生产肽混合物的方法

专利名称：生产肽混合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的和工业上有用的生产肽混合物的方法，这种肽混合物具有所需要的性质，具体地说分子量、渗透势、细菌学、和矿物质含量。
这样的混合物非常适于用作或者用于腹膜渗析和胃肠外给药的药剂中，另外也适于其它药物和化妆品方面的应用。
哺乳动物肾的正常功能包括下列活性，如保持不变的以酸为基础的平衡和电解质平衡、从血液中除去过量的液体和身体代谢产生的废物。在患有肾部疾病的个体中，肾的这种功能可降低到正常水平的5％或者更少。当肾脏功能明显降低时，如果想继续维持生命则必需使用人工手段来取代肾脏的这种活性。临床上通过使用渗析来完成这一过程。用于完成这一过程的最普通的方法之一是血液渗析，在这种方法中是使患者的血液通过人工肾脏渗析器。在这种渗析器中，合成的半透膜作为人工肾脏，患者的血液与人工肾脏的一边接触，在渗透膜的另一边有渗析液或渗析物，其组分可以使患者血液中不需要的产物通过扩散作用经此半透膜自然进入体液中。这样，实质上以与肾脏相同的方式清洗了血液，并使血液返回到患者的体内。这种渗析的方法要求渗析器对患者的身体处理几小时，通常是一周几次。尽管这种方法是有效的，但由于明显的原因，这种方法存在很多不便之处。
通过使用以患者自身的腹膜作为所需要的半透膜的技术克服了需要体外处理血液的血液渗析方法的一些缺点。腹膜是膜衬，其中含有大量的血管和毛细管，并且能够充当天然的半透膜。可以通过腹腔壁上的导管将渗析液导入到腹腔中。渗析物合适的滞留时间使其在渗析物和血液之间进行溶质交换。通过在血液和渗析物之间提供合适的渗透梯度除去体液，以便使血液中的水分流出。这样，可以使血液具有正确的以酸为基质的平衡、电解质平衡和体液平衡，不从血液中除去不需要的产物。在完全渗析后可以很容易地通过所说的导管从体腔中除去渗析液。尽管存在不止一种的腹膜渗析，但是称为连续流动的腹膜渗析(CAPD)技术是尤其受欢迎的，这是因为在溶质和体液的交换期间其不需要将患者一直固定在仪器上。唯一需要的静坐期是渗析液流入和流出期间。
对于用于腹膜渗析药剂的组分有特殊的要求。这些要求还根据患者有所变化。当然这些药剂必需无毒。此外，它们必须在分子大小、传导率、盐和矿物质含量方面具有特殊性。
对于达到所需的渗透梯度，目前最普遍接受的药剂是葡萄糖。
葡萄糖的优点是无毒，并且如果其进入血液能够很容易地被代谢掉。然而，使用它的主要问题是渗析物中的葡萄糖很容易被血液吸收。尽管任何物质都有其最终进入血液循环的途径，但葡萄糖通过腹膜十分迅速，以致于在流入2-3小时内，渗透梯度就不存在了。这甚至可以引起逆向的超滤，产生不需要的结果，即在渗析处理结束时渗透物中的水被重新吸收。此外，吸收的葡萄糖的量可以占患者摄入的能量的大部分，可能高达12％-35％。而这一过程对非糖尿病患者没有明显的影响，对葡萄糖耐受能力已经受损的患者其可能是严重的代谢负担。这种增加的负担可导致高血糖和肥胖症(这两种疾病在许多CAPD患者中已经观察到)。糖尿病患者还受到不得不向腹膜渗透物中加入胰岛素(目的是降低由于增加的葡萄糖负担而导致高血糖的危险)的不便和危险。
由于腹膜中蛋白质的非酶催糖基化，包含葡萄糖的渗析液可以降低腹膜的过滤效率。在这方面可以参考James W.Dobbie发表在美国肾脏疾病杂志(Vol.XV，No.2，1990年2月，第97-109页)的文章“腹膜分子生物学和超微结构病理学中的新概念它们对腹膜渗析的重要性”。
葡萄糖的使用在渗析液的制备方面也存在问题。通常渗析液的消毒是通过加热来完成的，在生理pH值时这种加热将导致葡萄糖焦糖化。为了弥补这一点，通常将渗析液的pH值调节到5.0-5.5。这样低的pH值低于身体的正常pH值可能导致流入时某些患者疼痛，并且可能导致腹膜硬化，这种硬化接下来引起溶质平衡或除去方面的疾病(Schmidt等，国际医药史，1411265-1266，1980)。
这些不利因素使得发现了葡萄糖的合适的替代品作为急需的渗透剂。已经提出了很多能够满足下列标准的物质具有生物惰性、不易穿过腹膜、无毒、提供足够的渗透压。已经证明许多所建议的物质不适宜替代葡萄糖。例如，由于葡聚糖(Gjessing，医药博览学报，185237-239，1960)或者聚阴离子(美国专利说明书4 339 433)具有高分子量，所以已经提出它们作为葡萄糖的替代品。因此它们通过腹膜进入血液的扩散作用降低。然而，淋巴系统在溶质运输过程中的作用明显地限制了高分子量物质本身所具有的优点(Allen等，美国生理学杂志，119776-782，1937)。另外，对于聚阴离子，它们的毒性作用如何还不清楚，因为大多数聚阴离子是不能代谢的。关于下列化合物(如山梨醇、木糖醇和葡萄糖聚合物)观察到了与代谢类似的问题。代谢十分缓慢的山梨醇与和高渗昏迷和死亡现象相关(Raja等，国际医药年鉴，73993-994，1970)，因此不再使用。木糖醇和葡萄糖聚合物也都倾向于在血液中积累，并且可能与副作用有关(BazyaLo等，Trans Amer.Sec.artif.Interm.Organs，28280-286，1982)。在渗透能力上可以与葡萄糖相比的果糖也显示出许多同样的不利之处。由于其成本较高，无法广泛使用。
所提出的使用氨基酸替代葡萄糖是更有前途的。氨基酸是完全可以耐受的，并且没有已知的副作用(Oren等，Perit.Dial.Bull，366-72)。由于它们的分子量较低，和葡萄糖相比在量的基础上表现出更高的渗透作用。然而，这也有可能导致氨基酸迅速吸收到血液中，使渗透梯度迅速消失。
虽然与葡萄糖的吸收相比，氨基酸的吸收是有利的(因为其可以补充在许多CAPD患者中观察到的蛋白质消耗)，但是与葡萄糖相比，在氨基酸溶液的几乎抑制购买的成本方面存在许多不利之处。此外，氨基酸的迅速吸收导致相当大的氮负担，这种氮负担明显地增加血液脲氮水平。这样，可以看出甚至是氨基酸也不是合适的替代品。
通过DK 168 080中公开的发明(下文将更详细地描述)已经完成了腹膜渗析方法的改进。这里使用的渗透剂不仅是安全且有利的葡萄糖替代品，而且在使用中也是非常经济的。已经发现来源于优质蛋白质(如乳清蛋白质)的酶促水解的分子量相对较低的寡肽(300-2000道尔顿)的混合物可以在腹膜渗析溶液中用作有效的渗透剂。与氨基酸溶液相比，分子量稍微高的这种肽能防止血液对其迅速地吸收，更有效地保持渗透梯度，并防止血液中不需要的氮的增加。这种最终被血清吸收(尽管十分缓慢)的肽混合物还能提供有价值的饮食补充，所说的肽混合物来源于优质蛋白质。最后，本发明的肽混合物能提供成本低廉且来源容易的渗透剂。
分子量超过大约5000道尔顿的肽可能存在过敏问题，对于注射到体内的产品这种问题尤其不能接受。
本发明的这种类型的肽混合物还可与任何适合用作腹膜渗析液的渗透平衡水溶液结合。为了达到本发明的有效的渗透平衡目的，有用的渗析液必须包含其浓度足以使水和不需要的代谢产物通过腹膜扩散的电解质。例如通常的溶液包含一定量的钠、氯化物、乳酸盐、镁和钙。典型的渗析液的浓度见下表，没有指出渗透剂的量。在葡萄糖溶液中，一般加入大约1.5至4.25％的葡萄糖一水合物。应该理解这只代表可能溶液的一个例子，这种溶液模式的变化对本领域的技术人员是显而易见的。渗析液中肽混合物的比例可以变化，但通常占渗析液重的大约l至15％的范围内。任何情况下，所用的肽量必需和支持电解质一道足以提供大约300至大约500mOsm/l的渗透势(正常血清的渗透势为280mOsm/l)。渗析液的施用以通常用于腹膜渗析的方式完成。在“腹膜渗析”(K.Nolph编辑，MartinusNighoff出版社，1981)中描述了腹膜渗析的例证性方式。任何个别患者所需的特殊治疗很容易由患者的医生确定。
典型的腹膜渗析溶液的成分(meq/l)钠 132.0钙 3.5镁 0.5氯化物 96.0乳酸盐阴离子40.0从国际专利申请WO 87/01286、相应的EP专利说明书270 545、美国专利说明书4 906 616、丹麦专利说明书165 734中已知如何通过奶制品的酶促水解产生渗析液。在这些奶制品中，提到了乳清组分，但是也提到了这种组分的不利之处化学成分相当不明确；含有大量的不易除去的残留蛋白质，因而，就有可能使水解不能再现，并且使水解产物污染。因此，使用β-乳球蛋白和α-乳清蛋白，特别是酪蛋白组分是理想的。在酪蛋白酸钠的水溶液中完成所说的酶促水解。水解后，通过滤菌器进行过滤，将产物调节到所需的渗透势，通过加入盐调节pH。
然而，酪蛋白是不太适宜的，这是因为它的高磷含量不适于患肾疾病的患者。
由EP专利说明书218 900、相应的丹麦专利书168 692和168 080、美国专利说明书5 039 609(前文已经提到)已知具有大约300-2000道尔顿分子量的肽混合物完全适宜用作与腹膜渗析有关的渗透活性剂。这些参考文献也公开了经酶促水解、之后是渗析和反渗透由优质蛋白质产生这种混合物的方法。使用乳清蛋白作为所说的蛋白质。此过程是相当麻烦的，同时需要特殊的设备，并且改变其组分是不可能的。这一点对含有氮的低分子量物质、乳糖和矿物质(特别是铝)是十分重要的，因为通过此过程不可能除去这些组分(一旦渗析液中包含这些组分)。
另外，WO 94/14468公开了含有肽和葡萄糖的渗析液。但没有公开任何产生这些肽的特殊方法。
美国专利说明书4 427 658公开了特别适用于营养目的的乳清蛋白质的水解产物。这种水解充分，因此游离氨基酸的含量很高。可以含有多至15％游离氨基酸。通常这是不理想的，对于需要浓度低于5％的渗析尤其不理想。所说的水解产物是通过使用蛋白水解酶(例如胰酶)的水解产生的，水解持续到使用12％的三氯乙酸不能沉淀氮时。
国际专利申请WO 92/21248叙述了一种方法，这种方法通过使用蛋白含量至少为65％(以干物质计算)的乳清蛋白产品作为起始材料、非pH-稳定水解、然后进行超滤和微量过滤生产用于营养目的的乳清蛋白水解产物。此方法提供了味觉良好且感官上可接受的高产量产品。然而，对于渗析产品该产品的矿物质含量太高。
现在已经能够生产适于渗析、胃肠外给药和其它目的的肽制剂，这种肽制剂能根据需要具有较适宜的分子量、氮和矿物质含量。这可以通过一种特别好的方法来实现，这种方法简便易行而且可更经济地控制制剂的组成。所说的方法能借助于容易得到的设备来完成。
按照本发明的用于生产适用于腹膜渗析和/或胃肠外给药和其它目的的肽混合物(这种肽混合物的分子量在200-2000道尔顿、具有较低的矿物质含量)的方法是这样一种方法，即通过这种方法在水解条件下处理水溶液中的蛋白质，这种方法的特征在于a)水解，直到渗透势增加到120-250mOsm/kg H2O，这种测定是在8％蛋白质溶液中完成的；b)微量过滤、离心或者层析分离，以便除去不需要的高分子物质；c)将步骤(b)中的渗透物进行超滤，或者通过色谱方法进行处理以便分离所需的肽；d)将步骤(c)中的渗透物进行纳米过滤，或者通过色谱方法进行处理；e)从纳米过滤物中收集渗余物，使之尽可能冷却；f)首先将步骤(e)渗余物的pH调节到适于电渗析，之后对其进行电渗析；g)可以将获得的产物进行或者不进行无菌过滤；h)此后，如果需要，干燥无菌产物。
通过本发明的这种方法可能生产分子量为200至2000道尔顿，优选地400至1500道尔顿，特别是少于1000道尔顿的肽混合物，这种肽混合物是所需要的渗析成分。通过本发明的方法也可能生产矿物质含量极低的肽混合物。
磷含量低于0.01％，铝含量低于0.5ppm，钠含量低于0.6％，氯化物含量低于0.7％，钾含量低于0.02％，镁含量低于0.01％。
乳清蛋白是非常合适的起始材料蛋白。尤其是乳清蛋白的浓缩物。特别理想的乳清蛋白浓缩物是以商标BIPROR出售的产品。其包含90％蛋白质，极少量的脂肪、乳糖和矿物质。乳清蛋白具有高的营养价值，如与大豆分离物和酪蛋白相比具有较高的TD(实际的可消化性)、BV(生物价值)、NPU(净蛋白质利用)、PER(蛋白质效率比)，这些值的大小和整个蛋(蛋白+蛋黄)的值相同。
在本发明的方法产生的肽混合物中有大约50％的肽由必需的氨基酸组成。因而，这种肽混合物也完全适合于与碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质等等进行恰当的混合，进行胃肠外和胃肠周围给药。在本发明中参考了食品科学的百科全书，食品技术和营养，3420-3422页，″肠胃外营养″；营养和饮食疗法的基本原则，1994，Mosby，第18章，进食方法“肠内和肠外营养”。
然而，使用其它蛋白(如酪蛋白和大豆蛋白)作为起始材料也是可能的，但是，正如所提到的，它们不如以乳清蛋白作为起始材料有利。
原则上，可以使用酸或碱的水解，但是通过酶促水解可以获得更好的产量。酸或碱水解还可以导致更无法控制的过程，使组分发生变化，并且通过这一过程，一些氨基酸(如亮氨酸、缬氨酸和/或异亮氨酸)甚至受到破坏。因此通常优选使用酶促水解。
有用的酶包括如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰酶。特别是Novo Nordisk A/S的酶产品Alcalase和Neutrase证明是较为合适的。
根据酶的选择和起始材料，可以进行在水解前溶解在水中的起始材料的热处理，这样可以打开蛋白质，增加产量和/或者减少处理时间。如果进行热处理，对于乳清蛋白在大约80-90℃下处理1-3分钟通常是合适的。使用Alcalase和Neutrase的酶促水解在30-65℃，优选的是52-53℃下进行，但是水解的温度当然取决于这些酶或所使用的其它酶。
通过测量渗透势的增加或者测定氨基氮或者通过使用碱滴定率来监测水解程度。在水解过程中依赖于所使用的酶，pH值可以不变或者改变。当使用Alcalase和Neutrase时，pH值经常在8.5和6.0之间变化。
从水解混合物中(例如通过微量过滤、离心或者层析方法)分离非水解蛋白的水解混合物的成分、集合物和脂肪成分，目的是从原来的水解混合物中分离出所说的肽。
通过对渗余物进行膜渗滤，在渗析物中获得的肽产量增加。在高分离能力下进行此步骤，这样可以从所说的肽(所说的渗析物)中除去大多数高分子物质。为了从所说的渗析物中除去余下的高分子物质，进行超滤，或者对渗析物进行色谱纯化。这些步骤在明显低于在先的微量过滤的分离能力下进行，可以确保从所说的肽混合物中除去所有的高分子物质。为了除去水分、含氮的低分子物质和盐，通过纳米过滤或者层析方法分离所说的肽混合物。因此，将所得的肽混合物浓缩成干物质，同时降低了矿物质和含氮物质的含量。
在电渗析步骤中，在pH4-5，特别大约4.5时能较好地除去矿物质。通过测量传导率(其在除去矿物质的步骤中降低)很容易监测电渗析。在用于腹膜渗析、肠胃外和肠胃外围给药的产品中矿物质的这种去除是明显的。
一般地，在每个步骤中调节pH和温度以便达到酶和分离的理想的操作条件。
另外，引入了消毒步骤以除去细菌来获得具有高细菌学质量的最终产品。
按照本发明的方法与已知的技术相比具有很大的优点。特别是那些分离步骤，可以提高在适当的位置干预此过程和控制此过程的可能性，结果得到了所需要的产品组分。此外，这是一种能高产的经济有利的方法。
如以上提及，能够利用普通的设备进行本发明，即用于乳制品业的设备，有关EP 218 900的已知方法与此不同，该已知方法使用了特殊构建的仪器。当然这意味着与已知的技术相比，仅仅由于这一原因按照本发明的方法操作起来更经济。
在上述的丹麦专利168 080(参见第14页，第27ff行)认为超滤的严重缺点是不能获得可靠的分离。利用本发明的方法通过使用特殊的超滤膜(UF-膜)已经解决了这一问题，这样分子量大大超过2000道尔顿的分子仅以最小限度和微乎其微的量存在于通过本发明的方法生产的肽混合物中。自1984年始，这种UF-膜可以买到。
此外，如上所述，在本发明的方法中优选使用特殊的起始材料，即蛋白质含量多达90％且脂肪、乳糖和矿物质的含量十分低的乳清蛋白。通常脂肪的含量为大约0.5％，乳糖的含量也为0.5％，而矿物质的含量为1.6％。因为脂肪、乳糖和矿物质对上述的应用是多余的，所以这样可以更容易地获得足够纯的产品。此外细菌的含量也非常低。
通过下列实施例将更详细地解释本发明。
实施例把20.0kg的乳清蛋白分离物粉剂溶解在210升软化水中。将此溶液在85℃下热处理2分钟，冷却到大约50℃，然后转移到水解罐中。加入0.2％的酶产品ALCALASE-2.4L和0.1％的酶制剂NEUTRASE-0.5L。所用的两种酶是Novo-Nordisk A/S出售的。大约在50℃下水解15小时后，渗透势的增加为166 mOsm/kg H2O。将此产物加热到60℃，然后在Sociétédes Céramique技术公司(法国)的0.2μm膜上进行微量过滤，微量过滤在大约60℃下进行，使用大约200升的软化水进行膜渗滤。平均流速为大约150l/(m2*小时)。收集渗析物并在85℃下热处理3分钟，然后冷却到50℃。50℃下在脱盐系统公司(美国，加利福尼亚，Escondido)的Desal G50型超滤膜上对渗析物进行超滤。此膜具有15000的截断。超滤过程中的平均流速为5.8l/(m2*小时)。将渗析物在70℃下热处理2分钟，冷却到60℃，然后在PCI膜系统有限公司(英国)的PCI AFC 30型膜上进行纳米过滤。平均流速为240l/(m2*小时)。将纳米过滤的渗余物在70℃下热处理2分钟，冷却到5℃，此后使用稀释的盐酸将pH调节到4.5。在大约10℃下将所得的产物进行电渗析，此时的电压为50V左右，在此期间电流从6.5A降低到0.5A。因此传导率减少到0.8mS。电渗析膜是Eurodia公司(法国)的NEOSEPTA-AMX和-CMX型膜。之后，收集电渗析渗余物，70℃下热处理2分钟，冷却到60℃，然后60℃下在Société des Céramique技术公司(法国)的0.05μm型滤器上进行无菌过滤。平均流速为2300l/(m2*小时)。将收集到的无菌过滤产物在Niro Atomizer公司(丹麦)的Niro Minor型喷射塔上进行干燥，获得9.0kg粉末形式的肽混合物。
分析所获得的产物，结果如下pH 4.75蛋白质含量重量比90.5％(N％*6.38)干物质含量重量比96.8％脂肪含量 重量比＜0.02％乳糖含量 重量比＜0.1％灰分含量 重量比0.17％磷含量重量比0.007％钠含量重量比0.012％钾含量重量比0.006％氯化物含量重量比＜0.05％钙含量重量比0.008％铝含量 称重后＜0.5ppmMw*)620Mn*)410分子量＜2000D*) 99.24分子量＜1000D*) 86.46总细菌含量 每克＜1*)使用Waters高压泵(510)、注射器和检测器(214nm)确定分子量。所用的柱是在环境温度下连接并操作的3×TSK G2000 SWXL系列。流动相由0.05M磷酸盐缓冲液/0.5M氯化铵溶液(含有0.1％TFA和25％的乙腈)组成。此柱用几种分子量不同的肽标准物校准。通过最小平方法计算最适合的第三等级polynomium。所得的曲线用作校准曲线。
将样品以5mg/ml的浓度溶解在流动相中。注射20微升的样品。记录检测器对洗脱体积的反应。将色谱分割成时间段(和洗脱体积段)，每一段的特征在于在此时间间隔内的洗脱体积和色谱图的面积。
按照下列方程确定分别称重和计数后的分子量Mw-=Σi(Ai=Mwj)ΣiAi]]>Mn-=ΣiAjΣi(Ai/Mwj),]]>其中Mn是称重后的平均分子量，Mn是计数后的平均分子量，Ai是每一段的色谱面积，根据在每一时间间隔内积累的检测器反应而测量的。Mw，i是每一段的相应的分子量。通过使用整个时间间隔的平均洗脱体积经标准曲线计算该值。
氨基酸分析，百分重酪氨酸3.70色氨酸1.90胱氨酸2.62甲硫氨酸 2.05天冬氨酸 10.9苏氨酸4.53丝氨酸3.95谷氨酸17.1脯氨酸4.43甘氨酸1.70丙氨酸5.69缬氨酸5.14异亮氨酸 5.38亮氨酸12.0苯丙氨酸 3.53组氨酸2.33赖氨酸10.3精氨酸1.9权利要求
1.一种生产适于在腹膜渗析和/或者胃肠外给药中使用和在其它应用中使用的肽混合物的方法，这种混合物的肽分子量在200至2000道尔顿之间，矿物质含量低；可以通过这种方法在水溶液中于水解条件下处理蛋白质，这种方法的特征在于其包括下列几个步骤a)水解，直到渗透势增加到120-250mOsm/kg H2O，这种测定是在8％蛋白质溶液中完成的；b)微量过滤、离心或者层析分离，以便除去不需要的高分子物质；c)将步骤(b)中的渗透物进行超滤，或者通过色谱方法进行处理以便分离所需的肽；d)将步骤(c)中的渗透物进行纳米过滤，或者通过色谱方法进行处理；e)从纳米过滤物中收集渗余物，使之尽可能冷却；f)首先将步骤(e)渗余物的pH调节到适于电渗析，之后对其进行电渗析；g)可以将获得的产物进行或者不进行无菌过滤；h)此后，如果需要，干燥无菌产物。
2.按照权利要求1的生产矿物质含量较低的肽混合物的方法，所说的矿物质组成如下磷含量低于0.01％，铝含量低于0.5ppm，钠含量低于0.6％，氯化物含量低于0.7％，钾含量低于0.02％，镁含量低于0.01％这种方法的特征在于根据所需要的矿物质含量选择过滤条件和其它条件。
3.按照权利要求1的生产分子量在400至1500道尔顿的肽混合物的方法，这种方法的特征在于根据所需要的分子量选择水解和过滤条件以及其它条件。
4.按照权利要求1的生产分子量高至1000道尔顿的肽混合物的方法，这种方法的特征在于根据所需要的分子量选择水解和过滤条件以及其它条件。
5.按照权利要求1的方法，这种方法的特征在于用作起始材料的蛋白物质是乳清产品，具体地说是乳清蛋白浓缩物。
6.按照权利要求5的方法，这种方法的特征在于用作起始材料的蛋白物质是以商标BIPROR出售的绝缘型乳清蛋白或者相应的产品。
7.按照权利要求1的方法，这种方法的特征在于所说的水解是酶促水解。
8.按照权利要求8的方法，这种方法的特征在于使用Alcalase和Neutrase或者相应酶产品进行所说的酶促水解。
9.按照权利要求1的方法，这种方法的特征在于在各个步骤之间根据需要进行热处理和/或冷却。
全文摘要
本发明涉及一种工业上生产肽制剂的方法,这种肽制剂在水解蛋白物质(优选的是以乳清为基础)时具有特定的性质。此方法包括几个步骤,这些步骤使得能够容易地控制此方法,以便获得,例如由于矿物质含量较低,适于腹膜渗析和胃肠外给药的产品。此方法给出高产率。
文档编号A23J3/34GK1192656SQ96196263
公开日1998年9月9日 申请日期1996年6月28日 优先权日1995年6月30日
发明者D·E·W·查特顿, G·比尔特森, K·阿比尔特森, B·E·皮德森 申请人:Md食品公司