可以由选择性产生IgA抗体向产生IgA和IgG两种抗体转换的抗原药物载体和使用该载体...的制作方法

专利名称：：可以由选择性产生IgA抗体向产生IgA和IgG两种抗体转换的抗原药物载体和使用该载体...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及可经鼻、经粘膜和经皮给予的抗原药物(AD)载体，使用该载体的粘膜免疫和体液性免疫的诱导方法，更详细讲，载体，使用该载体的经鼻疫苗、经粘膜疫苗、变态反应的治疗和预防剂等。
背景技术：
：已知现有的灭活疫苗和类毒素等有以下缺点(1)缺乏对自然感染途径的感染防御相对于疫苗接种途径是皮下、肌肉内等，细菌和病毒等自然感染途径是例如鼻腔、气管、肠道等粘膜，与上述接种途径不同。期望通过切合自然感染实态的接种途径来实现感染防御，特别是通过经由粘膜给予疫苗来实现粘膜中的感染防雄卩。(2)低的粘膜免疫性疫苗接种者主要是在血中产生免疫球蛋白G(以下略记为"IgG"或"IgG抗体")，诱导体液性免疫。然而，担负粘膜免疫的分泌型免疫球蛋白A(以下略记为"IgA"或"IgA抗体")几乎不产生，不能期望粘膜免疫的成立。另外，IgA抗体的必要性和有效性如下IgA抗体防御通过飞沫或空气对鼻腔、气管等呼吸器官的感染，防御对作为经口到肠道的感染门户的粘膜的感染，即，担负粘膜免疫，临床免疫上起到非常重要的作用。而IgG抗体对抗原的特异性高，感染防御谱窄，对于抗原变异的病原体的感染防御几乎无效，相反，分泌型IgA抗体由于存在交差免疫性、即交差中和活性，由此感染防御镨的幅度宽，也可防御对变异抗原的感染。3(3)追加接种的必要性和重复费用由于仅靠初次免疫l次接种产生的IgG抗体低，不能期盼有确实的效果，根据之后的IgG抗体保有状况，需要再进行l次以上的追加接种、即通过所谓的加强接种提高血中IgG抗体效价。因此，在需要经费和重复劳力方面，受惠于加强接种的机会的高龄者、成人和学龄儿童中虽然确认有效果，但在易于错过这样机会的低年龄、特别是2岁以下的嬰幼儿中经常看到无效果的情况。换言之，现有的灭活疫苗和类毒素等对接种者主要诱导血中IgG抗体的产生，带来提高体液性免疫的作用效果，其有效性已被确认。然而，由于IgA抗体产生或粘膜免疫的诱导能力低，充分防御自然感染的功能和效果有限。为了从这样的现状出发消除现有疫苗的缺点，到现在为止，从各种各样的方面进行了很多尝试。例如，着眼于疫苗抗原的质或量的改良，取代灭活疫苗制作活疫苗，开发新的接种途径和粘膜疫苗等，提高体液性免疫和使之持续的佐剂的筛选，粘膜免疫佐剂的开发的试行等等。然而，安全而有效的粘膜疫苗的开发还未冗成。以下就粘膜疫苗的开发进行说明(1)增加疫苗抗原量进行了增加皮下或肌肉内接种的疫苗抗原的量，使粘膜分泌的IgG和IgA抗体量增加的尝试。例如，尝试了在现有的灭活流感疫苗中添加、混合该病毒膜蛋白的神经氨酸苷酶，使抗体产生量增加，或添加、混合作为佐剂的MFS9的方法等。然而，出现了疼痛，副反应增强等不良反应。(2)经鼻给予型的灭活疫苗为了通过被认为最有效的分泌型IgA抗体防御感染，尝试了将液状的分裂抗原经鼻直接接种的方法，但IgA产生量低。为了使IgA抗体产生能力提高，进行了向分裂抗原中添加、混合作为佐剂的霍乱毒素，使粘膜免疫应答、即IgA抗体产生能力提高的尝试，但从作为佐剂的毒素的安全性没有保证的现状来看还没有达到实用化。而使用大肠杆菌易热性毒素作为佐剂的分裂型的经鼻灭活流感疫苗[BernaBiotech乂^司(瑞士)制，商品名Nasalflu]作为世界首次的经鼻流感疫苗，已从瑞士批准的2000年10月开始销售。然而，在该疫苗接种组中，由于在25.2%的接种者中检测出面神经麻痹，于2004年2月中止了临床使用(非专利文献1和2)。(3)使用可在鼻腔内接种的低温驯化林的活疫苗将低温驯化流感病毒(2个A型林与1个B型林合计3林的混合、任一林都是重排列的)接种在鼻腔内的活疫苗[MedlmmuneV/Accines公司(美国)制，商品名FluMist]在美国于2003年6月被批准和销售(非专利文献3)。予以说明，这样的低温驯化林病毒的增殖的最适温度是25。C，而在37。C(B型林)或39。C(A型抹)下几乎不增殖。然而，低温驯化亲林的弱毒的机制还不清楚，不能否定毒性恢复的危险性。另外，由于疫苗的有效成分是活的病毒，所以向细胞内的侵入力高，对于免疫的初始化有利，但由于轻度的流感症状散发，如果感染流感，对于易重症化的高危人群和高龄者等不能使用，存在对于流感病毒抗原的频繁的连续变异(飘移)或不连续变异(转换)的有效性不明等缺点。(4)其它疫苗以疫苗病毒作为病毒载体的载体疫苗以及通过反向遗传技术导致的弱毒活疫苗、以DM或以cDNA本身作为有效成分使用的DNA疫苗等的开发虽然实验在进展，但还达到实用化程度。以下就免疫佐剂的开发进行说明(1)免疫佐剂免疫佐剂是具有强化或抑制免疫应答等调节活性的物质的总称，大致分为与以在被接种体内的抗原緩释或贮留等为目的的给予形态有关的物质和用于试图提高或抑制免疫应答等的物质。这些物质中，前者，作为用于给予形态的佐剂，例如使用磷酸铝、明矾等的疫苗或类毒素已实用化。而后者用于试图强化、提高免疫应答的佐剂的实用化还未报道。例如，来自细菌的BCG活菌、BCG-CWS、内毒素、葡聚糖等、合成的胞壁酰二肽、左旋咪唑、聚i-聚c、乌苯美司等，另外细胞因子类的干扰素、TNF、CSF等已众所周知，但对于关节炎、慢性关节风湿病、高y球蛋白血症、贫血等的佐剂病的效果由于而为'了谋求广泛强化体液性2疫的诱导，S用来自高等动物的肺表面活性蛋白B作为佐剂的技术(专利文献1和非专利文献4)虽然已众所周知，但其实用化还未见报道。(2)粘膜免疫用佐剂的开发例如、百日咳毒素B聚合物(专利文献2)、霍乱毒素(专利文献3)、大肠杆菌的易热性肠毒素B亚单位LTB(专利文献4)、淀粉粒子(专利文献5)、霍乱毒素B链蛋白质CTB(专利文献6)、Vero细胞毒素l的B亚单位(专利文献7)、寡核苷酸(专利文献8)、白介素12(非专利文献7)、壳聚糖(非专利文献5)、奈瑟菌属菌的可溶性.表皮膜蛋白质(非专利文献6)等，已进行了多种多样开发，但还达到实用化。如上所述，人们广泛而深入地iU只到从向皮下或肌肉内等接种的现有疫苗向在作为病毒的自然感染途径的粘膜中诱导IgA抗体产生的粘膜疫苗转换的必要性。特别是作为21世纪的新一代疫苗，全世界都在期盼IgA抗体的产生、诱导局部免疫或粘膜免疫的所谓粘膜疫苗的开发和实用化，但还未完成。其理由认为用亍赋予疫苗诱导IgA抗体产生、局部免疫或粘膜免疫的功能的安全而有效的佐剂还未被特定确立。专利文献l:特表2002-521460号公报专利文献2:特开平3-135923号公报专利文献3:特表平10-500102号公报专利文献4:特表2001-523729号公报专利文献5:特表2002-50452号公报专利文献6:特开2003-116385号公报专利文献7:特开2003-50452号公报专利文献8:PCT公表WO00/20039号小册子非专利文献l:NewEngi.J.Med.、第350巻、896-903页、2004年非专利文献2:NewEngl.J.Med.、第350巻、860-861页、2004年非专利文献3:Cleve.Clin.J.Med.、第70巻、801-806页、2003年非专利文献4:Am.J.Respir.CellMol.Biol.、第24巻、452-458、2001年非专利文献5页、2001年非专利文献6非专利文献72003年非专利文献8非专利文献99-14页、1998年
发明内容发明要解决的课题对现有的灭活疫苗、类毒素、变应原等不仅赋予诱导IgA抗体的产生、局部免疫或粘膜免疫的功能，而且也一并赋予诱导IgG抗体的产生或体液性免疫的功能。确立为此目的的安全而有效的技术、免疫两者的疫苗转换的技术、变态反应的预防和治疗手段等。用于解决课题的方法
技术领域：
：本发明提供作为用于解决上述课题的手段，可经鼻、经粘膜和经皮给予的AD载体、使用该载体的粘膜免疫和体液性免疫的诱导方法，更详细讲，涉及可由诱导IgA抗体选择性的产生向诱导IgA和IgG两抗体产生转换的AD载体，使用该载体的经鼻疫苗、粘膜疫苗、变态反应的治疗与预防剂等。发明效果通过广泛应用本发明提供的AD载体，可以实现和普及针对各种各样感染症的粘膜疫苗、变态反应的预防和治疗剂、以及药剂的经粘膜.经皮给予。经鼻或粘膜疫苗由于是切合自然感染实态的免疫手段，与现有疫苗相比，可显著发挥很好的感染防御效果。另外，AD栽体诱导的鼻腔粘膜IgA和IgG可引起该处的变应原的失活，可减少:AdV/AncesDrugDeliveryRev.、第51巻、81-96:V/Accine、第21巻、3706-3712、2003年:InfectionandImmunity、第71巻、4780—4788页、:LneonatalNursing、第10巻、2—ll页、2004年:BiologyoftheNeonate、第74巻(suppll)、致敏。另外，AD载体向各种各样药剂的应用是通过药物经粘膜给予和经皮给予来强化和促进预防和治疗效果。该结果表明本发明在极大提高全人类的医疗、保健、卫生水平的同时，也给世界的医疗、保健、卫生领域的从业者带来期盼的福音。同时可以提供向广泛包括现有和未来的疫苗或类毒素等的生物制剂以及各种各样的药物赋予比注射更简便的可经粘膜给予和经皮给予的功能和性能的手段。图l是表示在一定量的疫苗(干燥重量)0.2ug中添加的贝雷克坦(商品名Surfacten，以下同)(一种AD栽体)的变量对鼻腔粘膜处的抗流感IgA和IgG两抗体的产生量的影响的图。予以说明，在以下的图l~3中，抗体量是通过ELISA确定的定量值、n=8~12、平均值±SD、通过t检验测定的对于没有添加贝雷克坦的疫苗(Q"g)给予组的显著性水平、+表示？<0.08、++表示？<0.05、+++表示？<0,01、而*表示对于给予添加有贝雷克坦0.1Mg的疫苗给予组的显著性水平、p<0.01。图2表示在一定量的疫苗(干燥重量)0.2pg中添加的贝雷克坦的变量对肺胞粘膜处的抗流感IgA和IgG两抗体的产生量的影响的图。图3表示在一定量的疫苗(干燥重量)0.2jag中添加的贝雷克坦的变量对于血中的抗流感IgA和IgG两抗体的产生量的影响的图。图4是表示对照组(未给予疫苗)、疫苗给予组(未添加AD载体的疫苗)、添加人造合成表面活性物质(合成AD载体的一种)的疫苗给予组和添加贝雷克坦的疫苗给予组的各组小鼠的鼻腔清洗液中的抗流感IgA和IgG各抗体的产生量的图。予以说明，在以下的图4~6中，□表示IgA产生量、B表示IgG产生量、抗体量为通过ELISA确定的定量值、疫苗给予组的小鼠数11=4、平均值士SD(标准偏差)、通过t检验测定的对于没有添加AD载体的疫苗给予组的显著性水平、十表示P〈0.01、而+十表示p〈0.05。图5是表示对照组(未给予疫苗)、疫苗给予组(未添加AD载体的疫苗)、添加人造合成表面活性物质(合成AD载体的一种)的疫苗给予组和添加贝雷克坦的疫苗给予组的各组小鼠的肺胞清洗液中的抗流感IgA和IgG各抗体的产生量的图。图6是表示对照组(未给予疫苗)、疫苗给予组(未添加AD栽体的疫苗)、添加人造合成表面活性物质(合成AD栽体的一种)的疫苗给予组、和添加贝雷克坦的疫苗给予组的各组小鼠的血中(血清中)的抗流感IgA和IgG各抗体的产生量的图。具体实施方式以下对本发明和本说明书中使用的用语进行说明和定义。(用语和抗原药物(AD)载体构成成分的说明)(l)AD载体该载体(抗原和药物赋形剂，以下，"AD载体，，是按照能够使抗原和药物等可经粘膜给予和经皮给予那样设计的脂质与蛋白质的复合体。AD载体由以下的(a)和/或(b)和(c)构成(a)肺表面活性蛋白B或其片段(不仅包括通过蛋白质水解酶得到的天然片段，也包括通过基因工程或肽合成得到的人造片段、构成这样片段的l个以上氨基酸置换和/或缺失的变异片段等)；(b)肺表面活性蛋白C或其片段(不仅包括通过蛋白质水解酶得到的天然片段，也包括通过基因工程或肽合成得到的人造片段、构成这样片段的l个以上氨基酸置换和/或缺失的变异片段等)；和(c)磷脂和脂肪酸等脂质。AD载体的形状构造是表面具有棘状或尖钉状的多肽链的膜状(片状或巻状的脂质膜)，使许多多肽链的疏水区域末端嵌入到脂质膜，呈长出长钉状的形状，与现有的脂质小胞(脂质体)不同。如果使所期望的抗原或药物等与本发明的AD载体共存、接触、捕捉、吸附或结合(负载)，这样的抗原或药物等可经粘膜给予和经皮给予。换言之，该载体是抗原或药物等可经粘膜给予和经皮给予的那样的交通工具。另外，有关AD载体的构成成分、该载体的制备、制造中使用的蛋白质、多肽或肽与脂质、即来自于肺表面活性物质的SP-B、SP-C、它们的片段、这些片段肽中至少l个氨基酸置换和/或缺失的变异片段等、以及磷脂、脂肪酸等脂质的详细说明如下所述。(2)肺表面活性物质肺表面活性物质对呼吸窘迫综合征(RDS:RespiratoryDistressSyndrome)的治疗从1987年开始被实用化，现在，有关来自人、牛、猪等的肺表面活性物质的报告，其中有关来自牛、猪的肺表面活性物质的制剂已有销售，已被常用化(非专利文献8)。而RDS治疗涉及的包含活性结构域的合成肽制剂也有销售，另外，SP-B和SP-C类似物的设计开发和合成也有进展(非专利文献9)。肺表面活性物质的组成和构成如下是由约90重量％的脂质(磷脂酰胆碱67.3%、磷脂酰甘油19.3%、磷脂酰丝氨酸3.2%、其它游离脂肪酸等)和约10重量％的蛋白质(表面活性蛋白A、B、C和D;以下分别略记为"SP-A"、"SP-B，，、"SP-C"和"SP-D")构成的复合体。分子量，SP-A为26-38kDa、B为5-8kDa、C为4-5kDa、D为43kDa。SP-A和D是亲水性(水溶性)而且是类外源凝集素(膜締合)。SP-B与C是疏水性(脂溶性)而且是脂质结合性，具有对磷脂膜的嵌入能力和表面活性作用。来自人、牛、猪等的肺表面活性蛋白基因众所周知，例如，GenBank/NCBI(http:〃w靴ncbi.nlm.nih.gov/)中的人SP-B基因DNA的全长碱基序列的检索号是J02761、人SP-C(和SP-C1)的检索号是J03890。以下给出了由该NCBI得到的人SP-B和C的编码区(CDR)和它们编码的氨基酸序列。序列l:人SP-B基因DM的CDR碱基序列；序列2:由序列l破译的人SP-B全长氨基酸序列；序列3:人SP-C基因DNA的CDR碱基序列；序列4:由序列3破译的人SP-C全长氨基酸序列；序列5:SP-C1在人SP-C基因DNA上占有的CDR碱基序列；以及序列6:由序列5破译的人SP-C1全长氨基酸序列。另外，在生物体内，SP-B以由序列2的氨基酸序列中的第201位~第280位(也有第"9位或第281位的报告)的80(或79或81)个氨基酸残基构成的分子存在。而SP-C是以由序列4或6中第24位第58位的35个氨基酸残基构成的分子存在。(3)本发明中使用的蛋白质或肽在本发明涉及的AD栽体的制备、制造中，可以分别使用来自人、牛、马、羊、猪、鲸、海豚等哺乳类的SP-B与SP-C的组合以及SP-B与SP-Cl的组合。例如，可以分别使用由上述的序列2、4和6中分别记载的全长氨基酸序列构成的来自人的蛋白质、SP-B与SP-C的组合以及SP-B与SP-Cl的组合。另外，也可以利用例如基于Kyte-Doolittle的疏水性值的SP-B和SP-C的疏水性(脂溶性)区域和含有该区域的片段、这样的片段肽中的至少l个氨基酸置换和/或缺失的变异片段等。例如，可以使用由以下所示的序列720所述的氨基酸序列构成的天然肽或通过基因工程或化学合成得到的肽、由包括这些肽的肽合成的长链的肽、以及这些肽中的至少l个氨基酸置换和/或缺失的变异体或合成类似物等。另外，氨基酸编号是以占据各序列的N末端的Met为第l位氨基酸，由N末端向C末端方向(由记载序列的由左向右的方向)依次附加的序数表示的。而有关SP-B片段，序列2的第201位~280位的氨基酸序列包含的多肽以第201位的Phe作为第l位，例如记为"SP-B(1-80)片段，，。同样地对于SP-C片段来说，以序列4的第24位的Phe作为第l位，例如记为"SP-C(1-35)片段"。序列7:序列2的第214位-第225位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列8:序列2的第226位~第275位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列9:序列4和6的第29位第58位的氨基酸序列(SP-C片段)；序列10:序列2的第1位第20位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列ll:序列2的第102位~第110位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列12:序列2的第119位第127位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列13:序列2的第136位第142位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列14:序列2的第171位第186位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列15:序列2的第201位第280位的氨基酸序列(SP-B(1-80)片段)；序列16:序列2的第300位第307位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列17:序列2的第317位第330位的氨基酸序列(SP-B片段);序列18:序列2的第344位第351位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列19:序列2的第358位第381位的氨基酸序列(SP-B片段)；序列20:序列4和6的第24位~第58位的氨基酸序列(SP-C(1-35)片段)；序列21:序列2的第201位第225位的氨基酸序列(SP-B(1-25)片段)；序列22;序列2的第220位~第260位的氨基酸序列(SP-B(20-60)片段)；序列23:序列2的第264位第280位的氨基酸序列(SP-B(64-80)片段)；序列24:序列2的第201位~第260位的氨基酸序列(SP-B(1-60)片段)；序列25;序列4和6的第24位~第42位的氨基酸序列(SP-C(1-19)片段)；序列26:KL-4(模拟SP-B的合成肽)；序列27:SP-CL[合成SP-C(7-28)片段];序列28:SP-C33(SP-C型的合成肽);序列29:SP-C(FFI)[SP-C(25-58)片段的第28~29位氨基酸残基CC置换为FF，56位氨基酸残基M置换为I的合成肽];和序列30:SP-C(KLS)(模拟SP-B与SP-C的融合(hybrid)型合成肽)。根据本发明，可以使用(a)从由序列2、7、8、10~24所述的氨基酸序列构成的SP-B及其片段组选出的至少1种，和/或(b)从由序列4、6、9、20、25和26所述的氨基酸序列构成的SP-C(和SP-Cl)及其片段组选出的至少l种的组合，即，单独使用上述(a)组、单独使用(b)组，和使用(a)与(b)两组的组合。另外，当选择上述的SP-B、SP-C、或它们的片段的2个以上的组合时，可以将它们混合，或也可以将它们做成融合蛋白质(融合肽)。(4)本发明中使用的脂质作为磷脂，希望使用肺表面活性物质所含有的磷脂，例如磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等。此外也可使用二酰甘油磷酸甘油、磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二软脂酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、鞘磷脂等。而作为脂肪酸，可以使用月桂酸、肉豆寇酸、软脂酸、硬脂酸、软脂油酸、油酸等。另外可以使用来自肺膨胀活跃的鲸、金枪鱼、海豚等水栖动物的脂质。(5)作为RDS治疗用已报导的肺表面活性物质制剂根据本发明，可以将作为RDS治疗剂的安全性和有效性已被有关当局批准的、而且含有疏水性或脂溶性的SP-B和SP-C以及磷脂的已报道的肺表面活性物质，例如贝雷克坦(商品名Surfacten)、商品名为Infasurf的小牛肺表面活性物质、固尔苏(商品名Curosurf，猪肺表面活性物质)、商品名Humansurf、棕榈胆磷冻干粉(商品名Exosurf，肺表面活性物质)、商品名为Alveofact的肺表面活性物质、商品名为Surfacxin的表面活性物质等作为AD载体使用。另外，除了SP-B与SP-C以外，在含有亲水性或水溶性的SP-A和SP-D的市售制剂中，例如，用1-丁醇萃取那些水溶性蛋白质SP-A与SP-D，将它们除去直至检测限以下后，供使用。如果考虑AD载体制备中使用浓度的调整，与液状制剂相比，优选使用干燥制剂。本发明是通过处于上述
背景技术：
的极其严酷的旋涡中多达10余年反复失败探索尝试的本发明人的卓越观察力和解析力、以及多年学识经验和崭新的构思形成的发明，源于如下惊人的发现(1)与现有佐剂引起炎症，增强抗原提示能力相反，发现了如果使病毒抗原与从本来是肺或消化道粘膜分泌的表面活性物质的肺表面活性物质的4种蛋白质有效成分、SP-A、B、C和D中除去A与D的SP-B和SP-C的组合与磷脂的复合体、或含有它们的脂溶性区域(有效区域)的SP-B与SP-C两片段的合成肽的组合和脂质膜的复合体(上述的AD栽体)共存或接触或捕捉或吸附，在不引起炎症的情况下使鼻腔粘膜的抗原提示细胞活化，在病毒抗原有效地被整合到该细胞内的同时，可在不诱导粘膜或血液中IgG的产生的情况下，有效而优先地诱导粘膜的抗病毒IgA产生。(2)发现了通过在从以往作为安全的灭活疫苗抗原使用的流感病毒分裂抗原中添加混合SP-B与SP-C的组合和砩脂的复合体、或含有它们的脂溶性区域(有效区域)的SP-B与SP-C两片段的合成肽的组合和脂质膜的复合体(AD载体)，在保持分裂抗原的高安全性的同时，而且就单独使用分裂抗原来说，在与活疫苗相比弱的抗原提示细胞的活化被充分增强补充的状态下，可以实现选择性诱导IgA产生。(3)另外，由将分裂型流感病毒疫苗抗原负载到AD栽体上制备的经鼻、粘膜疫苗的免疫诱导能力的解析结果，令人吃惊地发现了选择性诱导IgA产生依赖于AD载体干燥质量(V:予以说明，由于脂质或磷脂通常占AD载体干燥质量的约90重量Q/。以上，所以V值可相当于脂质重量或磷脂重量)与疫苗抗原干燥重量(A)的重量比V/A，当V/A在1以下时，选择性诱导IgA产生，而当V/A超过1时，可诱导IgA与IgG两抗体产生。另外，获得上述发现的原委如下(1)本发明人为了阐明流感发病机制和治疗、预防法一直反复进行深入研究。在该研究过程中阐明了在肺表面活性物质吸附后，使气管的HA加工蛋白酶的类胰蛋白酶失活(该酶可对流感病毒膜蛋白的血细胞凝集素(HA)进行限定水解后使病毒的膜融合活性和感染能力显现)，结果阻止了病毒的增殖循环。(2)继续研究的结果发现，肺表面活性物质除了上述的作用以外，可选择性使粘膜的抗原提示细胞活化，使对病毒抗原的免疫能力活化，虽然引起分泌型IgA的诱导，但不引起IgG的诱导。另外阐明了作为肺表面活性物质中的粘膜免疫增强有效成分，SP-B、SP-C与脂质成分都重要，并进行了这些蛋白成分的有效区域的特定和验证了粘膜免疫增强的有效性。(3)另外，像上述那样从气管粘膜的生物体防御物质和病毒感染防御的观点出发进行了研究，证明了体内分泌的肺表面活性物质作为来自于生物体内的粘膜免疫佐剂与选择性诱导IgA的产生有关。(4)着眼于上述的肺表面活性物质本来是生物体内的生理活性物质，(a)具有吸附特定的生物体物质的性质[Kido等人、FEBSLett.，322(29)，115-119，1992]、(b)从肺胞II型细胞或克拉拉细胞分泌后，被巨噬细胞选择性摄入后代谢(诹访部彰、J.Jpn.Med.Soc.Biol.Interface,33，10—13，2002)以及(c)#皮其类似细胞、例如抗原提示细胞(树状细胞)摄入后代谢的情况反复进行了研究。研究结果表明在肺表面活性物质的蛋白成分中，只有SP-B、SP-C以及脂质成分可作为选择性诱导IgA产生的粘膜疫苗的"AD载体"发挥功能，而且SP-B的有效成分区域或粘膜免疫诱导活性结构域是由如下的氨基酸序列构成的肽。SP-B214-225:LeulieLysArglieGinAlaMetlieProLysGly(序歹'7);以及SP-B257-266:LeuLeuAspThrLeuLeuGlyArgMetLeu(序列8)。同时阐明了SP-C的有效成分区域或粘膜免疫诱导活性结构域是由以下氨基酸序列组成的肽SP-C29-58:CysProValHisLeuLysArgLeuLeulieValValValValValValUulieValValVallieValGlyAlaLeuMetGlyLeu(序歹'J9)。(5)阐明了作为选择性诱导IgA的机制，肺表面活性物质的有效成分除了诱导抗原提示树状细胞的MHCClassII、CD40和B7-2的表达增加，有效地实行对T-淋巴细胞的抗原提示以外，还对粘膜局部的细胞因子TGF-Pl进行诱导，促进向产生IgA的B-淋巴细胞的类转换。(6)获得了在通过分裂型流感病毒疫苗抗原与AD载体的混合制备的经鼻、粘膜疫苗产生的免疫功能中存在着由选择性诱导IgA产生向诱导IgA和IgG两抗体产生的转换点，它依赖于AD载体量(V)与疫苗抗原量(A)的重量比V/A的见解。但是，当经鼻接种比较多量的疫苗抗原(15mg/Kg以上)时，不管V/A量比为多少，会同时诱导粘膜免疫的IgA与全身免疫的IgG。根据以上发现及其中的线索完成的本发明的目的如下(1)第一个目的是粘膜免疫方法的确立，通过"AD载体"的提供及其活用，在实现作为粘膜免疫的有效物质的抗原特异的选择性诱导IgA产生、以及诱导IgA和IgG两种抗体产生的经鼻粘膜疫苗的同时，确立了安全而有效的(无副作用)粘膜免疫的诱导及其方法。(2)第二个目的在于通过合成肽的使用提高了AD载体的安全性、有效性、均质性的品质。提供在SP-B的粘膜免疫诱导活性结构域(由前述SP-B214-225和SP-B257-266的各氨基酸序列组成)的合成肽、以及SP-C的粘膜免疫活性诱导活性结构域(由上述SP-C29-58的氨基酸序列构成)的合成肽、它们的合成类似物、以及含有这些氨基酸序列作为一部分的长链的合成肽等与肺表面活性物质脂质成分之间制备的复合体(AD载体)，使AD载体的品质提高。(3)第三个目的在于由现有疫苗的皮下接种向经粘膜给予的转换。在气管感染病毒的灭活疫苗例如流感、SARS、麻疹、风疹、流行性腮腺炎等的灭活疫苗以及肠道感染病毒的灭活疫苗、例如轮状病毒、小儿麻痹症等的灭活疫苗中利用AD载体，将这些的皮下接种疫苗转换为粘膜疫苗。(4)第四个目的在于在针对经由气管、肠管以外的粘膜的病毒感染的灭活疫苗、例如艾滋病、B型肝炎、C型肝炎等的灭活疫苗中，提供可利用AD载体的方法。(5)第五个目的是对于DNA疫苗、活疫苗、变态反应的预防或治疗等也可提供利用AD载体的方法。(6)第六个目的在于在作为粘膜以外的可诱导IgA的免疫途径的经皮接种(涂布或贴付等)中，提供可利用AD栽体的方法。(7)第七个目的在于开辟AD栽体在药物释放系统和制药，以及农业、渔业等方面的用途和应用的道路。予以说明，本发明提议的AD栽体与现有免疫学使用的佐剂在性能与作用方面有如下的差异现有的佐剂通常接种在皮下或肌肉内，引起局部的炎症反应，以将抗原提示细胞或B-、T-淋巴细胞引到附近，发挥它们能力的异物作为有效成分。另外，为了维持长时间的炎症反应，可并用导致抗原緩释或^留的矿物油或金属盐。另外，如上所述，作为现有的粘膜疫苗佐剂已知的如大肠杆菌易热性毒素、霍乱毒素等异物，有产生危害作用和副作用的危险性。与此相反，本发明涉及的AD栽体不引起局部的炎症反应。另外，是来自于生物体成分，而且肺表面活性物质中的活性成分或其活性结构域被限定，使用这样的结构域或含有该结构域区域的低分子肽，实现有效果的粘膜疫苗。因此是极其安全，而且是非侵袭的。根据本发明可以提供如下(1)~(8)项发明(1)诱导IgA和IgG两种抗体产生的粘膜疫苗，它是通过使诱导粘膜免疫IgA的量的抗原与抗原药物(AD)载体共存、接触、捕捉或吸附而得到的粘膜疫苗，所述抗原药物(AD)载体是由从肺表面活性蛋白B、其片段和模拟它们的功能结构的合成肽(A组)选出的至少l种蛋白质，和/或从肺表面活性蛋白C、其片段和模拟它们的功能结构的合成肽(B组)选出的至少l种蛋白质，以及从脂质类(C组)选出的至少l种脂质构成的复合体，其特征在于，将上述载体的干燥质量(V)与上述抗原的干燥质量(A)的重量比V/A调整为超过约l以上。而"抗原，，指的是用于疫苗的高度纯化的纯度约90%以上的来自于病毒、细菌、霉菌等病原体的抗原、毒素、灭活抗原、类毒素、和它们的合成抗原表位区域等，以及纯度在约90%以上的变应原、变应原抗原表位、蛋白质、糖蛋白质、高分子的糖质或核酸等。而"AD载体，，是由从下面A组(肺表面活性蛋白B、来自于脂肪酸等脂质组)各组中至少各选出l种，即从A组和C组中各组至少各选出1种，合计至少2种、或从B组和C组中各组至少各选出1种，合计至少2种、或从A组和B组以及C组中各组至少各选出1种，合计至少3种物质构成的复合体<A组〉肺表面活性蛋白B、以及由序列2所述的氨基酸序列构成的多肽(氨基酸编号为以N末端的Met作为第l位氨基酸，由此开始依次向C末端方向编)第1位至第381位(序列2)及其片段第214位至第225位(序列7)、第257位至第266位(序列8)、第l位至第20位(序列10)、第102位至第110位(序列ll)、第119位至第127位(序列12)、第136位至第142位(序列13)、第171位至第185位(序列14)、第201位至第280位(序列15)、第300位至笫307位(序列16)、笫317位至第330位(序列17)、第344位至第351位(序列18)、第3"位至第3S1位(序列19)、第201位至笫225位(序列21)、第220位至第260位(序列22)、第264位至第280位(序列23)、第201位至第260位(序列24)、作为活性结构域保有至少一个上述氨基酸序列的多肽、上述各氨基酸序列中至少1个氨基酸置换和/或缺失的多肽、以及模拟它们的功能结构的合成肽或合成类似物、它们的经糖或糖链修饰的修饰体等，例如，模拟SP-B的合成肽KL-4(序列26)、SP-B与SP-C的融合型合成肽(序列30)等。〈B组〉肺表面活性蛋白C、以及由序列4所述的如下氨基酸序列构成的多肽(氨基酸编号为以N末端的Met作为第l位氨基酸，由此开始依次向C末端方向编)第1位至第197位(序列4)、第1位至第1卩1位(序列6)、第29位至第58位(序列9)、第24位至第58位(序列20)、第24位至第42位(序列25)、由序列6所述的第1位至第191位的氨基酸序列构成的多肽(氨基酸编号是以N末端的Met作为第l位氨基酸，由此开始依次向C末端方向编)、作为活性结构域保有至少一个上述氨基酸序列的多肽、上述各氨基酸序列中至少l个氨基酸置换和/或缺失的多肽、以及模拟它们的功能结构的合成肽或合成类似物、它们的经糖或糖链修饰的修饰体等，例如，合成SP-C(7-28)片段SP-CL(序列27)、SP-C-C(25-58)片段的第28~29位氨基酸残基CySCys被置换为PhePhe，第56位氨基酸残基Met置换为Ile的合成肽SP-C(FFI)(序列29)、与上述A组重复的SP-B与SP-C的融合型合成肽(序列30)等。〈C组〉磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸等磷脂、月桂酸、肉豆寇酸、软脂酸、硬脂酸、油酸等的脂肪酸等的脂质。(2)选择性诱导IgA抗体产生的粘膜疫苗，其特征是将上述(1)所述的载体量(V)与抗原量(A)的重量比V/A调整到约1以下。(3)上述(1)或(2)所述的粘膜疫苗，其中上述(1)所述的A组由序列2、7、8、10~19、21~24、26、和30所述的各氨基酸序列的蛋,白质构成。(4)上述(1)、(2)或(3)所述的粘膜疫苗，其中上述(1)所述的B组由序列4、6、9、20、25、以及27~30所述的各氨基酸序列的蛋白质构成。(5)上述(1)~(4)中任一项所述的粘膜疫苗，其中上述(1)所述的C组由磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆寇酸、软脂酸、硬脂酸和油酸的各脂质构成。(6)上述(1)或(2)所述的粘膜疫苗，其中上述的抗原(A)是来自于传染病病原体的灭活抗原或无毒化毒素。(7)变态反应的预防剂或治疗剂，其中上述U)和(2)的抗原(A)是变应原、变应原抗原表位、或来自于变应原的抗原。(8)粘膜免疫诱导方法，其特征是将上述(1)和(2)的载体量(V)与抗原量(A)的重量比V/A为约l用作为IgA抗体的选择性产生和IgA与IgG两抗体产生之间的转换点。以下就本发明的实施方式进行说明。(1)AD载体的组成上述的A组(肺表面活性蛋白B以及来自于或起源于该蛋白质B的天然和合成多肽组)、和/或B组(肺表面活性蛋白C以及来自于或起源于该蛋白质C的天然和合成多肽组)和C组(磷脂、脂肪酸等脂质组)3组的干燥重量％如下A组为约O.1~约6.0重量％、B组为约0.1~约6.0重量％、和C組为约88约99.8重量。/。。在抗原药物载体的制备中，按照重量％,调整为A组。/。+8组+(:组％=100%、或A组。/。+(:组％-ioo%、或B组+c组y。=100%。(2)AD载体的制备例(A、B和C3组的使用例)以下例举了制备过程。例如，分别称取A组2mg、B组2mg、C组96mg(按照重量％，A组。/Q+B组+C组。/。=100%)，将它们均匀混悬于5ml等渗液例如生理盐水或磷酸援冲液(PBS)中。得到的混悬液作为抗原药物载体(100mg/5ml)液供使用。该载体在每次使用时制备。混悬可使用超声波、均质器、混合器、振荡器等。由于超声波过分处理会易引起液体变性(粘性增加)，所以优选使用混合器例如箱式混合器(例如，商品名"旋涡混合器")。另外，C组的脂质96mg的组成中，可以采用例如磷脂酰胆碱71mg、磷脂酰甘油21mg、和磷脂酰丝氨酸Amg的混合等(脂质量合计96mg)。另外当使用报告的除去SP-A和SP-D而含有SP-B和SP-C的RDS治疗用的肺表面活性物质制剂，例如贝雷克坦、人造合成制剂Surfacxii^时，可以将根据其使用书制备的混悬液直接使用、或作为AD载体液使用。(3)粘膜疫苗的制备按照AD栽体量(V)相对于疫苗中的抗原量(A)的干燥重量比V/A为所期望的值那样在疫苗原液中添加AD载体液、混合进行配制。例如，对于抗原含量为50mg/ml的疫苗原液50^U,如果采用重量比乂/^=1,上述(2)制备的AD载体(50mg/ml)液的添加混合量为50ji1。另外，为了均匀混合，可以采用均质器、混合器、振荡器、搅拌器等。抗原指的是用于疫苗的高度纯化的纯度为约90%以上的来自于细菌的抗原、病毒抗原、类毒素等、以及来自于杉树花粉或螨等的纯度为约90%以上的变应原、蛋白质、糖蛋白质、高分子的糖质或核酸等。对于抗原质量的A值，可使用实测值，或使用根据抗原的純度、比活性、分子量、抗原抗体反应等测得的计算值，对于在重量比V/A的计算中的V值，由于在通常的制备中，AD载体的约90重量。/。以上为脂质或磷脂，因此可以使用脂质量或磷脂量代替AD载体量。本发明的粘膜疫苗中抗原的干燥重量(A)为约O.1~约50Mg/kg、优选约O.3~约30Mg/Kg。在这样的抗原量中，用于优先而选择性诱导IgA抗体产生的V/A优选约O.1~约l.0。而用于诱导IgA和lgG两抗体产生的V/A为约l.0~约IOO，优选采用约20~约50范围。在以上所述的V/A中，约60%以上的抗原与AD载体结合，由此得到的粘膜免疫疫苗可以有效地诱导IgA抗体产生和/或IgG抗体产生。以下给出参考例、实验例和实施例，就本发明的构成和效果进行具体说明。但本发明并不限定于这些具体例、说明和记载。参考例lAD载体制备和标准品如下使用Howood等人的方法(Biochemistry、24、184-190、1985)从牛肺制备的标准品；将该标准品用1-丁醇萃取后，除去水溶性蛋白成分SP-A和SD-D或者将之减少到检测限以下的标准品(HaasmanH.P.等人，J.Biol.Chem.，262，13977-13880，1987);分别含有从磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰胆碱等磷脂整体为40重量％以上、磷脂酰甘油为约10-约30重量o/。、磷脂酰丝氨酸为约2-约5重量％、软脂酸为约1.0-约20重量％等中选出的2种以上的脂质、以及含有来自于肺表面活性物质的脂溶性(疏水性)蛋白质、SP-B和/或SP-C的有效区域或含有该有效区域的合成肽例如由人SP-C的有效区域(序列20记栽的第24位合成肽约O.1-约12重量％，上述组成合计调整为100重量％的标准品；市售或众所周知的肺表面活性物质，例如商品名为Surfacten、Infasurf、Curosurf、Humansurf、Exosurf、Alveofact、Surfaxin等的肺表面活性物质。实验例l分裂型流感疫苗的制作使用来自于接种了A型流感病毒Aichi/68/2/H3N2林的发育鸡卵的悬浮液[lxl08PFU(蚀菌形成单位)](由川崎医科大学.微生物学教室大内正信教授提供)，通过以下操作制作分裂型流感疫苗。向用0.004MPBS[TakaBaBio公司(日本)制])透析整夜的病毒悬浮液中按照最终浓度达到8nM来添加0.05容量％的0-丙内酯[和光纯药抹式会社(日本)制]，并混合，在冰浴中孵育18小时，对病毒进行灭活。然后通过于37。C下孵育1.5小时，使P—丙内酯水解，水解结束后，按照最终浓度达到O.1重量％添加吐温80[和光纯药抹式会社(日本)制]，并混合，再添加与该吐温80等量的二乙醚[和光纯药林式会社(日本)制]，并混合后，于4。C下颠倒混合2小时。将该液体于2000rpm下离心分离5分钟，回收上清液。然后使用环境自动SeedV/Ac系统(AutomaticEnvironmentalSeedV/AcSystem)[SaV/AntInstrument公司(美国)制]，从上清液中除去二乙醚后，经Millex0."Mm滤膜[Millipore(美国)制]杀菌过滤，作为灭活分裂型流感疫苗原液使用。实验例2经鼻、粘膜疫苗的制备将实验例1中得到的分裂型流感疫苗原液与参考例1所述的AD载体标准品混合后使用。首先，将AD栽体按照达到给予疫苗必须的浓度用PBS(磷酸盐緩沖液)混悬后，室温下，经5分钟的超声处理做成均匀的混悬液。向该混悬液中相对于AD栽体(干燥重量)0.lyg添加上述疫苗原液(千燥重量)Q.1Mg,用旋涡混合器混合后，通过于室温下静置l小时制备IgA诱导用的经鼻粘膜疫苗。另外相对于AD栽体(干燥重量)1.Ojag添加上述疫苗原液(干燥重量)0.ljag后，与上述同样制备诱导IgA和IgG两种抗体用的经鼻粘膜疫苗。实验例3动物实验使用6周龄、雌性BALB/c小鼠[从日本SLC公司(日本)购入〗。全部动物实验在德岛大学医学部实验动物中心的感染动物房(P2水平)内，根据德岛大学医学部动物实验委员会的指导原则进行。实验例4经鼻给予在疫苗经鼻给予时，按照使实验例2得到的疫苗(干燥重量)浓度为O.ljag/一用PBS稀释，然后将该稀释液通过点鼻给予用乙醚麻醉的小鼠，按照两鼻腔各lpl，合计2^U/小鼠。对照组给予等量(2fi1)的PBS。初次免疫开始4周后，通过同样的点鼻进行2次免疫，从该2次免疫开始第2周，对于各小鼠分别制备鼻腔清洗液、肺胞清洗液和血清，将这些样品作为检品，进行对上述疫苗林病毒特异的IgA和IgG两抗体的测定。实验例5小鼠鼻腔清洗液、肺胞清洗液、血清的制备将给予疫苗的小鼠在戊巴比妥麻醉下开腹开胸后，切开气管，将带有AT0M静脉导管的3Fr[,阿童木医疗有限公司(日本)制]插入肺，注入lml生理盐水，回收该注入液。将通过反复3次操作采集的液体，合计3ml作为肺胞清洗液使用。采集肺清洗液后，由切开的气管向鼻腔方向插入ATOM静脉导管，注入lml的生理盐水，采集鼻流出液。将流出液作为鼻腔清洗液使用。另外从心脏采血后，将该血液于5000rpm下离心分离10分钟，取其上清液，作为血清。实验例6蛋白质的定量使用BCA蛋白检测试剂盒[Peirce公司(美国)制]测定鼻腔清洗液、肺清洗液和血清的蛋白质含量(Anal.Biochem.，150，76-85，1985)。使用光i普仪SPECTRAMaxPLUS384(分子仪器公司(美国)制)测定波长562nm的吸光度。实验例7对流感病毒特异的IgA和IgG两抗体的纯化为了在ELISA中作为定量的标准或基准使用，将上述IgA和IgG两抗体像下面那样进行纯化制备。通过使用重组大肠杆菌表达蛋白G琼脂糖斗B柱[ZymedLaboratories公司(美国)制]的亲和层析，给予流感疫苗，从流感病毒感染小鼠的肺胞清洗液纯化IgG级分。使抗小鼠IgA羊IgG抗体[Sigma公司(美国)制]结合于BrCN活化琼脂糖4B柱[AmershamBioscience公司(美国)制]上，通过使用该柱的亲和层析从直接穿过蛋白G的级分纯化IgA级分。为了从这些IgA和IgG级分纯化病毒特异性抗体，通过使免疫用的灭活分裂型流感疫苗抗原结合于BrCN活性化琼脂糖柱的抗原亲和层析，分别纯化制备流感病毒特异的IgA和IgG抗体。而为了作为配体的分裂型流感病毒抗原蛋白质与柱偶联，使用0.1MNaHC03/0.5MNaCl緩冲液(pH8.5)进行结合反应，游离的配体使用0.1M醋酸/0.5MNaC1(pH8.5)除去后，用PBS(pH7.5)中和。各亲和层析用PBS(pH7.5)进行亲和结合反应和除去游离抗体后，通过甘氨酸-HC1緩冲液(pH2.8)使特异性抗体洗脱下来。洗脱的级分立即用O.5MTris-HC1緩冲液(pH9.0)中和后，经MilliQ水进行透析后，冷冻干燥。这些IgA和IgG在使用时用PBS溶解，作为ELISA的标准试剂(抗体)使用。实验例8抗流感病毒IgA和IgG抗体的定量鼻腔清洗液、肺胞清洗液和血清中的抗流感病毒IgA和IgG抗体的含量通过ELISA进行定量。ELISA使用小鼠ELISA检测试剂盒[BethylLaboratories公司(美国)制]进行。向96孔Nunc免疫板[NalgenNunclnterna"onal公司(美国)制]的各孔添加100pl的1ug疫苗和lpg/ml牛血清蛋白[BSA;Sigma公司(美国)制]的PBS溶液后，于4。C下进行一夜的固化反应。然后用清洗液(50mMTris、0.14MNaCl、0.05重量％吐温20、pH8.0)洗3次，除去疫苗液。向各孔添加200^U的含有O.15MNaCl和l重量。/。BSA的50mMTris-HCL緩冲液(pH8.0)，于室温下进行l小时封闭反应。用上述清洗液将各孔清洗3次后，添加lOO(il的用样品结合緩沖液(50mMTris、0.15MNaCl、0.05重量％吐温20、l重量。/。BSA、pH8.0)适量稀释的鼻腔清洗液、肺清洗液、或血清，混合后于室温下反应2小时。使用抗体小鼠IgA羊IgG抗体或IgG-西洋辣根过氧化物酶(BethylLaboratories公司(美国)制)作为二次抗体，用TMB微孔过氧化物酶底物系统(MicowellPeroxidaseSubsatrateSystem)[Kirkegaard&PerryLaboratoties公司(美国)制]进行显色反应。然后，通过向各孔添加100^1的2MH2S04[和光纯药林式会社(日本)制]使反应停止后，用光谦仪SPECTRAMAXPLUS384测定450mm的吸光度。作为用于定量的标准试剂(抗体)，使用实验例7得到的从肺清洗液纯化的抗流感病毒IgA和IgG，与上述同样测定吸光度，将它们的测定值作为标准使用。实施例l(1)经鼻粘膜疫苗的制备作为"AD载体，，使用贝雷克坦[三菱Pharma公司社(日本)制]，通过将它与实验例1中得到的流感灭活疫苗的混合物经超声处理制备粘膜疫苗。贝雷克坦按照使用时达到各疫苗必须给予的浓度混悬于PBS,于室温经l分钟的超声处理做成均匀的混悬液。然后，相对于0.2yg疫苗(干燥疫苗量)，将上述贝雷克坦混悬液按照其磷脂量分别达到O(无添加)、0.02、0.1、0.2、1.0以及2.。jug的各浓度来添加，用旋涡混合器混合后，于室温下进行3分钟超声处理。各疫苗液都要在给予前于室温下温育l小时。(2)小鼠免疫在疫苗经鼻给予中，将各疫苗液用PBS稀释使之成为相当干燥疫苗重量为O.1Mg/pl的溶液，然后通过将该稀释液给予BALB/c小鼠的两鼻腔进行初次免疫。免疫4周后，用与初次免疫同样的方法进行2次免疫，从2次免疫2周后的各小鼠分别采集、制备鼻腔清洗液、肺胞清洗液和血清，在抗流感IgA和IgG的定量中使用。(3)免疫效果的判定在通过ELISA对上述鼻腔清洗液、肺胞清洗液和血清中(各制备如实验例5所述)的抗流感IgA和IgG两者水平进行定量(操作要领如实验例8所述)的同时，根据其显著性检验(t检验)的结果，评价作为"AD载体"的贝雷克坦对通过经鼻疫苗诱导粘膜免疫和/或体液性免疫的影响和效果。在疫苗中添加混合的贝雷克坦的量如果在O.2mg以下(以下记为"低剂量"组)，鼻腔和肺胞粘膜的抗流感IgA产生量依赖于贝雷克坦量增加(图1和图2)。然而，并未在该低剂量组中看到IgG产生量随着贝雷克坦的增量而增强，而血中抗体、IgA和IgG的产生都没有被诱导(图3)。另外在图13中，各疫苗给予组的小鼠数n-8~U、平均值土SD(标准偏差)、显著性水平表示对于未添加贝雷克坦的疫苗(Oiag)给予组的显著性水平、+表示？<0.08、++表示？<0.05、++十表示p〈0.01、而*表示对于添加贝雷克坦O.1yg的疫苗给予组的显著性水平、p<0.01。而当贝雷克坦的量在l.0至2.0mg(以下记为"高剂量"组)范围时，鼻腔和肺胞粘膜的抗流感IgG产生量依赖于贝雷克坦量增加(图1和图2)。而血中的IgG产生量也在使用2.Oiag的贝雷克坦组中看到显著性增强(图3)。而对于该高剂量组的IgA产生量，与上述低剂量组的IgA产生量相比并未检测出显著性增强，并未看到低剂量组的粘膜免疫效果的高涨(图1和图2)。(4)由"IgA产生"向"IgA和IgG两者产生"的切换点的确定由于上述结果表明干燥疫苗重量(0.2jag)与贝雷克坦(AD载体)中的磷脂的变量(0~2.Opg)相关，所以上述的切换点作为AD载体中的磷脂量/干燥疫苗量的重量比(以下记为"V/A"),如下那样算出、确定(a)当V/A为约l.0以下时，产生IgA;(b)当V/A超过约l.0时，IgA和IgG两者都产生；和(c)由"IgA产生"向"IgA和IgG两者产生"的切换点确定为V/A为约l附近。另外对于上述V/A计算中的V值，使用AD载体中的磷脂量(重量)。而本发明的AD栽体的构成成分中通常由于90重量。/。以上为磷脂，所以对于在实施本发明时的重量比V/A的调节，可判断作为V值不仅可采用磷脂量，也可采用脂质量(包含磷脂)或AD载体量(干燥重量)。实施例2(1)人肺表面活性蛋白的合成定做、购入纯度95。/。以上的人SP-C的有效区域(序列20)的合成肽、FGIPCCPVHLKRLLIVVVVVVLIVVVIVGALLMGL[GreinerBio-One公司(德国)合成]。将它按照使蛋白质的量达到10mg/ml混悬于CM緩沖液(氯仿/乙醇以容量比2:l混合的緩沖液)，作为合成SP-C混悬液，用于后述的人造AD载体(人造的人肺表面活性物质)的制备。(2)合成AD栽体的制备具有作为肺表面活性物质的结构和功能的人造表面活性物质的制备采用Takei等人的方法(Biol.Pharm.Bul1.，1996，19，1247-1253)进行。即，将二棕榈酰磷脂酰胆碱[和光纯药(日本)制]、磷脂酰甘油和软脂酸按照75:25:IO(重量比)混合，按照使磷脂达到10mg/ml浓度混悬于CM混合液(氯仿/曱醇的容量比为2:l的混合液)，制成脂质成分混悬液。向上述的SP-C混悬液中添加等容量的三氟乙酸(TFA)，并混合，完全溶解。然后SP-C量按照使脂质成分中的磷脂重量达到2%(w/w)向SP-C溶解液添加混合上述的脂质成分混悬液，然后，使用旋转蒸发器，于40。C下进行干固。将它按照使磷脂达到10mg/ml而再次混悬于10%乙醇液中，于45。C的水浴中振荡混合1S分钟。将它冷冻千燥后，制成人造的干燥的人肺表面活性物质(合成AD载体)，于-30~4。C下保存。(3)经鼻粘膜疫苗的制备上述的人造干燥AD栽体按照使磷脂达到30mg/ml来混悬于PBS中，于室温下通过1分钟超声处理做成均勾的混悬液。相对于实验例1中得到的疫苗(干燥重量)0.2jug，按照换算成磷脂量为2.Oyg来添加上述的人造表面活性物质、或作为免疫诱导效果的阳性对照的贝雷克坦(实施例l所述)，用旋涡混合器混合后，于室温下进行3分钟超声处理。得到的经鼻粘膜疫苗在给予前温育l小时。在疫苗经鼻给予时，用PBS稀释疫苗液使之成为疫苗浓度为0.1ug/jil的溶液后使用。(4)小鼠免疫与实施例l所述同样对各BALB/c小鼠进行免疫，从2次免疫2周后的各小鼠分别采集、制备鼻腔清洗液、肺胞清洗液和血清，用于抗流感IgA和IgG的定量。(5)免疫效果的判定与实施例l同样操作，在通过ELISA对抗流感IgA和IgG两者水平进行定量的同时，根据其显著性检验的结果，对作为经鼻'粘膜疫苗的"AD载体"的含有合成PS-C的人造人肺表面活性物质(合成AD载体)对粘膜免疫和/或体液性免疫的诱导的影响和效果进行评价。就鼻清洗液来说，人造表面活性物质混合疫苗给予组的IgA产生量显著性增强，处于与阳性对照的贝雷克坦混合疫苗给予组的量几乎同一水平。同时还可以检测到在没有添加AD载体的疫苗组所检测不到的IgG的产生(图4)。另外在图4~6中，口表示IgA产生量、議表示IgG产生量、疫苗给予组的小鼠数n-4、平均值土SD(标准偏差)、显著性水平表示对给予未添加AD载体的疫苗组的显著性水平、+表示？<0.01、++表示p〈0.05。对于肺清洗液来说，人造表面活性物质混合疫苗给予组的IgG产生量与作为阳性对照的贝雷克坦混合疫苗给予组的IgG产生量同样地显著性增强。另外，虽然检测到IgA产生，但其产生量在与未添加AD载体的疫苗给予组之间没有看到显著性差异。而对于IgA产生量，由于在与贝雷克坦混合疫苗给予组的产生量之间也没有看到显著性差异，因此人造表面活性物质混合疫苗诱导IgA产生的能力被评价为与作为阳性对照的贝雷克坦混合疫苗的诸导IgA产生的能力近似(图5)。在血中，人造合成表面活性物质混合疫苗给予组的IgG产生量显著性增强，几乎与阳性对照的贝雷克坦混合疫苗给予组处于同一水平(图6)。根据以上的结果，人造合成表面活性物质与来自牛的贝雷克坦同样地被判定为具有粘膜和体液性两免疫的诱导能力。实施例31.样品人造肺表面活性物质制剂贝雷克坦(ST)由三菱Pharma公司购入。流感分裂疫苗A/纽约/55/2004(H3N2)、A/新喀里多尼亚(NewCaledonia)/20/99(H1N1)、B/上海/361/2002从财团法人大阪大学微生物病研究会获得。合成表面活性物质制备基材DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)由和光纯药林式会社或Sigma公司获得，E-PG(蛋(卵)-磷脂酰甘油)由Avanti公司或Sigma公司获得、PA(软脂酸)由和光純药林式会社获得。—，.—、—,呻一，SP-B(1-25)(序列21)、SP-B(20-60)(序列22)、SP—B(64—80)(序列23)、SP-B(1-60)(序列24)、SP-C(1-19)(序列25)、作为呼吸障碍治疗药开发和研究中的合成肽KL-4(序列")、SP-CL(7-28)(序列27)、SP-C33(序列28)、SP-C(FFI)(序列29)、SP-C(KLS)(序列30)。蛋白质和磷脂检测试剂盒BCATM蛋白检测试剂盒由PIERCE公司购入，磷脂CTestWako由和光纯药才朱式会社购入。2、方法1)合成AD载体的制备合成肽用适当的溶剂溶解。而难溶性合成肽按照5-20mg/ml浓度溶解于TFA中。将溶解于氯仿甲醇(2:1、v/v)(CM)混合液的DPPC、e-PG和PA脂质混合物(用75:25:10;w/w/w)(以下称为3种脂质混合液)添加到用TFA溶解的合成肽(相对于磷脂(PL)为O.6-2.0%(摩尔))中混合。将该混合液用减压浓缩机减压干固。向该干固物添加10%乙醇水溶液，用N-NaOH水溶液将pH调整到6-7后，于42-45°C下加热处理3-10分钟。冷却后，成为1-10mgPL/ml的浓度，分别注入l-5mgPL当量，冷冻干燥。将得到的冷冻干燥物即合成AD载体混悬于生理盐水，在与疫苗的结合试验中使用。具体来说，做成以下的AD载体(合成表面活性物质合成AD载体ST)。(1)合成AD载体SSF-14的制备取O.27mg合成肽SP-B(1-25)，按照终浓度达到5mg/ml的浓度溶解于TFA。将溶解于CM混合液的3种脂质混合物按照脂质混合物相对于磷脂达到0.6%(摩尔)添加到用TFA溶解的合成肽中，将该混合液用减压浓缩机减压干固。向该干固物加10%乙醇水溶液，用N-NaOH水溶液将pH调整到6-7后，于42-45。C下加温处理3分钟。放冷后，作为磷脂浓度做成2mg/mL,按照每份1-5mgPL当量，分注到1.5mL容量的微管中，进行冷冻干燥，制备SSF-14。(2)合成AD载体SSF-28、SSF-30、SSF-24、SSF-43的制备与上述同样，使用合成肽SP-B(1-60)制备SSF-28，使用SP-B(20-60)制备SSF-30,使用SP-B(64-80)制备SSF-24，使用SP-C(1-19)制备SSF-43。(3)由合成AD载体SSF-44制备SSF-48与上述同样，使用KL-4制备SSF-45，使用SP-CL(7-27)制备SSF-44，使用SP-C33制备SSF-46,使用SP-C(FFI)制备SSF-47，使用SP-C(KLS)制备SSF-48。(4)含有SP-B与SP-C的合成AD载体SSF-41的制备分取合成肽SP-B(64-80)和SP-C(1-35)，按照最终为5mg/mL的浓度溶解于TFA。将3种脂质混合物按照3种脂质混合物相对于磷脂达到O.6。/。摩尔添加到用TFA溶解的合成肽中，然后进行与上述同样的操作，制备SSF-41。2)AD栽体以及合成AD栽体与疫苗的结合试验(1)AD载体表面活性物质(AD载体ST)与疫苗的结合试验AD栽体浓度为O.5mg/mL、Vac浓度为0.05mg/mL，它们的比为10:1，于液量O.4mL规模下进行混悬试验。向ST中以30mg/mL浓度加入生理盐水，吸液，获得混悬液。然后将其中的7ML混悬液取到Eppendorf离心管，再加382jaL生理盐水，使用索尼法伊厄(SONIFIER)250D数字式超声波细胞破碎仪(Branson)，于水水冷却下超声处理1分钟。然后加11jaL疫苗溶液[A/新嚷里多尼亚/20/99(H1N1)、1.78迈gProt/mL]，于冰水冷却下超声处理3分钟。然后于室温下放置2小时，其间每隔30分钟，緩慢地颠倒混合3-5次。使用微控高速冷冻离心机(TomyMX-301)将该AD载体ST-疫苗混合液于4-5°C、20，000xg下离心15分钟。从得到的上清液中取出25jaL，以疫苗量作为蛋白质量用BCA"4蛋白检测试剂盒进行测定。此时3种疫苗(A/纽约、A/新喀里多尼亚和B/上海)与AD载体ST的结合率是60-70%。(2)含有SP-B片段的合成AD载体与疫苗的结合试验代替上述(1)的AD栽体ST，使用合成AD载体SSF-H、SSF-30、SSF-24。另外，疫苗使用A/新喀里多尼亚。合成AD载体浓度(使用磷脂"CTestWako"(和光纯药制、433-36201)测定的磷脂换算值)为2.5mg/mL、疫苗浓度为O.05mg/mL，它们的比为50:1、在液量O.4mL规模下，根据上述(1)进行结合试验。结果如表1所示。疫苗与SSF-14的结合率不到60%,SSF-24和SSF-30的结合率在90%以上。(3)含有SP-C片段的合成AD载体与疫苗的结合试验测定SSF-43与疫苗(A/新喀里多尼亚)的结合率。合成AD栽体浓度(磷脂换算)为0.5mg/mL、疫苗浓度为0.05mg/mL，它们的比为10:1、在液量0.4mL规模下，根据上述(1)进行结合试验。结果如表2所示。疫苗与SSF-43的结合率为约80。/0。(4)合成AD载体SSF-28与各种疫苗的结合试验对于作为合成AD栽体使用SSF-28，作为疫苗使用A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)、A/纽约/55/2004(H3N2)和B/上海/361/2002，也进行两者的结合试验。其结果如表3所示那样，各疫苗与SSF-28的结合率在60o/o以上。(4)合成AD载体SSF-44至SSF-48与疫苗的结合试验作为合成AD载体使用SSF-45、SSF-44、SSF-46、SSF-47和SSF-48，与上述同样进行结合试验。就像表2所示那样，疫苗与各个合成表面活性物质的结合率在600/。以上。表l含有合成肽的合成AD载体与流感疫苗的结合试验合成AD载体___^_____结合率(％)SSF-丄4_____一SPi"一J51________SSFJ____SP-B(20-60)_________91」—SSF-24—SP^B丄64-80)一91丄3一SP-B(64-80)SSF—41,、85.1+SP-C(l-35)表2含有合成肽的合成AD载体与流感疫苗的结合试验<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表3各种流感疫苗与合成AD载体SSF-28的结合试验<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例4鼻粘膜淋巴组织因动物种类不同而存在很大差别，在小鼠和大鼠的鼻腔粘膜中，存在大量相当于肠的集合淋巴结的淋巴组织，而在人的鼻腔粘膜中却看不到相当于肠的集合淋巴结的淋巴组织，因此小鼠和大鼠的经鼻粘膜疫苗的实验结果不能说可直接适用于人。人的鼻腔、喉头部的淋巴组织是由扁桃腺、腺样的淋巴组织构成的以瓦尔代尔扁桃体环为中心的淋巴组织，具有与该组织较为类似的淋巴组织的动物是猪。因此，以在小鼠中得到的AD载体的结果为基础，以假定对人的治疗试验的临床前实验，使用迷你猪验证AD载体效果，进行治疗试验时的AD载体的给予量、给予方法、副作用的研究。1);f羊品和方法(1)迷你猪断奶期后的迷你猪使用1-2个月龄(体重2.2-6.6Kg)。使用通过用通常感染的各种病毒、细菌、寄生虫等22种检验确认无异常的猪，1组3头。(2)病毒抗原使用A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)的分裂抗原。(3)表面活性物质制备使用从三菱Pharma公司购入的贝雷克坦(surfacten)(AD栽体ST)。(4)蛋白质和磷脂测测试剂盒BCATM蛋白检测试剂盒从PIERCE公司购入，磷脂"CTestWako"从和光纯药购入。2)方法(1)接种方法、检品采集方法疫苗的接种、采血、鼻腔粘液在麻醉下进行。为了算定麻醉量，提前测定迷你猪的体重，在盐酸美托咪啶(明治制果(林))与卜'A力厶(商品名)(Astellas制药(林))注射的混合麻醉下进行。釆血从总静脉窦进行。鼻腔粘液的采集在用灭菌棉棒将左右的鼻腔内部各擦试2次后，浸于2ml的生理盐水挤取。对一部分鼻腔粘液立即进行细胞病理诊断，研究鼻腔内有无炎症反应。体重、体温每周测定一次，l日2次巡视健康状况，并进行记录。(2)抗原特异性的抗体效价的测定根据小鼠的抗原特异性的抗体效价的测定进行，使用抗猪IgA、IgG2次抗体的酶抗体法(ELISA)进行。3)结果使流感A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)的分裂抗原与AD栽体ST结合，然后混悬于10(V1的生理盐水中，点鼻给予在通常的病原体检查中无异常的迷你猪(NIBS系)，测定对疫苗的特异性抗体(IgA、IgG)的产生量。在初次给予4周后用与初次同样的方法进行加强给予，2周后结束测定。在抗原量为O.3pg/Kg、1.5Mg/Kg、4.5yg/Kg、15Mg/Kg、30jag/Kg的5组的情况下进行。对于抗体效价的测定，为了评价局部的粘膜免疫系统测定鼻腔粘液的抗体产生量，为了评价全身免疫系统测定血液中的抗体产生量。结果表明，即使将单独分裂流感抗原按照O,3-30jag/Kg体重经鼻给予，几乎没有改变疫苗给予前的鼻腔粘液和血液中的IgA、IgG值，即使有微量增加，也没有增加到有效的感染防御抗体浓度(抗原特异性的IgG、IgA,40抗体效价以上)。如果将向该分裂流感抗原添加作为佐剂的其重量比的10倍量的AD载体ST而使两者结合的混悬液经鼻给予，鼻腔粘液中特别是IgA特异性抗体，血液中特别是IgG特异性抗体依赖于给予的抗原量(0.3-30mg/Kg)被显著诱导。特别是依赖于按照抗原量4.5jLig30jag/Kg体重给予的抗原量可诱导抗原特异性抗体直至200~800抗体效价，证明AD载体ST的极其有效的佐剂效果，予以说明，其中所谓规定的疫苗特异性抗体的IgA抗体效价、IgG抗体效价是以给予疫苗前的鼻腔粘液或血液与疫苗抗原反应所显示的测定值的平均值作为基准，测定将检品稀释多少倍可达到给予疫苗前的值，用该稀释值作为抗原特异的IgA、IgG的抗体效价。鼻腔粘液中的抗体产生中，IgA抗体效价比IgG抗体效价高5-8倍，IgA优势地产生。而依赖于抗原量的IgA抗体效价、IgG抗体效价的增加倾向中没有看到大的差别。鼻腔粘液中的两抗体的产生如果初次给予是轻度的，经加强给予表现出显著增加。但鼻腔粘液中的IgG，即使对于单独分裂流感抗原，加强给予后虽然低，但也看到约IO倍的增加。而血液中的抗体产生，IgG抗体效价比IgA抗体效价高1-1.6倍，血液中IgG^皮优势诱导。而且经初次免疫无论哪一种抗体的抗体效价都增加至100-200，经加强给予，其抗体效价IgG、IgA都进一步增加4倍。对于单独分裂流感抗原，血液中的IgG虽然在加强给予后比较低，但也看到有约10倍的增加。另外在任一个检品中都没有观察到作为鼻腔炎症反应的炎症性细胞的浸润。产业实用性本发明的"AD栽体"可以通过任意的疫苗用抗原、类毒素、变应原、药剂等的经粘膜、经皮等而安全地给予或接种。而且，通过调整AD载体量(V)与其负载的物质、例如与抗原量(A)之间的重量比V/A,可以调节"AD载体"诱导抗体产生的功能。即"AD栽体"在V/A为约1以下时优先选择性诱导IgA产生，如果将V/A调整到超过1，则诱导IgA和IgG两种抗体产生。但当将比较多的量的疫苗抗原(15mg/Kg以上)经鼻接种时，不管V/A量比如何，粘膜免疫的IgA与全身免疫的IgG都被诱导。因此，AD载体作为经鼻粘膜疫苗、变态反应的治疗剂.预防剂等有效成分的栽体或传送和输送手段可广泛应用，可在疫苗和涉及变态反应治疗等的医药品、兽药、水产药等产业领域中活用和利用。权利要求1.诱导IgA和IgG两种抗体产生的粘膜疫苗，它是通过使诱导粘膜免疫IgA的量的抗原与抗原药物(AD)载体共存、接触、捕捉或吸附而得到的粘膜疫苗，所述抗原药物(AD)载体是由从肺表面活性蛋白B、其片段和模拟它们的功能结构的合成肽(A组)选出的至少1种蛋白质，和/或从肺表面活性蛋白C、其片段和模拟它们的功能结构的合成肽(B组)选出的至少1种蛋白质，以及从脂质类(C组)选出的至少1种脂质构成的复合体，其特征在于，将上述载体的干燥质量(V)与上述抗原的干燥质量(A)的重量比V/A调整为超过约1以上。2.选择性诱导IgA抗体产生的粘膜疫苗，其特征在于，将权利要求l所述的载体量(V)与抗原量(A)的重量比V/A调整到约1以下。3.权利要求1或2所述的粘膜疫苗，其中权利要求1所述的A组由序列2、7、8、10~19、21~24、26和30记载的各氨基酸序列的蛋白质构成。4.权利要求l、2或3所述的粘膜疫苗，其中权利要求1所述的B组由序列4、6、9、20、25、和27~30记载的各氨基酸序列的蛋白质构成。5.权利要求l~4中任一项所述的粘膜疫苗，其中，权利要求l所述的C组由磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、月桂酸、肉豆寇酸、软脂酸、硬脂酸和油酸的各脂质构成。6.权利要求1或2所述的粘膜疫苗，其中，上述的抗原(A)是来自于传染病病原体的灭活抗原或无毒化毒素。7.变态反应的预防剂或治疗剂，其中，上述的抗原(A)是变应原、变应原抗原表位、或来自于变应原的抗原。8.粘膜免疫诱导方法，其特征在于，使用权利要求l所述的载体量(V)与抗原量(A)的重量比V/A为约l作为选择性产生IgA抗体和产生IgA与IgG两抗体之间的转换点。全文摘要本发明以安全而有效的经鼻·灭活·粘膜疫苗的实用化，赋予以往的灭活疫苗、类毒素、变应原等产生IgA与IgG两种抗体的能力的技术、变态反应的预防和治疗手段等的确立作为课题，可提供可经鼻、经粘膜和经皮给予的抗原药物载体(AD载体)，使用该载体的同时诱导粘膜免疫和体液性免疫的灭活疫苗及其制备技术，可由选择性诱导IgA抗体产生向诱导IgA和IgG两种抗体产生转换的AD载体，使用该载体的经鼻疫苗、粘膜疫苗、变态反应的治疗剂和预防剂等。文档编号A61K39/00GK101257919SQ20068002890公开日2008年9月3日申请日期2006年8月4日优先权日2005年8月5日发明者木户博,水野大申请人:国立大学法人德岛大学