专利名称：检测调节肥胖症蛋白作用的化合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种新方法，更具体说涉及一种检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白(ob protein)的生理作用的化合物的方法。
肥胖症蛋白(即leptine)是作为从脂肪组织到其他器官的信号以调节体重和能量平衡的一种分泌激素(Zhang等，Nature，1994，372，425)。具推测肥胖症蛋白还在造血和生殖功能中起作用(Cioffi等，NatureMedicine，1996，2(5)，585)。含有一个包括四个α螺旋，形成一束具有上上下下up-up-down-down)拓扑结构的核心的蛋白质分子包括细胞因子和生长因子的一个家族。这个家族的蛋白质引起已知激活导致基因转录的激酶级联反应的膜受体同型-和异型-寡聚合反应。被寡聚合反应激活的该家族受体分成两类；即如表皮生长因子类，它们在其细胞内的功能域具有完整的酪氨酸激酶活性(A.Ullrich & J.Schlessinger，Cell，1990，61，203-212)，以及如IL4和促红细胞生成素类，它们缺乏这种活性并通过一种结合的蛋白质酪氨酸激酶途径介导其反应(J.N.Ihle等，TIBS，1994，19，222-227)。两种受体亚型均受细胞因子激活，但4螺旋束蛋白只激活非完整酪氨酸激酶亚型。这种非完整蛋白质酪氨酸激酶受体一般通过与Janus激酶(JAK)以及这些受体结合的信号转导物和转录激活剂(STAT)蛋白有关的途径起作用。激活过程中，STAT蛋白结合到DNA反应元件上从而控制基因转录。包括一般序列TT(N)nAA的DNA调节元件的寡核苷酸序列已被鉴定为STAT反应元件(Seidel等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1995，92，3041)。在对信号分子如细胞因子起反应时，这些元件与STAT蛋白结合。
在共同未决的联合王国专利申请号9509164.1中我们已经描述了我们的发现即肥胖症蛋白以四螺旋束三级结构为特征。现在我们认为肥胖症蛋白与激活JAK-STAT激酶级联反应的膜结合受体相互作用并由此构成用于检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物的分析系统的基础。这种检测在选择化合物以治疗体重、能量平衡、造血、生殖以及其他受“肥胖症蛋白”介导的疾病方面有用。该检测对选择化合物以治疗与肥胖、厌食、极度瘦弱和糖尿病有关的疾病特别有用。
因此，本发明提供一种检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白生理作用的化合物的方法，该方法包括(a)针对模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物，评估该化合物对与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活信号转导物和转录激活剂(STAT)DNA反应元件的作用；或(b)对增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物，评估该化合物对由肥胖症蛋白提供的、对于与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活的STATDNA反应元件的反应的作用；反应元件和报道基因在肥胖症蛋白反应细胞系中表达。
该反应元件适合与报道基因，最好与小启动子偶联。
一种适合的反应元件是核苷酸分子式TT(N)nAA，其中N是任何核苷酸并且n是4、5或6。
由与其受体相互作用的肥胖症蛋白介导的细胞内事件选择性激活优选的反应元件。这种选择性反应元件可通过在用一些反应元件-报道基因构建体转染肥胖症反应细胞系时，检测受到肥胖症蛋白相对于其他细胞因子的相对激活作用来确定。
优选反应元件是核苷酸分子式TT(N)nAA，其中N是任何核苷酸且n是5。
进一步适合的反应元件是TTCCCGGAA。
进一步适合的反应元件是受肥胖症蛋白调节的基因的启动子区，它是STAT相互作用所需要的。该基因取决于通过此检测选择的化合物的具体治疗用途。
适合的报道基因是萤火虫荧光素酶或氯霉素乙酰转移酶。
适合的启动子是小启动子如单纯疱疹病毒胸苷激酶或SV40启动子。
“肥胖症反应的”细胞系的一个实例是肝或肝癌衍生的细胞系。肝或肝癌细胞系从American Type Culture Collection(ATCC)或EurpeanCollection of Animal Cell Cultures(ECACC)获得。这类细胞系的一个实例是Hep G2(人肝细胞癌)从ATCC(HB8065)获得。该Hep G2细胞系通过美国专利4393133公开并提出权利要求的。
进一步的“肥胖症反应的”细胞系实例是大鼠-1成纤维细胞(Kroder等，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes，1996，104(suppl2)，66)。大鼠1成纤维细胞系从ATTCC(CRL-2210)获得。
可用置换结合检测鉴定其他反应细胞系。虽然结合可能不是受体功能的持久形式，它是将信号传递到细胞质的形式。可通过PCR或Northern印迹分析(例如人肥胖症蛋白Tartaglia等，Cell，1995，83，1263)鉴定受体功能的持久形式。最终通过监测leptin以不同浓度存在时的细胞活动检测反应细胞。鉴定侯选细胞系或监测这些细胞活动的可能方法包括如下方法1.微生理测量仪(Microphysiometer)这种方法检测细胞内生物化学变化所导致的pH的微小变化。受刺激时肥胖症蛋白反应细胞可经历生物化学变化从而引起细胞外酸化速率的微小改变，酸化速率可通过硅氧烷微生理测量仪检测。该微生理测量仪生物传感器方法已由McConnell，Science，1992，257，1906中做了综述。
2.电泳迁移率移位检定(EMSA)将来自用肥胖症蛋白处理过的细胞的核提取物与含混杂的或专一的STAT反应元件DNA序列相混合。来自对肥胖症蛋白起反应的细胞的提取物可引起SATA反应元件寡核苷酸凝胶移位。
参见书“重组DNA”，第二版，Watson等，1992，158页；Lamb等，Blood，1994，83，2063；3.蛋白质磷酸化检定测量法通过使用识别磷酸化酪氨酸的抗体可检定受体激活反应通过细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化与终反应的偶联。更具体说，由于leptin受体可刺激JAK/STAT途径的酪氨酸磷酸化，该方法提供了一种检测leptin反应细胞系的方法。专一性JAK/STAT抗体可与酪氨酸磷酸化抗体并列使用以检测leptin反应细胞系中的leptin激活。可能发生蛋白质磷酸化的抑制以及刺激。特别是，已在过表达(overpress)胰岛素受体的大鼠-1成纤维细胞中已经显示出由肥胖症蛋白产生的对肤岛素受体和胰岛素受体底物-1的胰岛素刺激的磷酸化过程中的抑制作用(Kroder等，1996，Exp.Clin.Endocrinol.Diabetes，104，suppl 2，p66)。
4.置换结合与放射标记的leptin，例如[125I]-leptin一起温浴细胞系后，可通过加入非标记的leptin研究与相对于非专一性结合的leptin的专一性结合。专一性/非专一的高比例结合提示该细胞系可能含有leptin受体。
5.通过使用选择性抗体检测肥胖症蛋白受体的蛋白质功能形式，最好检测蛋白质的功能持久形式。
6.通过Northen，RT-PCR或“狭缝印迹”分析检测肥胖症蛋白受体的mRNA功能形式，最好检测mRNA的功能持久形式。
优选已知涉及控制那些正为之寻求化合物的特殊疾病状态方面的细胞系。
从肝、脑或胰脏组织得到的细胞和成纤维细胞对适合于检定针对肥胖症和糖尿病的化合物的“肥胖症反应”细胞特别有用。脑的某些区域是调节肥胖症蛋白的作用的体重控制和能量平衡中心。肝控制许多调整脂肪和糖水平的代谢过程。从那些含适当内源性JAK，STAT蛋白和其他为介导leptin功能所必需的细胞内蛋白质的器官的特定区域衍生的细胞被优先考虑。
将所述反应元件、报道基因并优选启动子适当的参入到能转染肥胖症反应细胞系的载体中。
适合的载体是市售载体如pGL-2为基础的荧光素酶载体(Promega)。
该载体的适合的构型是启动子和报道基因上游的STATDNA反应元件。所述载体的一种更适合的构型是在胸苷激酶启动子和荧光素酶报道基因上游的多重串联重复(2-10)的STAT DNA反应元件。
构建的载体含有一个报道基因例如萤火虫荧光素酶或氯霉素乙酰转移酶，与小启动子例如单纯疱疹病毒胸苷激酶或SV40启动子相连。用位于所述小启动子上游的适当限制酶位点可将STAT反应元件的DNA片段插入到所述载体中。
用常规表达技术按需要将反应元件、报道基因和启动子结合到载体中，例如用位于小启动子上游的适当限制酶位点可将反应元件的DNA片段插入到所述载体中。
按照Lamb等Blood，1994，8，2963和Seidel等，Proc.Nat.Acad.SciUSA，1995，92，3041中所述可构建STAT反应元件-荧光素酶报道基因系统。
采用标准方法例如磷酸钙法(Graham和Van Der Eb，Virology，1973，52，456)用STAT反应元件-小启动子-荧光素酶报道基因构建体转染肥胖症反应细胞。为修正转染效率的差异，可用表达β-半乳糖苷酶活性的参考质粒共转染该细胞。在转染期后(12-24小时)，用不同浓度的化合物处理该细胞然后收获细胞并溶胞。检定溶胞产物的荧光素酶活性并若适宜的话检定β半乳糖苷酶活性。在评估和测定相对于单独使用肥胖症蛋白的荧光素酶反应的增强和降低时通过预加入或共加入适当浓度的肥胖症蛋白到该化合物中可鉴定增强剂或拮抗剂活性。已有鉴定荧光素酶活性的标准方法例如Ow等，″Science，1986，234，856和Wet等，Mol.Cell Biol.1987，7，725以及几种市售试剂盒。
通过用报道基因构建体和可选择标记转染“肥胖症反应细胞系”可产生稳定的细胞系。常规使用的可选择标记被用于产生稳定的细胞系如在重组DNA，第二版，J.D.Watson等1992，216页中的描述。可将这些稳定的转染细胞系用于产生模拟、增强或阻断肥胖症蛋白的生理作用的化合物的高产量检定。
在用本文公开的方法检定时，本发明还提供模拟、增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物。
本发明还提供适合本文公开的方法中使用的一套试剂盒。
在本文中使用的‘模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物’是指在缺少所述肥胖症蛋白时能起到刺激肥胖症蛋白受体以提供基本相同于肥胖症蛋白的生理学作用或激活该受体下游反应(受体后)的作用的化合物。
在本文中使用的‘增强肥胖症蛋白的生理作用的化合物’是指增强肥胖症蛋白潜能和/或最大生理作用的化合物。
在本文中使用的‘抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物’是指降低或基本上阻断肥胖症蛋白的生理作用的化合物。
下述实施例解释本发明实施例一般方法用含有多重串联拷贝STAT反应元件的报道基因质粒转染肥胖症反应细胞，该反应元件位于小启动子例如单纯疱疹病毒胸苷激酶和荧光素酶基因报道基因上游，该质粒构建用标准方法例如磷酸钙方法(Grahamand Van Der Eb，Virology，1973，53，456)。为修正转染效率的差异，可用表达-半乳糖苷酶活性的参考质粒共转染该细胞。转染一段时间后(12-24小时) 用不同浓度的化合物处理细胞，然后收集并溶胞。检定溶胞产物的荧光素酶活性，并且若合适时检定β半乳糖苷酶活性。在评估和测定相对于单独使用肥胖症蛋白的荧光素酶反应的增强和降低的条件下通过预加入或共加入适当浓度的肥胖症蛋白到该化合物中可鉴定增强剂或拮抗剂活性。已有鉴定荧光素酶活性的标准方法例如Ow等，″Science，1986，234，856和de Wet等，1987，7，725以及几种市售试剂盒。
实施例采用标准方法例如磷酸钙法(Graham and Van Der Eb，Virology，1973，52，456)，以报道基因质粒，即含有一插入寡核苷酸的pGL2为基础的荧光素酶载体(promega)转染从肝癌衍生的细胞系，该寡核苷酸对应于单纯疱疹病毒胸苷激酶(-35到+10)小启动子上游的STAT反应元件，TTCCCGGAA的四重串联重复序列。为修正转染效率的差异，可用表达半乳糖苷酶活性的参考质粒共转染该细胞。转染一段时间后(12-24小时)用不同浓度的化合物处理细胞，然后收集并溶胞。检定溶胞产物的荧光素酶活性，若合适时检定β半乳糖苷酶活性。在评估和测量相对于单独使用肥胖症蛋白的荧光素酶反应的增强和降低时，通过预加入或共加入适当浓度的肥胖症蛋白到该化合物中可鉴定增强剂或拮抗剂活性。已有检定荧光素酶活性的标准方法例如Ow等，″Science，1986，234，856和de Wet等，Mol.cell biol，1987，7，725以及几种市售试剂盒。
权利要求
1.一种检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物的方法，该方法包括(a)针对模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物，评估该化合物对肥胖症蛋白激活的信号转导物和与报道基因偶联的转录激活剂(STAT)DNA反应元件的作用；或(b)对增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物，评估该化合物对由肥胖症蛋白提供的、对于与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活的STATDNA反应元件的反应的作用；反应元件和报道基因在肥胖症蛋白反应细胞系中表达。
2.一种符合权利要求1的方法，其中反应元件与启动子基因偶联，最好是小启动子。
3.一种符合权利要求2的方法，其中反应元件是式TT(N)nAA的核苷酸，其中N是任一核苷酸并且n是4，5或6，最好是5。
4.一种符合权利要求2的方法，其中所述反应元件是式TTCCCGGAA核苷酸。
5.一种符合权利要求1的方法，其中报道基因是萤火虫荧光素酶或氯霉素乙酰转移酶。
6.一种符合权利要求1的方法，其中所述启动子是单纯疱疹病毒胸苷激酶或SV40启动子。
7.一种符合权利要求1的方法，其中所述肥胖症反应细胞系是肝或肝癌衍生的细胞系。
8.一种符合权利要求1的方法，其中所述反应元件，报道基因和启动子被参入到能转染肥胖症反应细胞系的载体中。
9.一种符合权利要求8的方法，其中所述载体是pGL2为基础的荧光素酶载体(Promega)。
10.一种符合权利要求8或权利要求9的方法，其中所述载体的构型是这样的，即STAT DNA反应元件在启动子和报道基因的上游。
11.适合在检测模拟、增强或抑制肥胖症蛋白生理作用的化合物的方法中使用的一套试剂，所述方法包括(a)针对模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物，评估该化合物对肥胖症蛋白激活信号转导物和与报道基因偶联的转录激活剂(STAT)DNA反应元件的作用；或(b)对增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物，评估该化合物对由肥胖症蛋白提供的、对于与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活的STATDNA反应元件的反应的作用；反应元件和报道基因在肥胖症蛋白反应细胞系中表达。
全文摘要
一种模拟、增强或抑制肥胖症蛋白生理作用的化合物的检测方法,它包括:(a)针对模拟肥胖症蛋白生理作用的化合物,评估该化合物对肥胖症蛋白激活的信号转导物和与报道基因偶联的转录激活剂(STAT)DNA反应元件的作用;或(b)对增强或抑制肥胖症蛋白的生理作用的化合物,评估该化合物对由肥胖症蛋白提供的、对于与报道基因偶联的肥胖症蛋白激活的STAT DNA反应元件的反应的作用;在肥胖症蛋白反应性细胞系中表达的反应元件和报道基因;适合用于此方法的一套试剂盒以及用此方法鉴定的一种化合物。
文档编号C12Q1/68GK1192248SQ96195983
公开日1998年9月2日 申请日期1996年5月28日 优先权日1995年5月30日
发明者L·J·比莱, R·A·G·史密斯 申请人:史密丝克莱恩比彻姆有限公司