专利名称：：抗日本脑炎疫苗的工业生产方法和所获得的疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基于日本脑炎病毒(JEV)的预防日本脑炎的疫苗尤其是可用于人类的疫苗的生产方法。本发明还涉及由该方法所获得的疫苗。在许多远东国家以及世界其它地区，传播媒介为蚊的日本脑炎病毒是导致已知为日本脑炎的严重感染的原因。业已知抗日本脑炎的疫苗，它由将JEV颅内注射至幼年小鼠中并收集感染组织的方法来获得。接着通常通过沉淀方法，尤其是用鱼精蛋白沉淀来纯化所得到的组织悬液。在文献中还提到其它用于纯化这些组织制备物的方法，例如超滤、过滤和离心，或用聚乙二醇沉淀等方法，这些方法可相互结合或与凝胶过滤方法或硫酸纤维素或交联的硫酸多糖层析方法结合(JP-B-65,000,611，JP-A-53,133,627，JP-A-50,048,118，JP-A-2,223,531，US-A-4,725,546，JP-A-49,020,322和B-81,005,204，JP-B-67,025,408)。在现有技术中，如世界卫生组织所建议，根据标准化方法，通过化学试剂如甲醛来灭活病毒制剂，由于病毒在该环境中更高温度下不稳定，所以在4℃下甲醛浓度为1/2000时长时间灭活50-60天。由此获得的商业疫苗是有效的，但是其制备、纯化和灭活困难且昂贵。此外，由于来自幼年小鼠组织的污染物可能导致副反应，从而往往限制它们的应用。因此希望能通过其它更工业化的方法，尤其是通过利用病毒在细胞系中繁殖和增殖来生产疫苗。然而，利用高度工业化的方法大量生产疫苗比颅内增殖的情况更为困难，这不仅由于必须处理相当大的数量，而且因为获得和控制高的产率很困难，还由于接着要遇到的，可能来自细胞或来自病毒增殖培养基的污染物所造成的纯化问题。现有技术已知日本脑炎病毒可在各种细胞培养物上繁殖，包括细胞系培养物，尤其是Vero细胞。然而，公开的培养方法不可能在大规模工业培养条件(仅以适当的成本生产)下获得满意的产率。现有技术中没有描述任何高度纯化来自细胞系繁殖和增殖的病毒制备物的方法。因此本发明建议克服这些缺陷，并且提供抗日本脑炎的疫苗的生产方法，该方法可大规模及在安全、迅速和经济的条件下使用，并且可获得非常高纯度和非常好的工业产率的有效疫苗。为了达到这些目的，本发明的主题是抗日本脑炎疫苗的工业生产方法，特征在于它包括下列步骤a)培养来自细胞系的细胞，b)在存在病毒增殖培养基时，用日本脑炎病毒接种获得的细胞培养物，c)病毒在细胞中繁殖和增殖。d)收集细胞所产生的病毒悬液形式的病毒增殖培养基，e)通过至少一个离子交换层析步骤和一个凝胶渗透步骤纯化病毒悬液，f)将病毒悬液配制和转化成药物形式以保存至使用时。根据本发明的具体特征，接种的病毒量相当于感染复数小于0.1。因此，对于病毒增殖和繁殖获得了良好的产率。根据本发明的具体特征，该方法还包括在纯化步骤e)之前或之后灭活病毒悬液这一步骤。因此在使用毒性株用于病毒增殖和繁殖时，可以生产灭活的疫苗。根据本发明的方法的特征，在室温使用化学试剂来进行灭活。因此可迅速进行灭活。根据具体实施方案，该方法特征在于使用Vero细胞系以确保病毒增殖。由于这些细胞对日本脑炎病毒是非常相容的，因此可以获得良好的产率。根据实施本发明另一特征，该方法特征在于通过进行下述步骤来纯化病毒悬液·离子交换层析，·吸附层析，·凝胶渗透。因此可以获得很高纯度的疫苗。根据本发明的另一个实施方案，该方法还在于在收集步骤(d)之后，再加入新的病毒增殖培养基，等待足够长的时间以允许进一步的病毒增殖和进行进一步的收集病毒增殖培养基。因此可以从相同的细胞培养物中获得相当大量的收集物。本发明的主题还在于通过在来自细胞系的细胞中的培养而获得的疫苗，特征在于它包括日本脑炎病毒，和细胞DNA含量小于100pg/剂。从污染病毒和蛋白方面来看，该疫苗既具有功效又具有对可能与病毒接触的任何人进行全身性给药时所必需的安全性。本发明的其它主题和优点将在阅读下面的描述时表现出来。根据本发明，细胞培养可在发酵罐或按传统在烧瓶(Roux盘，旋转烧瓶，MultitrayTM，Cell-CubeTM，等)中进行。然而，优选将含有微载体的大体积发酵罐(500-2000L)与细胞培养基一起使用，将来自与日本脑炎病毒相容的细胞系的细胞接种物加入其中；该细胞系可以为BHK21(幼年仓鼠肾脏)细胞或为Vero细胞。能在发酵罐悬液中培养的微载体可为各种已知用于该用途的微载体；尤其可能提到浓度为1-3g/L培养基的Cytodex1TM颗粒，它用于培养Vero细胞尤其合适。持续时间、温度和其它培养条件，尤其是培养基的组成根据Cytodex1TM微载体上的Vero细胞的性质而改变，为了获得良好的细胞生长，4天的持续时间是适合的，并且因此可以在培养物的稳定期之前接种病毒。接着用病毒增殖培养基取代该培养基，并将日本脑炎病毒的接种物以较低感染复数(或MOI)的量加入到发酵罐中，感染复数为加入的病毒颗粒的量与存在的细胞数目的比值。感染复数优选小于约0.1，较优选小于0.01。使用的病毒株可为减毒株，例如SA14-14-2株或任何已知的毒性免疫原毒株，例如Nakayama或Beijing株。由NVSI(国家疫苗和血清研究所，北京)提供的第88代毒株P3非常适合本发明的需要。用于病毒增殖的培养基为常规培养基，如MEM，其中尽可能地减少蛋白质的量是非常重要的。优选使用其中通常为人清蛋白的蛋白质浓度小于5g/L的培养基。同样优选使用完全缺乏蛋白质的互补培养基。病毒增殖和繁殖所需的时间可以通过监测感染效价来确定。当LD50/ml效价为约107或108时，收集病毒被认为是可能的。通过简单地取出含有细胞产生的病毒的病毒增殖培养基来进行收集。有利地，在取出病毒增殖培养基后，将新培养基再加入到发酵罐中以使得病毒进一步增殖来导致进一步收集。因此在相同的发酵罐中从相同的细胞培养物中可容易地获得高达8次连续的收集。为了获得LD50/ml为107或108的剂量，病毒增殖和繁殖所需的时间通常为2至3天；首次收集优选在病毒接种之后3天来进行，接着每2或3天连续进行收集。因此，发酵罐中的一个完整周期可持续23天，其按如下划分D0发酵罐中微载体上的细胞培养的开始，·D4用病毒增殖培养基取代细胞培养基并接种病毒，·D7首次收集，·D9第二次收集，·D11第三次收集，·D14第四次收集，·D16第五次收集，·D18第六次收集，·D21第七次收集，·D23第八次收集。接着所获得的各种收集物可分别或以混合物进行加工。加工仅由纯化或由纯化和灭活组成，灭活可在纯化步骤之前或之后进行。当开始所用的病毒株为毒株时，在根据本发明的加工中，灭活是一个必需的步骤；另一方面，当用于病毒殖殖的毒株为减毒株时，例如SA14-14-2株，可省去该灭活步骤或在尽可能安全的条件下进行。根据本发明，在室温下使用化学试剂进行灭活，根据本发明，室温指大大高于+4℃的温度，+4℃是灭活JEV常用的温度。该温度可有利地在20和37℃之间，优选约25℃的温度。实际上，已观察到在该温度下病毒被迅速灭活，并且还令人惊奇地注意到尽管温度较高在病毒增殖培养基中含有的病毒是稳定的；从工业化观点来看，该非常短的灭活时间是本发明方法的一个重要优点。用于灭活的化学试剂尤其可为甲醛或β-丙醇酸内酯；优选甲醛。例如可在25或37℃下，使用甲醛14天或更短来进行灭活；时间优选至少7天。有利地，根据本发明，使用的甲醛浓度可小于JEV灭活中常用的浓度；它可为例如约1/2000-1/8000，尤其为1/4000。还可使用例如2种不同的化学试剂来进行2次连续的不同灭活步骤。还可在灭活步骤之前过滤每次收集物以除去细胞碎片(蛋白质，核酸等)，以及浓缩每次收集物以提高病毒效价和液体培养基的蛋白含量。浓缩倍数优选至少等于10，例如约1000，可通过常用方法，尤其是超滤来进行浓缩。必须纯化病毒悬液，根据所使用的方法该悬液是或不是灭活的。根据本发明的一个重要特征，纯化步骤包括至少一个层析步骤。有利地，连续进行下面3个步骤·离子交换层析·吸附层析·凝胶渗透。离子交换层析优选为弱或强的阴离子交换层析。采用的载体为例如DEAE-SpherodexTM(美国Biosepra出售)，它选择性地保留病毒颗粒并允许大部分污染蛋白通过。接着可在载体例如羟基磷灰石或螯合凝胶(钙螯合等)上进行包含病毒的洗脱液的洗脱。在此情况下，病毒不与载体结合，该载体尤其保留核酸。此步骤后，在任何适宜的载体上，例如Sepharose6FFTM(Pharmacia)或FractogelTM(E.Merck)上进行凝胶过滤或分子筛(又称为凝胶渗透)。在此操作期间，洗脱后可回收第一级分中的病毒颗粒；后面的洗脱峰相当于病毒蛋白和残留的不纯物。因此，对于疫苗的生产，仅仅洗脱物的第一级分被保留。有利地，在吸附层析和凝胶过滤之间可进行浓缩步骤，优选通过用截止阈为10000道尔顿的膜超滤。接着配制纯化和任选被灭活的病毒悬液以获得所需的抗原效价；还可向其中加入稳定剂或佐剂；接着将它制成药物形式以在良好的条件下保存，直至使用。实施例1.材料-Vero细胞用于接种发酵罐的Vero细胞来自第137代的Vero细胞库，该库已进行了其鉴定和定性所必需的检测。-JEV病毒采用的病毒株为由NVSI提供的第88代毒株P3。将收到的一安瓿病毒悬浮在100ml培养基中，并使用0.1μm滤器过滤。该溶液用来感染两个75cm2的烧瓶。5天后，过滤所收集的上清液(0.2μm滤器)。进行几次收集，形成初级接种物的混合物LD50/ml效价＝108.16。以10ml初级接种物感染12个850cm2振荡烧瓶的比例来制备工作接种物。进行几次收集，30.2升混合物具有LD50/ml＝108.31的效价。随后检测初级和工作接种物以确保它们的鉴定和定性。2.培养方法将500升发酵罐中装满含有浓度为3g/l的Cytodex1TM微载体的常规用于Vero细胞的培养基。该培养基用Vero细胞接种(200000细胞/ml)。让细胞附着并生长4天。在第4天末，将培养基用病毒增殖培养基取代。将具有计算量病毒的病毒接种物加入罐中，以使感染复数MOI等于1/500。在37℃温度下制备各种培养物。在病毒接种后3天，收集病毒增殖培养基，这产生第一收集物。将病毒增殖培养基用新培养基取代，每两天进行一次收集，收集的总次数等于6。表I表明在每次收集时获得的效价。</tables>将收集物在滤膜上过滤(孔直径0.2μm)。将收集物全部混合在一起。将收集混合物通过在10000道尔顿膜上超滤而浓缩100倍。将最终浓度为1/4000的甲醛溶液加入到浓缩的收集混合物中，并连续搅拌下将得到的混合物保存于室温下(20-25℃)14天。接着进行进一步过滤，并根据WHO方法，通过两步骤检查来证实灭活(1988年的技术报告771)。用甲醛灭活的所有制剂被证实是令人满意的。将灭活溶液通过含有DEAE基团、平衡于pH8的离子交换层析柱(DEAE-SpherodexTM树脂)。病毒被保留于柱中。在用磷酸盐缓冲液洗涤后，将病毒用磷酸盐缓冲液，0.2MNaCl洗脱。从而除去了大部分蛋白污染物。用通过钙相互作用的螯合亲和纯化洗脱液，将洗脱液注射通过ChelatingSepharoseTM柱(Pharmacia)。病毒未被结合，直接穿过该柱。接着通过在截止阀为10000Da的膜上超滤来进行浓缩，以便将病毒悬液的体积减少约20倍。将预纯化病毒的浓缩液加入到Sepharose6FFTM柱中。用0.2MNaCl磷酸盐缓冲液进行洗脱。病毒颗粒被洗脱在被排除的级分中。纯化过程的特点示于表II中。表II</tables>(*)每阶段的收率通过在第0天和第7天注射，将纯化的灭活病毒溶液用于免疫小鼠。在第30天，使用含有105LD50/ml的溶液进行毒株病毒的试验。用纯化的未稀释制剂和用稀释至1/32的纯化制剂接种的所有小鼠受到保护。在相同试验中，检测了用Biken疫苗(1/32稀释)接种的小鼠，其中仅2/5受到保护。权利要求1.工业化生产抗日本脑炎的疫苗的方法，特征在于它包括下述步骤a)培养来自细胞系的细胞，b)在存在病毒增殖培养基时，用日本脑炎病毒接种获得的细胞培养物，c)病毒在细胞中增殖和繁殖，d)收集细胞所产生的病毒悬液形式的病毒增殖培养基，e)通过至少一个离子交换层析步骤和一个凝胶渗透步骤纯化病毒悬液，f)将病毒悬液配制和转化成药物形式以保存至使用时。2.根据权利要求1的方法，特征在于接种的病毒量相当于感染复数(MOI)小于0.1。3.根据权利要求1或2的方法，特征在于它还包括在纯化步骤(e)之前或之后的一个病毒悬液的灭活步骤。4.根据权利要求3的方法，其特征在于在室温下使用化学试剂进行灭活。5.根据前面任一项权利要求的方法，特征在于用于病毒增殖的细胞为Vero细胞。6.根据前面任一项权利要求的方法，特征在于通过下面的方法进行纯化·离子交换层析，·吸附层析，·凝胶渗透。7.根据前面任一项权利要求的方法，特征在于它在收集步骤d)之后，还再加入新的病毒增殖培养基，等待足够的时间以允许进一步的病毒增殖和进行进一步的病毒增殖培养基的收集。8.根据权利要求7的方法，特征在于收集病毒增殖培养基并用新培养基取代，次数为1至7之间。9.根据前面任一项权利要求的方法，特征在于它还在步骤d)之后，过滤所收集的病毒悬液。10.根据前面任一项权利要求的方法，特征在于病毒增殖培养基的蛋白质浓度小于5g/l。11.抗日本脑炎的疫苗，特征在于它包括通过在来自细胞系的细胞中培养而获得的日本脑炎病毒，以及在于细胞DNA含量小于100pg/剂。全文摘要公开了工业化生产抗日本脑炎的疫苗的方法,其中(a)培养来自细胞系的细胞,(b)在存在病毒生长培养基时,用日本脑炎病毒接种得到的细胞培养物,(c)病毒在细胞中繁殖和增殖,(d)以由细胞产生的病毒悬液的形式回收病毒生长培养基,(e)在至少一个离子交换层析步骤和一个凝胶渗透步骤中纯化病毒悬液,和(f)将病毒悬液配制和转化为药物形式以保存至使用时。还公开了日本脑炎疫苗,其特征在于它包括通过培养来自细胞系的细胞所生产的日本脑炎病毒,及在于细胞DNA含量小于100pg/剂。文档编号C12N7/06GK1194584SQ96196620公开日1998年9月30日申请日期1996年7月29日优先权日1995年8月1日发明者B·帆吉特,A·弗兰康,P·海曼丁杰申请人:巴斯德格诺血清和疫苗公司