专利名称：一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白及其载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，涉及一种结构融合分子，特别是一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白及含有此融合蛋白编码基因的载体。
背景技术：
乙肝是危害人类健康的一大疾病，在我国尤其严重。由于传统的血源性疫苗安全性差，产量较低，因此已被基因工程疫苗所取代。由于大部分乙肝患者为幼儿时期感染病毒，处于对HBSAg的免疫耐受状态，现存的基因工程疫苗虽然可以在大部分人中诱导出抗体，但对于已经感染乙肝病毒的患者作用不大。因为对于病毒和胞内菌而言，中和性抗体可以阻断它们进入胞内，但不能清除已经进入细胞内的病毒或者细菌。对于此类患者，需要能诱导出较强细胞免疫应答的治疗性疫苗。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3种蛋白组成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前市场上的乙肝疫苗主要为S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2区含有许多重要的T、B抗原决定簇，它们在增强S蛋白的反应、克服对S蛋白的无反应中起着重要作用。
因此，研究一种包含有preS1或preS2区的疫苗，并且达到提高细胞免疫应答、低毒、易于制备的效果是目前现有技术中急需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分为乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分为鼠IgG1 Fc段。
进一步的，所述的融合蛋白的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
进一步的，所述的融合蛋白的第一部分具SEQ ID NO3有所示的基因序列，所述的融合蛋白的所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。
进一步的，所述的融合蛋白的所述的第一部分和第二部分通过设计限制性酶切位点来进行连接。
本发明的目的还在于提供所述的融合蛋白在制备乙肝疫苗的药物中的应用。
本发明的目的还在于提供一种载体，含有上述所述的融合蛋白的编码基因。
进一步的，所述的载体含有SEQ ID NO9所示的基因序列。
进一步的，所述的载体含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
本发明的目的还在于提供所述的载体在制备乙肝疫苗的药物中的应用。
本发明的目的还在于提供制备所述的融合蛋白的方法，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)获得鼠IgG1 Fc段编码基因；3)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体，通过原核或者真核细胞表达获得表达蛋白。
本发明的目的还在于提供制备所述的载体的方法，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)获得鼠IgG1 Fc段编码基因；3)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体。
更具体的，制备上述所述的载体的方法，包含以下步骤1)设计扩增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合适酶切位点的引物，2)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，3)设计扩增鼠IgG1 Fc段编码基因的合适酶切位点的引物，4)获得鼠IgG1 Fc段编码基因，5)将获得的preS2-S克隆入含有相应酶切位点的PcDNA3质粒，获得PCS2S载体，再将IgG1 Fc克隆入含有相应酶切位点的质粒PCS2S，获得PCMFS载体。
本发明的目的还在于提供一种抗体化的乙肝疫苗，含有上述所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明的目的还在于提供一种抗体化的乙肝疫苗，含有有效量的上述所述的载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明人通过长期而广泛的研究发现，将乙肝表面抗原与IgG的Fc段融合，可通过抗原摄取方式和递呈方式的改变，从而可从根本上打破乙肝免疫耐受，显著提高治疗性疫苗的效果。
乙肝表面抗原是乙肝病毒的包膜蛋白，由3种蛋白组成主蛋白(S)、中蛋白(M)和大蛋白(L)，目前的乙肝疫苗主要为S蛋白疫苗，而M和L蛋白N端的preS1和preS2区含有许多重要的T、B抗原决定簇，它们在增强S蛋白的反应、克服对S蛋白的无反应中起着重要作用。另外preS2通过人多聚白蛋白介导结合于肝细胞的表面，所以含pres2的疫苗可与HBV竞争从而阻断HBV的感染途径。故我们设计的乙肝疫苗包含了preS2和S基因。
IgG Fc能与Fc受体结合，preS2和S基因与鼠IgG1 Fc段的融合一方面能促进融合蛋白被DC细胞的摄取，另一方面融合蛋白在胞内与Fc受体结合，促进了PreS2-S蛋白以内源性抗原的方式进行递呈，从而有利于活化CD8+T细胞，促进了特异性的细胞免疫应答。鉴于APC细胞表达的Fc受体以FcγR为主，而IgG1与FcγR亲和力较强，因此我们选择了来自IgG1亚型的Fc段。并且，Fc段与Fc受体结合的位点位于铰链区和CH2段，且抗体的铰链区富含脯氨酸而易于伸展弯曲，能够使融合蛋白的两个部分之间的位障减到最小程度，所以我们选择的Fc段包括铰链区Hinge和CH2+CH3。
因此，在本发明中，所述的融合蛋白将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S作为融合蛋白的N端，可作为疫苗抗原部分；鼠IgG1 Fc段作为融合蛋白的C端，可使疫苗具有抗体化特征。
本发明将获得的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及获得的鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体成为基因疫苗，通过原核或者真核细胞表达获得表达蛋白成为蛋白疫苗，所述的基因疫苗的5’端为抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S组成的preS2-S基因；它的3’端为抗体的Fc段基因。所述的蛋白疫苗的N端为抗原表位部分，由表面抗原前S蛋白preS2和主蛋白S组成，它的C端为抗体的Fc段。
本发明的融合蛋白可以通过多种方式制备获得，包括但不限于a)化学合成；b)将目的基因克隆入适当的载体，表达出目的融合蛋白。所述融合蛋白的第一部分和第二部分之间可以是带有连接序列(linker)的或直接相连接的；优选的，第一部分和第二部分之间可直接相连，直接利用抗体分子的绞链区富含脯氨酸而易于伸展弯曲的特性，将两部分连接起来，在保证了各自功能基团的独立性的同时也有助于形成稳定的空间结构。
在本发明中，用于克隆入目的基因的载体包括任何哺乳动物细胞转化用载体，或病毒载体，尤其是各种市售的载体或病毒载体。包括但不限于PcDNA、pEGFP、pSEc、pMG18、pGL3等。
在本发明中，可用于转化所述融合基因的载体的细胞为原核或者真核生物细胞，比如、CHO细胞等。
将特定DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转化方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达所需的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。
在本发明中，所述的药物组合物中有效成分的存在形式包括但不限于以下几类a)乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段的融合蛋白；b)含有乙肝表面抗原前S抗原和主蛋白S以及鼠IgG1 Fc段基因的载体；c)含有b)所述的载体并且可表达所述融合蛋白的细胞。在给药时，可直接给予a)、b)、c)任一所述的有效成分，以及药学上可接受的载体。
在本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
在本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将具有活性的成分传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述的载体可以是液体或固体。
本发明的药物组合物，它含有上述的有效成分，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的有效成分以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
本发明所构建的抗体化乙肝疫苗，经过肌肉基因免疫小鼠的方法，证实其可以诱导很强的体液免疫应答和细胞免疫应答，具有比传统疫苗更好的效果。
图1显示了抗体化乙肝疫苗融合分子的质粒模式图。
图2显示了构建融合分子的PCR结果。其中第1、5泳道为DNA marker；第2泳道为preS2S+Fc融合分子；第3泳道为preS2S；第四泳道为mouse IgG1Fc。
图3显示了PCMFS的酶切鉴定结果。其中第1泳道为PCMFS经Hind III和NotI双酶切结果；第2泳道为PCMFS经Hind III单酶切结果。
图4显示了PCMFS的测序鉴定结果。其中A、B为以T7为测序引物的正向测序，A为测序部分序列，其中，第十八至第二十个碱基所示的序列为起始密码子atg，B为相应的峰图；C、D为以SP6为测序引物的反向测序，C为测序部分序列，第三十六至第三十八个碱基开始的序列为终止密码子tga的反向互补序列tca，D为相应的峰图。
图5显示了以PCMFS转染C2C12细胞，收集不同时间的转染和未转染上清，抽滤至硝酸纤维素膜上，以小鼠抗人HBsAg单克隆抗体、生物素化的马抗小鼠二抗和ABC、DAB检测，其中，1.未转染上清24-72小时；2.PcDNA3质粒转染上清24-72小时3.PCMFS质粒转染上清24-72小时。
图6显示了PCMFS质粒转染C2C12细胞后72小时细胞内目的基因的转录水平的检测。1.PCMFS质粒转染组；2.PcDNA3质粒转染组；3.阳性对照。
图7显示了C2C12细胞中HBsAg的转录水平及上清和细胞裂解物中HBsAg的表达情况。
图8显示了显示了抗体化乙肝疫苗在体外的表达情况，a为pcDNA3肌注局部HBsAg蛋白的检测；b为PCMFS肌注局部HBsAg的检测。
图9显示了PCMFS免疫组同PCS2S组一样，可以诱导小鼠产生体液免疫应答。
图10显示了不同质粒免疫小鼠脾脏细胞的增殖情况。结果显示在用特异性抗原HBsAg刺激时PCMFS免疫组小鼠的增殖能力比PCS2S免疫组强。ConA为非特异性的淋巴细胞激活剂，可以刺激不同组的淋巴细胞增殖，1640组为阴性对照。
图11显示了不同质粒免疫小鼠脾脏细胞的特异性杀伤情况。可见用特异性抗原HBsAg刺激后，PCMFS免疫组小鼠脾脏细胞对表达表面抗原的SP2/0-preS2S细胞有更强的杀伤能力。
具体实施例方式
以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。
实施例中采用的质粒、菌种、细胞、动物及试剂如下质粒、菌种、细胞、动物、质粒pcDNA3、PEHH、宿主细菌DH5α、细胞SP2/0为本实验室保存。将编码preS2S的质粒PCS2S转入SP2/0细胞得到表达表面抗原的细胞SP2/0-preS2S。基因合成委托上海博亚公司。4-6周龄雌性BALB/c(H-2Kd)小鼠购自复旦大学实验动物中心。
分子生物学试剂限制性核酸内切酶HindIII、EcoRV、Not I(TaKaRa公司)、T4DNA连接酶(MBI公司)；Taq DNA聚合酶(Promega公司)；RNaseA(Ameresco公司)；dNTP(Promega和华美生物公司)；LB培养基(英国OXOID公司)，琼脂粉、琼脂糖、SDS、EB、重蒸酚(上海化学试剂采购供应站)，Tris(USB公司)，琼脂糖胶回收试剂盒(上海华舜生物制品公司)，小鼠抗人HBsAg单克隆抗体(上海科华公司)，HBsAg蛋白纯品(北京肝炎所)ABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，CFSE、7-AAD(Sigma公司)。
细胞培养、转化试剂细胞培养试剂(Gibco BRL公司)。Lipofectamin2000真核细胞转染试剂(Invitrogen公司)。
实施例1抗体化乙肝疫苗的设计、构建和鉴定1.PreS2-S和鼠IgG1 Fc编码基因的扩增本发明所设计的抗体化乙肝疫苗由乙肝表面抗原和鼠IgG1 Fc段构成，中间不加linker，为了保证两个部分各自功能基团的独立性以及形成稳定的空间结构，我们将表面抗原设计在融合分子的N端，Fc段则在融合分子的C端，类似于完整的抗体分子。
乙肝表面抗原PreS2-S编码基因以质粒PEHH为模板，进行PCR扩增，采用的引物见表1(SEQ ID NO5和SEQ ID NO6)，在设计引物的同时引入酶切位点Hind III和EcoR V。
鼠IgG1 Fc段编码基因从小鼠来源的杂交瘤细胞520C9中扩增，细胞培养在RPMI1640(含10％小牛血清，1000u/ml青霉素，100mg/ml链霉素)中，用Trizol抽提细胞总RNA，以逆转录获得的cDNA第一链为模板，PCR方法扩增Fc编码基因，采用的引物见表1(SEQ ID NO7和SEQ ID NO8)，在设计引物的同时引入酶切位点EcoR V和Not I。
酶切鉴定结果如图2所示。
表1引物设计 2.抗体化乙肝疫苗的构建如图1所示，将PreS2-S以限制性酶切的方式克隆至载体PcDNA3的相应位点上，构成质粒PCS2S，再将鼠IgG1 Fc以限制性酶切的方式克隆至质粒PCS2S的相应位点上，构成质粒PCMFS。
具体地，将上述扩增得到的基因产物以胶回收试剂盒回收纯化，并用Hind III和EcoR V双酶切，同时将载体PcDNA3双酶切，酶切后经电泳回收纯化，以T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨卞青霉素抗性平板，阳性克隆质粒进行酶切及测序鉴定。
经鉴定构建成功的质粒PCS2S和Fc PCR产物用EcoR V和Not I双酶切，酶切后经电泳回收纯化，以T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于氨卞青霉素抗性平板，阳性克隆质粒经酶切及测序鉴定，鉴定构建成功的质粒包含编码抗体化乙肝疫苗的融合基因(SEQ ID NO9)，称之为PCMFS，其相应的蛋白质序列见SEQ ID NO10。PCMFS的酶切鉴定结果见图3，其中第1泳道为PCMFS经Hind III和NotI双酶切结果；第2泳道为PCMFS经Hind III单酶切结果。
PCMFS的测序鉴定结果见图4，左侧为以T7为测序引物的正向测序，右侧为以SP6为测序引物的反向测序。
实施例2PCMFS的体外转染依照Lipofectamine2000真核转染试剂说明进行C2C12细胞培养于完全1640培养基，转染前一天以5×105C2C12细胞加入35mm六孔板，待细胞密度为80％时进行转染。取10μl Lipofectamine2000加至90μl不完全1640培养基中，即为溶液A；取2μl(约3-5μg)经QIAGEN试剂盒纯化的质粒，即为溶液B；将溶液A加入溶液B中，轻轻混匀，室温作用20-25分钟促进复合物的形成。室温孵育时，吸去培养上清，并以PBS洗涤细胞一次，逐滴将A、B复合物加入六孔板中，再加入800μl不完全1640培养基，轻轻混匀。37℃ 5％CO2培养5小时后，加入含有20％NBS的完全1640培养液，继续培养至收集上清，置-20℃保存；在六孔板中每孔加入1mlTrizol消化细胞抽提RNA进行检测。
以PCMFS转染C2C12细胞，收集不同时间的转染和未转染上清，抽滤至硝酸纤维素膜上，以小鼠抗人HBsAg单克隆抗体、生物素化的马抗小鼠二抗和ABC、DAB检测，结果见图5，其中1.未转染上清24-72小时；2.PcDNA3质粒转染上清24-72小时；3.PCMFS质粒转染上清24-72小时。
PCMFS质粒转染C2C12细胞后72小时细胞内目的基因的转录水平的检测见图6，其中1.PCMFS质粒转染组；2.PcDNA3质粒转染组；3.阳性对照。
C2C12细胞中HBsAg的转录水平及上清和细胞裂解物中HBsAg的表达见图7，可见PCS2S和PCMFS转染C2C12细胞都能检测到HBsAg的表达，但在PCS2S转染上清中HBsAg的表达量相对较高，而PCMFS转染的细胞裂解物中HBsAg的表达量相对较高。PCMFS的表达的融合蛋白具有在细胞内积聚的特性，有利于PreS2-S蛋白以内源性抗原的方式进行递呈，从而有活化CD8+T细胞，促进了特异性的细胞免疫应答。
实施例3抗体化乙肝疫苗经肌肉基因注射本实施例中，注射的是PCMFS质粒。
以0.75％戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠(约120-150ul/只)，取腹位，调整腿姿暴露胫骨前肌。消毒后，用带有塑料套管的1ml注射器在肌肉的中部垂直进针，针尖插入深度由套管决定，约为2-3mm，缓慢推进，一次注射量为100ul(含100ug PCMFS质粒)，可见注射肌肉膨胀，完毕后将针头旋转90°，停留5秒，缓缓拔出。
实施例4基因注射后肌肉局部HBsAg蛋白的检测取小鼠免疫部位肌肉组织做冰冻切片，37℃烤片45分钟，置预冷的丙酮固定10分钟，蒸馏水冲洗；在各切片上滴加0.3％H2O2-甲醇溶液，37℃湿盒中孵育30分钟，蒸馏水冲洗，再以0.01M PBS(pH＝7.4)洗3次，每次5分钟；在各切片上滴加正常羊血清(0.01M PBS，pH＝7.4，1∶100)，37℃湿盒中孵育20分钟；倾去稀释的正常血清，滴加小鼠抗人HBsAg单克隆一抗(0.01M PBS，pH＝7.4，1∶10)，37℃湿盒中孵育1小时，以0.01MPBS洗3次，每次5分钟；在各切片上滴加生物素化的马抗小鼠二抗(0.01MPBS，pH＝7.4，1∶1000)，37℃湿盒中孵育1小时，0.01M PBS洗3次，每次5分钟；滴加提前半小时配好的ABC，37℃湿盒中孵育30分钟，0.01M PBS洗3次，每次5分钟；滴加DAB底物液，显微镜下控制染色时间，蒸馏水终止反应；苏木素复染细胞核，室温下风干，以中性树胶封片。
结果见图8，a为pcDNA3肌注局部HBsAg蛋白的检测，b为PCMFS肌注局部HBsAg的检测。可见PCMFS肌肉免疫可以在局部检测到HBsAg的表达。
实施例5抗体化乙肝疫苗可以诱导较强的体液免疫应答小鼠共免疫三次，间隔2周，自眼眶内静脉按期采集各组小鼠全血，分离血清，采用常规ELISA检测免疫小鼠血清特异性抗体，以纯化蛋白(HBsAg5μg/ml，100μl/孔)包被96孔酶标反应板，置湿盒中，37℃放置1小时，4℃过夜。测血清标本之前以0.01M PBST(PH＝7.4，0.05％Tween-20)洗涤三次，每次3分钟；以含5％山羊血清和10％小牛血清的PBST封闭，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；小鼠血清以0.01MPBST稀释后加入孔中，37℃作用1小时，以0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；加入以0.01M PBST稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG，37℃作用1小时，0.01M PBST洗涤三次，每次3分钟；OPD显色，1M H2SO4终止反应，测OD490值。图9显示PCMFS免疫组同PCS2S组一样，可以诱导小鼠产生很强的抗HBsAg的特异性抗体。
实施例6抗体化乙肝疫苗促进特异性的细胞免疫应答免疫小鼠第8周时处死取脾细胞，以5×105细胞/孔加入96孔板，同时加入非特异性抗原con A(5ug/ml)或特异性抗原HBsAg(50ug/ml)，37℃，5％CO2培养72小时，在收获细胞前18小时每孔加入0.5uCi3H-TdR，最后以多头细胞收集仪收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁计数器测量cpm值。
同样取自8周免疫小鼠的脾细胞，以4×106细胞/孔加入6孔板中，以50ug/ml的HBsAg刺激，第二天加入50u/ml的IL-2，培养5天后作为效应细胞，而转染了PCS2S基因的SP2/0细胞作为靶细胞，用CFSE标记效应细胞后，以10∶1、20∶1和40∶1的效靶比混合加入96孔板，37℃作用6小时后收集细胞，加入7-AAD 4℃染色30分钟，流式细胞仪检测靶细胞调亡情况。
不同质粒免疫小鼠脾脏细胞的增殖情况见图10。
不同质粒免疫小鼠脾脏细胞的特异性杀伤情况见图11，可以见到与PCS2S免疫组相比，PCMFS组脾细胞增殖能力增加，特异性杀伤能力明显增强，提示此抗体化乙肝疫苗能够诱导较好的细胞免疫应答，有利于打破因病毒感染而引起的免疫耐受。
序列表<110>复旦大学<120>一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白及其载体<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>281<212>PRT<213>PreS2-S蛋白<400>1Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg1 5 10 15Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val20 25 30Asn Pro Val Leu Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg35 40 45Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu50 55 60Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile65 70 75 80Leu Thr Ile Pro Gln Cys Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe85 90 95Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr100 105 110Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg115 120 125Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu130 135 140
Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro145 150 155 160Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys165 170 175Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile275 280<210>2<211>227<212>PRT<213>鼠IgG1 Fc<400>2Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu1 5 10 15Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr20 25 30Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val50 55 60His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe65 70 75 80Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly85 90 95Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile100 105 110Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val115 120 125Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser130 135 140Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu145 150 155 160Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro165 170 175Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val180 185 190Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu195 200 205His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser210 215 220Pro Gly Lys225<210>3<211>843<212>DNA<213>preS2-S<400>3
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165 170 175Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys180 185 190Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro195 200 205Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg210 215 220Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly225 230 235 240Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp245 250 255Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro260 265 270Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile Asp Ile Val Pro Arg Asp Cys275 280 285Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe290 295 300Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro305 310 315 320Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val325 330 335Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr340 345 350Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu355 360 365Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys370 375 380Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser385 390 395 400Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
405 410 415Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile420 425 430Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly435 440 445Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp450 455 460Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp465 470 475 480Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His485 490 495Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys500 505 510
权利要求
1.一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白，其特征在于，它具有第一部分和第二部分，所述的第一部分为乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，所述的第二部分为鼠IgG1 Fc段。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分具SEQID NO3有所示的基因序列，所述的第二部分具有SEQ ID NO4所示的基因序列。
4.根据权利要求1、2或3所述的融合蛋白，其特征在于，所述的第一部分和第二部分通过设计限制性酶切位点来进行连接。
5.权利要求1所述的融合蛋白在制备乙肝疫苗的药物中的应用。
6.一种载体，其特征在于，含有权利要求1所述的融合蛋白的编码基因。
7.如权利要求6所述的一种载体，其特征在于，含有SEQ ID NO9所示的基因序列。
8.如权利要求6所述的一种载体，其特征在于，含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
9.权利要求6所述的载体在制备乙肝疫苗的药物中的应用。
10.制备权利要求1或2或3所述的融合蛋白的方法，其特征在于，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)获得鼠IgG1 Fc段编码基因；3)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体，通过原核或者真核细胞表达获得表达蛋白。
11.制备权利要求6或7或8所述的载体的方法，其特征在于，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因；2)获得鼠IgG1 Fc段编码基因；3)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，及鼠IgG1 Fc段编码基因克隆入质粒，获得含有目的基因的载体。
12.根据权利要求11所述的制备所述的载体的方法，其特征在于，包含以下步骤1)获得乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因，2)设计扩增乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S基因的合适酶切位点的引物，3)获得鼠IgG1 Fc段编码基因，4)设计扩增鼠IgG1 Fc段编码基因的合适酶切位点的引物，5)将乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S克隆入含有相应酶切位点的PcDNA3质粒，获得PCS2S载体，再将IgG1 Fc克隆入含有相应酶切位点的质粒PCS2S，获得PCMFS载体。
13.一种抗体化的乙肝疫苗，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的融合蛋白，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
14.一种抗体化的乙肝疫苗，其特征在于，含有有效量的权利要求6所述的载体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，公开了一种用于制备抗体化乙肝疫苗的融合蛋白，它具有两个功能结构域，由N端的乙肝表面抗原前S抗原preS2和主蛋白S，及C端的鼠IgG1 Fc段组成。本发明还公开了含有编码所述融合蛋白基因的载体。本发明还公开了一种抗体化的乙肝疫苗。本发明所构建的抗体化乙肝疫苗，可以诱导很强的体液免疫应答和细胞免疫应答，具有比传统疫苗更好的效果。
文档编号A61K38/16GK101037476SQ20061002471
公开日2007年9月19日 申请日期2006年3月15日 优先权日2006年3月15日
发明者熊思东, 王缨, 蒋正刚, 储以微 申请人:复旦大学