隆抗体比来源于其他动物的抗体和人多克隆抗体更安全。产生人单克隆抗体的一种有用的动物是表达人免疫球蛋白基因而不是其自身鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠。这种转基因小鼠，例如“HuMAb ”小鼠，含有编码非重排的人重链(μ和Y)和K轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)，并且具有使内源μ和K链基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg, N.等，Nature368(6474) :856_859，1994，和美国专利5，770，429)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低，而响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力的人IgGK单克隆抗体(Lonberg, N.等,见上；综述见Lonberg, N. Handbook ofExperimental Pharmacology 113 :49-101,1994 ；Lonberg, N.和 Huszar, D. , Intern.Rev. Tmmunol.，13 :65-93,1995,和 Harding, F.和 Lonberg, N.，Ann. N. Y. Acad. Sci.，764 536-546，1995)。该转基因小鼠的制备详细描述于下面的文献中Taylor, L.等，Nucleic AcidsResearch,20 :6287-6295,1992 ;Chen, J.等，International Immunology 5:647-656,1993 ；Tuaillon 等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA90 :3720-3724,1993 ；Choi 等，NatureGenetics,4 :117-123,1993 ；Chen, J.等，EMBO J.，12 :821-830, 1993 ；Tuaillon 等，J. Tmmunol· , 152 :2912-2920,1994 ；Taylor, L.等，International Immunology,6 579-591,1994 ;和 Fishwild, D.等，Nature Biotechnology, 14 :845-851,1996。进一步参见，美国专利5，545, 806 ;美国专利5，569，825，美国专利5,625, 126，美国专利5，633，425，美国专利5，661，016，美国专利5，770，429，美国专利5，789，650，美国专利5，814，318，美国专利5，874，299和美国专利5，877，397，均属于Lonberg和Kay，以及PCT公布WO 01/14424，WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227，和 WO 92/03918。为了产生针对一种抗原的完全人类单克隆抗体,可以如Lonberg, N.等Nature,368(6474) :856-859,1994,Fishwild, D.等，Nature Biotechnology，14 :845_851，1996 和W098/24884所述用免疫原免疫HuMAb小鼠。优选地，小鼠在第一次免疫时为6_16周龄。例如，可以用灭活狂犬病病毒的纯化制剂腹膜内免疫HuMAb小鼠。为了产生针对狂犬病病毒蛋白质、脂质和/或碳水化合物分子的抗体，可以用活的、杀死的或不存活的灭活的和/或冻干的狂犬病病毒免疫小鼠。在另一实施方案中，狂犬病病毒G糖蛋白或其一个或多个片段可以用作免疫原。当最初使用在弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用在弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，HuMAb转基因小鼠产生最佳应答。免疫应 答可以在免疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品进行监测。例如可以通过ELISA或流式细胞术筛查血浆，具有足够效价的抗狂犬病病毒人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。用抗原对小鼠静脉内加强免疫，3天后处死，并且取出脾脏。预期每种抗原可能需要进行多个融合。每种抗原一般免疫数只小鼠。分离小鼠脾细胞，按照标准程序用PEG将其与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后对得到的杂交瘤进行抗原特异性抗体产生的筛选。例如，使用50% PEG，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数目的P3X63-Ag8. 653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)融合。细胞以大约2X IO5接种于平底微量滴定板中，接着在含有20%胎克隆血清、18% “653”条件培养基、5% Origend GEN)、4mM L-谷氨酰胺、ImM丙酮酸钠、5mMHEPES、0. 055mM 2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和I X HAT (Sigma ;HAT在融合24小时后加入)的选择性培养基中培养两周。两周后，在用HT替换了 HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各孔的上清液进行人抗狂犬病病毒单克隆IgM和IgG抗体的筛选。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则通过有限稀释将抗狂犬病病毒单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆，在组织培养基中产生少量抗体用于表征。在一个实施方案中，用来产生抗狂犬病病毒人抗体的转基因动物含有至少一个、一般2-10个、有时25-50个或更多拷贝的W098/24884实施例12所述的转基因(例如pHCl或pHC2)，与含有一个拷贝的W098/24884实施例5、6、8或14所述轻链转基因的动物繁育，其后代与W098/24884实施例10所述的JH缺失的动物繁育，所述专利的内容在此引用作为参考。对于这三种性状中的每一个来说，这些动物培育为纯合的。这些动物具有下列基因型单拷贝(每个染色体单倍体组)的未重排的人重链小基因座(W098/24884的实施例12描述)，单拷贝(每个染色体单倍体组)的未重排的人K轻链构建体(W098/24884的实施例14描述)，和除去所有功能性JH区段的每个内源小鼠重链基因座处的缺失(W098/24884的实施例10描述)。这些动物与对于JH区段缺失而言纯合的小鼠(W098/24884的实施例10描述)繁育，产生对于JH区段缺失而言为纯合的而对于人重链和轻链构建体而言为半合的后代。给产生的动物注射抗原，用于产生针对这些抗原的人单克隆抗体。
从该动物中分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为它们只含有一个拷贝的每种基因。此外，它们对于人或小鼠重链是单特异性的，因为由于如W098/24884实施例9和12所述引入的跨过JH区的缺失，两个内源小鼠重链基因拷贝都无功能性。而且，大部分B细胞对于人或小鼠轻链是单特异性的，因为一个拷贝的重排人κ轻链基因的表达将等位地和同型地排除在大部分B细胞中内源小鼠κ和λ链基因的重排。在一个实施方案中，转基因小鼠将表现为产生具有重要的所有组成成分(repertoire)的免疫球蛋白，理想地基本类似于原始小鼠。因此，例如，在内源Ig基因已经灭活的实施方案中，总免疫球蛋白水平将为约O. l-10mg/ml血清，例如O. 5-5mg/ml或至少约1.0mg/ml。当向转基因小鼠中引入能够实现从IgM到IgG的转换的转基因时,成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选为约10 : I。在未成熟的小鼠中IgG与IgM的比例将更低。通常，超过约10%，例如约40-80%的脾和淋巴结B细胞将只表达人IgG蛋白质。
转基因小鼠中的所有组成成分理想地接近于非转基因小鼠中所显示的，通常高达至少约10%，优选25-50%或更高。通常产生至少约一千种不同的免疫球蛋白(理想地为IgG)，优选104-106或更多种，这主要取决于引入小鼠基因组中的不同V、J、D区的数目。一般地，免疫球蛋白对预先选择的抗原表现出至少约io_6m、io_7m、io_8m、io_9m、10_1qM、10_nM、10_12M、10_13M、10_14M或更高、例如可达10_15M或更高的亲和力。HuMAb小鼠能够产生通过转基因内转换重组而经历类别转换(顺式转换)并且表达对该狂犬病病毒具有反应性的免疫球蛋白的B细胞。该免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重链和轻链多肽由人转基因序列编码，该序列可包括通过体细胞突变和V区重组连接产生的序列，以及种系编码序列。这些人序列免疫球蛋白可以被称为与人VL或VH基因区段和人几或JL区段编码的多肽序列基本相同，尽管由于体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接而可能存在其他非种系序列。对于这些人序列抗体，每条链的可变区一般至少80%由人种系V、J基因区段编码，对于重链，由D基因区段编码。通常，至少85%的可变区由存在于转基因上的人种系序列编码。通常90%或95%或更多的可变区序列由存在于该转基因上的人种系序列编码。但是，由于通过体细胞突变和VJ和VDJ连接引入了非种系序列，人序列抗体通常具有一些不由人V、D或J基因区段编码的可变区序列(较不常见地，恒定区序列)，如在小鼠种系中的人转基因中所见到的。一般地，这些非种系序列(或各个核苷酸位点)将在CDR中或CDR附近聚簇,或者在已知体细胞突变聚集的区域中聚簇。与狂犬病病毒结合的人序列抗体可以由同种型转换产生，从而产生含有人序列Y链(如Y I、Y2或Y3)和人序列轻链(如K)的人抗体。这些同种型转换的人序列抗体通常含有一个或多个体细胞突变，一般位于可变区中，通常在CDR的约10个残基之中或之内，这是抗原攻击，特别是接着进行第二(或后续)抗原攻击引起的B细胞亲和成熟和选择的结果。这些高亲和力人序列抗体具有至少约1χ10_9Μ、一般至少5χ10_9Μ、通常高于ΙχΙΟ,Μ、有时为δχΙΟ,Μ至IxKTllM或更高的结合亲和力抗狂犬病病毒抗体也能够在包括非转基因小鼠、人、兔和山羊的其他哺乳动物中产生。抗狂犬病病毒抗体与狂犬病病毒特异性结合的人单克隆抗体包括本文所述的克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5产生的抗体(分别称为抗体克隆17C7、6G11、5G5、2B10和1E5)。具有与17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可变重链和轻链区至少80%相同的可变重链区和可变轻链区的抗体也可以与狂犬病病毒结合。在有关实施方案中，抗狂犬病病毒抗体包含，例如，与17C7、6G11、5G5、2B10或1E5的可变重链和/或可变轻链的⑶R至少80%相同的互补决定区(OTR)。这些抗体克隆的可变重链区的⑶R在下面的表I中显示。表I.可变重链⑶R氨基酸序列
抗体克隆 Γ11CDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
~17C7HCDRl TYAMH3
~17C7HCDR2 WSYDGRTKDYADSVKG4
~17C7HCDR3 ERFSGAYFDY5
抗体克隆ICDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
6G11HCDRl GFTFSSYG17
6G11HCDR2 VAVIL18
6G11HCDR3 ARIAPAGSAFDY19这些抗体克隆的可变轻链区的⑶R在下面的表2中显示。表2.可变轻链⑶R氨基酸序列
克隆~Γ11 ~ CDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
~17C7 LCDRl RASQSVSSYLA6
~17C7 LCDR2 DASNRAT7
~17C7 LCDR3 QQMNWP8
克隆 I CDR氨基酸序列SEQ ID NO ~
6G11 LCDRl QGISSV20
6G11 LCDR2 DAS21
6G11 LCDR3 QQFNSYPPT22CDR是免疫球蛋白中决定对特定抗原的特异性的部分。在某些实施方案中，具有序列变化(例如保守置换)的对应于表I和表2中CDR的CDR可以与狂犬病病毒结合。例如，与狂犬病病毒结合的抗体(或其抗原结合部分)中可以存在其中CDR中的1、2、3、4或5个残基或少于总残基的20%被置换或缺失的⑶R。类似地，抗狂犬病病毒抗体可以具有含有共有序列的CDR，因为在多种抗体之间保守的基序可能对于结合活性至关重要。例如，本发明提供一种或多种⑶R区或公开的⑶R的衍生物的用途。这些衍生⑶R来源于公开的CDR或其部分，任选地在一个以上的氨基酸位置处改变。改变包括一个或多个如本文所述的氨基酸添加、缺失或取代。用于改变的残基位置的例子包括确定为比其他氨基酸位置经历更多变异的氨基酸位置，例如，本领域公知的经历体细胞突变的位置。或者，可以通过比较两个或多个已知具有所需结合活性的序列，以及确定变化的CDR残基和恒定的CDR残基，来确定这些位置。例如，以下列出了 17C7和6G11重链和轻链可变区的比较(表3-4)，并示出了可以由此确定的CDR衍生或共有序列(表5-6)。表3.重链可变区的比较
权利要求
1.一种分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒G蛋白的抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、或抗原位点次要A内的两个或多个非重叠表位特异性结合，其中该抗体抑制狂犬病病毒感染细胞的能力。
2.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在快速荧光灶抑制试验(RFFIT)中中和狂犬病病毒。
3.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体在受试者体内抑制狂犬病病毒。
4.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分 防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的神经元病理状况； 防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的脑脊髓炎；或 防止或抑制受试者中狂犬病病毒介导的麻痹。
5.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述狂犬病病毒是选自下组的分离株CVS-Il分离株、ERA分离株、Pasteur病毒分离株、灰狐(德克萨斯州)分离株、灰狐(亚利桑那州)分离株、北极狐(阿肯色州)分离株、臭鼬(北方中部)分离株、臭鼬(南方中部)分离株、浣熊分离株、丛林狼(德克萨斯州)分离株、狗(德克萨斯州)分离株、蝙蝠(赤蓬毛蝠；田纳西州)分离株、蝙蝠(大棕蝠-鼠耳蝠；科罗拉多州)分离株、蝙蝠(鼠耳蝠 ’华盛顿)分离株、蝙蝠(灰蓬毛蝠；亚利桑那州)分离株、蝙蝠(东美油蝠；阿拉巴马州)分离株、蝙蝠(巴西犬吻蝠；阿拉巴马州)分离株、蝙蝠(银毛蝠；华盛顿)分离株、蝙蝠(大棕蝠；宾夕法尼亚州)分离株、猫鼬(纽约/波多黎各)分离株、狗(阿根廷)分离株、狗(Sonora)分离株、狗(加蓬)分离株、狗(泰国)分离株、及其组合。
6.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位位于狂犬病病毒G蛋白的氨基酸 19-524、19-439、19-422 或 336-342 之间。
7.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述表位选自线性表位、构象表位、不连续表位及其组合。
8.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以至少约IxlO-7M, IxlO-8M, IxlO-9M, IxlO-10M, IxlO-nM, IxKT12M 或更好的 Kd 与狂犬病病毒的 G 蛋白或其片段特异性结合。
9.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可变重链区氨基酸序列至少80 %相同的氨基酸序列。
10.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可变轻链区氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列。
11.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQ ID NO :1(17C7)或SEQ ID NO :15 (6G11)的可变重链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
12.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可变轻链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
13.权利要求13的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分还包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO :2(17C7)或SEQ ID NO :16 (6G11)的可变轻链区氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列。
14.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它与被一种抗体识别的表位特异性结合，该抗体包含分别如SEQ ID NO 2(17C7)或SEQ ID NO 16(6G11)所示的轻链可变区氨基酸序列和如SEQ ID NO 1(17C7)或SEQ ID NO 15(6G11)所示的重链可变区氨基酸序列。
15.一种分离的人抗体或其抗原结合部分，它与狂犬病病毒G糖蛋白上的表位特异性结合，该表位与被人血清免疫球蛋白或鼠单克隆抗体MAb 1112-1 (A.T.C.C.登记号HB10751)结合的表位重叠。
16.权利要求15的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与人血清免疫球蛋白或鼠单克隆抗体MAb 1112-1 (A.T.C.C.登记号HB 10751)竞争结合狂犬病病毒G蛋白。
17.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :17_19(6G11)中的一个或多个至少80%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。
18.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :20-22 (6G11)的一个或多个至少80%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。
19.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQ ID NOs :3-5 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一个或多个至少95%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。
20.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs :6-8 (17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一个或多个至少95%相同的一个或多个互补决定区(OTR)。
21.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中可变重链区包含与SEQID NOs 3-5(17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :17-19 (6G11)中的一个或多个的可变重链区⑶R至少80%相同的三个⑶R。
22.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区包含与SEQID NOs 6-8(17C7)中的一个或多个或与SEQ ID NOs :20-22 (6G11)中的一个或多个的可变重链区⑶R至少80%相同的三个⑶R。
23.上述任一项权利要求的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与抗原表位III和次要A内的两个或多个非重叠表位结合。
24.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分 (a)包含由人VH3-30基因或VH3-33基因编码的重链可变区；且 (b)包含由选自VkL6、Vk L11、Vk L13、Vk L15、或Vk L19的人Vk基因编码的轻链可变区。
25.权利要求24的抗体，其中重链可变区由VH3-33基因编码或衍生，并且轻链可变区由Vk L13编码或衍生。
26.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分抑制狂犬病病毒与哺乳动物细胞的结合。
27.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制狂犬病病毒G蛋白与哺乳动物细胞的结合。
28.权利要求I的抗体，其中所述抗体是全长抗体。
29.一种分离的多肽，其包含上述任一项权利要求的抗体的抗原结合部分。
30.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含效应结构域。
31.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含Fe结构域。
32.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是单链抗体。
33.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是Fab片段。
34.权利要求I的抗体或其抗原结合部分，其还包含标记或毒素。
35.一种组合物，其包含在药学上可接受的载体中的上述任一项权利要求的抗体或其抗原结合部分。
36.一种组合物，其包含两种或多种上述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体与狂犬病G糖蛋白的不同表位结合。
37.一种分离的核酸，其编码与狂犬病病毒结合的人抗体的可变区，包含与SEQ ID NO:13 或 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO :25 或 SEQ ID NO :27 至少 90%相同的序列。
38.一种表达载体,其包含权利要求37的核酸。
39.一种宿主细胞，其包含权利要求37的核酸。
40.一种狂犬病疫苗，其包含分离的狂犬病G糖蛋白或其片段。
41.一种试剂盒，其包括一种或多种如上述任一项权利要求所述的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，和用于治疗狂犬病病毒介导的疾病的说明。
42.—种治疗受试者的狂犬病感染的方法,该方法包括 以有效治疗受试者的量给受试者施用上述任一项权利要求的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分或组合物。
43.权利要求42的方法，其中所述受试者是人。
44.权利要求42的方法，其中给受试者静脉内、肌肉内或皮下施用所述抗体或其抗原结合部分。
45.权利要求42的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分与第二治疗剂联合施用。
46.权利要求45的方法，其中所述第二治疗剂是第二种人抗体或其抗原结合部分。
47.权利要求45的方法，其中所述第二治疗剂是抗病毒剂。
48.权利要求45的方法，其中所述第二治疗剂是狂犬病病毒疫苗。
49.权利要求48的方法，其中所述狂犬病病毒疫苗是狂犬病病毒G蛋白或其片段。
50.一种鉴定与狂犬病病毒G蛋白的两个或多个非重叠表位特异性结合的抗体或其片段的方法，该方法包括使该抗体接触选自抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、或抗原位点次要A或其组合的抗原位点内的表位，并且鉴定具有所述结合活性的抗体。
51.权利要求50的方法，其中所述抗体是人抗体血清、多克隆抗体或单克隆抗体。
52.权利要求50的方法，其中所述抗体与线性表位、构象表位或其组合特异性结合。
53.权利要求50的方法,其中确定所述抗体与一种以上的狂犬病病毒株具有交叉反应性。
54.一种根据权利要求53的方法鉴定的抗体或其片段。
55.一种组合物，其包含一种或多种肽，所述肽一起包含狂犬病病毒G蛋白的抗原位点I、抗原位点II、抗原位点III、或抗原位点次要A内的两个或多个非重叠表位，其中该组合物在导入哺乳动物体内时能够诱导中和抗体。
56.权利要求55的组合物，其中所述哺乳动物是人、灵长类动物或小鼠。
57.权利要求55的组合物，其中所述小鼠是含有人免疫球蛋白序列的转基因小鼠。
58.一种分离的单克隆人抗体或其抗原结合部分，所述分离的单克隆人抗体或其抗原结合部分 (a)与特异性结合狂犬病病毒G蛋白并且抑制所述病毒感染细胞的能力的、下述分离的单克隆抗体或其抗原结合部分竞争结合狂犬病病毒G蛋白，其中，所述分离的单克隆抗体包含如SEQ ID NO: 5所示的重链可变区⑶R3序列、如SEQ ID NO :8所示的轻链可变区CDR3序列、如SEQ ID NO 4所示的重链可变区CDR2序列、如SEQ ID NO 7所示的轻链可变区CDR2序列、如SEQ ID NO 3所示的重链可变区CDRl序列和如SEQ ID NO 6所示的轻链可变区⑶Rl序列，并且 (b)中和表8中列出的所有狂犬病病毒。
全文摘要
本发明提供了与狂犬病病毒特异性结合的人单克隆抗体，其抗原结合部分，以及制备和应用该抗体及其抗原结合部分治疗受试者中狂犬病病毒的方法。
文档编号A61K39/205GK102936284SQ201210409919
公开日2013年2月20日 申请日期2006年2月2日 优先权日2005年2月2日
发明者W·D·小托马斯, D·安布罗西诺, R·曼德尔, S·舍恩霍夫, G·J·巴布科克, C·鲁普雷希特 申请人:马萨诸塞州大学, 美国疾病控制与预防中心