专利名称：用持久的生物标记测定对电离辐射剂的暴露的制作方法
背景技术：
本发明涉及测定受试者是否曾暴露于电离辐射的方法，测定中所用的生物指示剂，尤其是核酸指示剂，还涉及鉴定可用于测定对电离辐射之暴露的生物指示剂的方法。
暴露于电离辐射的潜在后果使得过去曾暴露于辐射的生物指示剂非常合乎需要。但在这点上常规方法所能获得的过去暴露于的证据主要限于总体病理学或详尽的证据，如处于暴露中的受试者在怀孕头三个月出现的毛细管扩张(新管)形成，皮肤或其它器官的纤维变性，脱发，白内障形成，绝育和畸胎形成(先天缺陷)。
既往照射的分子证据也很有限，例如，CBA/Ca小鼠经暴露于200cGy诱发剂量的电离辐射之后患有白血病，在该小鼠的造血细胞中鉴定出染色体-2特异性缺失。CBA/Ca小鼠出现了一系列的染色体异常。
尽管在造血细胞中已可再现地阐明特异性的染色体变化，但无人报道γ射线的照射能直接或间接地，例如通过对骨髓基质细胞微环境的作用，对造血干细胞产生其它可测的影响。
也已报道了短寿命的生化指示剂，例如，将细胞培养物暴露于电离辐射之后，可观察到其中c-jun,c-fos和p53之mRNA的表达有所增加。增加的表达是瞬时的，快至暴露后1小时即回复到正常的水平。在放射治疗中暴露于至少3000cGy的X-射线的病人中也类似地观察到蛋白质TGF-β循环水平的升高。在未发展成局部急性肺炎的病人中，放射治疗结束时此水平回复正常，而在大多数发展成局部急性肺炎的病人中，放射治疗结束时此水平持久升高。另外，个体和个体之间TGF-β的表达也有差异。
TGF-β短暂升高及其在不同个体中表达的差异都表示这种形式的升高不适于作为既往暴露的指示剂。实际上，至今仍未报道过在暴露数周或数月后仍可被检测到的生物指示剂。
过去曾暴露于电离辐射的持久的，可检测的指示剂对于基础辐射生物学和法医病理学有价值。在毫无疑问地或有所怀疑地将辐射暴露既往史作为给定病理学状态的病原因子的情况下，这种需要尤其明显。
发明概述因此，本发明的目的是提供暴露于电离辐射的生物指示剂，所述指示剂在暴露数周或数月后仍可被检测到。
本发明的另一个目的是提供鉴定辐射的生物指示剂的方法。
本发明的另一个目的是提供通过检测根据本发明鉴定的生物指示剂水平的变化来确定对电离辐射的既往暴露的方法。
在实现这些和其它的目的时，本发明一方面提供了鉴定暴露于电离辐射的生物指示剂的方法，所述方法包括步骤将细胞群体暴露于电离辐射；使用示差法将暴露于电离辐射的细胞群体的基因表达与未暴露于电离辐射的对照细胞群体的基因表达相比较；在暴露的细胞群体中选择使基因表达水平与对照细胞群体相比有所变化的基因或基因片段，所述表达水平在暴露于电离辐射之后可以持续。
本发明另外还提供了确定个体是否曾暴露于辐射中的方法，所述方法包括步骤从个体中得到细胞，然后检测细胞中以前曾暴露于辐射的持久的生物指示剂的存在。
本发明还提供了检测对电离辐射的既往暴露的试剂盒，其中包括特异于基因或基因片段的引物，所述基因或基因片段为电离辐射既往暴露之持久指示剂；用于RT-PCR分析的试剂；和在确定取自受试者的细胞是否含有以前曾暴露于电离辐射的持久生物指示剂的试验中使用引物和试剂的说明。
从下列详细的描述中可明显看出本发明的其它目的，特征和优点。然而，应理解在表明本发明的优选实施方案时，给出的详细描述和具体实施例只是为了阐明本发明，因为本领域技术人员根据此详细描述可轻而易举地作出不超出本发明精神和范围的多种改变和修饰。例如，很显然，根据本文所述方法可鉴定能指示对系统毒素，化疗烷化剂，化学致癌剂和其它能使DNA链断裂并诱导照射修复的试剂的暴露情况的生物指示剂。
附图简述
图1是分离自示差凝胶，并按本文所述亚克隆和测序的C122带与血清淀粉样A3基因的序列比较。
图2A和2B是分离自示差凝胶，并按本文所述亚克隆和测序的C31带与MSSP-1和MSSP-2结合蛋白基因的序列比较。
优选实施方案的详细描述已发现一类生物指示剂，具体地包括对应于基因或基因片段的核酸指示剂，该指示剂是通过暴露于电离辐射数周或数月后的持久性来鉴定的。换句话说，由本发明的生物指示剂提供的信号可鉴别这种暴露，并在暴露后相当长的时期内仍能持续作用。
通过测定细胞培养物，尤其是骨髓基质细胞培养物(BMSCC)体外暴露于电离辐射之后，生物指示剂水平的变化即可鉴定出本发明内推定的生物指示剂。进一步评价推定的指示剂以测定受试者活体暴露于电离辐射之后，生物指示剂水平是否有相应的变化。那些在受试者暴露于电离辐射之后，表现出持久的，可测的体内水平变化的生物指示剂可用作电离辐射既往暴露的生物指示剂。
本发明生物指示剂水平“持久”的变化被定义为在暴露于电离辐射后至少能持续1周的变化，更具体地是暴露后至少能持续3周的变化，优选暴露后至少能持续3个月，更优选至少能持续1年或更长时间。
本发明生物指示剂水平“可测”的变化被定义为与未暴露于相当高水平的电离辐射，即仅暴露于环境中通常存在的电离辐射水平的对照群体中天然存在的生物指示剂的表达水平相比，其表达水平统计学意义上的显著变化。可测的变化更具体地被定义为表达水平至少为对照群体中的2倍，优选通过常规技术实际上检测不到对照群体中生物指示剂的水平。
在优选的实施方案中，生物指示剂是对应于基因或基因片段的核酸指示剂。通过使用示差技术鉴定体外照射细胞培养物后多个时间点的基因表达变化即可鉴定出这些核酸指示剂。示差法是比较两个或多个RNA群体之间的基因表达的很有用的技术，例见Liang和Pardee，科学，257:967-71(1992)，和Liang等，核酸研究，21:3269-75(1993)，这两篇文章的内容皆列入本文作为参考。该技术能够同时显示出两个或多个RNA群体之间被诱导的和受抑制的转录物的总的差异谱。由于该技术基于PCR，故可以分离含量极少的mRNA。因此，示差法可提供优于传统的扣除杂交技术的长处。
在示差法中，通过PCR扩增mRNA，然后根据其大小分布于变性的聚丙烯酰胺凝胶上。该技术的要素是使用一套寡核苷酸引物，其中一个锚定mRNA亚套的聚腺苷酸化尾，另一个相对于第一个引物来说较短，且是任意的，并在不同的位置退火。逆转录后，扩增由这些引物对限定的mRNA亚群，并在变性的聚丙烯酰胺凝胶上分辨。示差法不仅能同时显示多个RNA群体之间总的差异谱，也能够分离和鉴定这些差异。
示差技术能可再现地鉴定暴露于电离辐射之后表达水平有所变化的基因或基因片段。例如，根据本发明，鼠骨髓基质细胞系体外暴露于电离辐射能可再现地产生多个对应于表达水平可测的增加或降低的示差片段，这一点将在下文中描述。因此，根据本发明能可再现地鉴定因暴露于电离辐射而使其表达稳定地增加或降低的推定的鼠生物指示剂。
示差技术可类似地应用于人细胞，从而通过类似于本文所述用于小鼠的方法鉴定体外照射人细胞系后，表达水平可测地增加或降低的转录物，也可使用示差法鉴定由电离辐射诱导的转录物。或者，一旦在小鼠中鉴定出生物指示剂，即可使用特异于一个或多个人同源基因的引物来扩增同源的人基因。
本发明特别优选的生物指示剂是血清淀粉样A(SAA)家族，即由肝脏在全身性炎症反应期产生和由内皮细胞，成纤维细胞和巨噬细胞对包括IL-1,IL-6和TNF-α的多种细胞因子反应而局部产生的主要急性期炎症和氧化应力基因家族，Steel等，Immunol.Today,15:81-88(1994)。SAA是淀粉样A(AA)蛋白的前体，所述蛋白是与慢性炎症相关的淀粉样变性疾病组织中沉积的淀粉样原纤维的主要成分。包括组织损伤和如脂多糖(LPS)的炎症剂的多种刺激能有效提高SAA的水平。
小鼠SAA家族的成员包括SAA1,SAA2,SAA3和SAA4。肝脏是SAA合成的主要位点，但LPS注射后对肝脏外组织的Northern印迹分析揭示了SAA1,SAA2和SAA3的不同表达模式。SAA3是主要的肝脏外SAA，在肺，肾脏，肾上腺，肠道，心脏，脾脏，睾丸，骨骼肌，胃，脑，脑垂体和胰腺中可检测到SAA3。SAA3诱导蛋白酶和细胞粘附分子的产生，已显示出可诱导造血细胞定向迁移和粘附。Steel等，Lmmunol.Today；14(2):797-809(1986)。在多种组织中发现了SAA3意味着可检测多种组织，尤其是皮肤和肝脏以测定对电离辐射的既往暴露。
注射LPS后广泛的组织中含有可测水平的SAA3进一步暗示在每种组织中存在的单个，分散的细胞系统负责SAA3的表达。原位杂交研究表明脂肪细胞是肝脏外SAA3表达的主要来源，例见Benditt&Meek，实验医学杂志，169:1841-46(1989)；和Benditt&Meek，实验医学杂志，164:2006-17(1986)；和Meek等，“小鼠SAA3在具有特异性抗体的小鼠组织中检测”，AMYLOID AND AMYLOIDOSIS(Kluwer,1991)。因此，在测定对电离辐射的既往暴露时，描述了在脂肪细胞或特别是前脂肪细胞中检测SAA3水平。
体外照射BMSCC4天后可诱导小鼠的SAA3基因，照射后至少3周仍维持高水平的mRNA。结果表明细胞体外暴露于电离辐射能诱导长期产生SAA3 mRNA。剂量-反应曲线表明体外100cGy的电离辐射后检测到mRNA水平，暴露于500,1000和5000cGy后，诱导的水平达到最高。
尽管SAA3是本发明优选的生物指示剂，但照射后显示出持久的，可测的水平变化的其它示差片段也是有用的。对BMSCC体外暴露后鉴定出的其它示差片段的初步分析表明它们由不同于SAA3的基因产生。这些结果涉及由暴露于电离辐射之后，表达水平可测的，持久的变化鉴定的一系列基因。
优选暴露于电离辐射后表达水平有所增加的那些基因，但原则上也可以使用暴露后表达水平有所降低的基因。根据本发明，鉴定出几种示差转录物，它们在暴露于电离辐射后表达水平有所降低。例如，描述了一种示差片段，该片段与编码位于c-myc上游的单链结合蛋白MSSP-1/MSSP-2的基因同源。
通过比较由暴露于照射中的受试者建立的BMSCC和由对照受试者建立的BMSCC的基因或基因片段水平，来研究本发明中经体外技术鉴定的基因或基因片段的表达。CBA/Ca小鼠及其亚系是体内表达研究的适当模型。用200cGy全身照射后，CBA/Ca小鼠发展成骨髓白血病。由暴露于200cGy电离辐射的CBA/Ca小鼠和未暴露的CBA/Ca小鼠建立BMSCC。
除了由体外分析鉴定的基因表达水平有可测的差别外，经照射的受试者的BMSCC与对照受试者存在的BMSCC相比，其永久基质细胞系和克隆亚系的建立模式也有可定量的差别。从这些细胞系中也观察到与对照受试者相比，由经照射的受试者建立的基质细胞系的照射生物学和造血支持能力有差异。数据表明造血微环境的基质细胞中由活体照射诱导的变化在外植培养后数月仍能持续。在干细胞中这些变化能与照射诱导的染色体变化联合以影响白血病的形成。
骨髓基质细胞分离自对照小鼠和暴露于200cGy的电离辐射不到100天的小鼠。体外在BMSCC中将分离到的细胞培养3个月。由对照培养物和以前经照射的小鼠建立的培养物中建立骨髓基质细胞系。
在检测SAA3 mRNA水平之前，将所得细胞系培养几个月或更长一段时间。得自对照培养物的细胞系直至体外暴露于50Gy的电离辐射1周后仍不含显著水平的SAA3 mRNA。这些结果与经体外照射的BMSCC所得结果类似。形成鲜明对照的是由以前经照射的小鼠建立的细胞系含有大量SAA3 mRNA。体外照射后一细胞系的细胞甚至可进一步地增加SAA3 mRNA水平将此细胞系体外暴露于50Gy的电离辐射1周后，SAA3 mRNA的丰度增加了2-3倍。
因此，将小鼠活体暴露于电离辐射可诱导骨髓基质细胞中的SAA3mRNA，暴露1年后仍可检测到增加的mRNA水平。因此，检测骨髓基质细胞中的SAA3水平即可说明性地检测根据本发明的既往暴露。尽管本文的例子报道了骨髓基质细胞中增加的表达，但其它细胞，包括肺，脾脏，肾脏，肝脏，心脏，胸腺和脑的细胞也可用作检测暴露后SAA3水平增加的靶细胞。如上文所述，脂肪细胞和前-脂肪细胞用于检测SAA mRNA水平的增加特别有利。
通过在不同时间点收集对照和以前经照射的小鼠的全部骨髓和其它组织并立即分离RNA来研究体内表达。分析总RNA在体外被鉴定为表达水平有所变化的转录物的表达。类似地发现体外照射后显示出水平变化的转录物也显示出体内表达水平的持续变化。例如，在对照样品中未检测到SAA3的mRNA，但活体暴露一段时间后可检测到SAA3mRNA。
在人中也观察到类似于小鼠中的结果，人SAA基因家族至少含有4个成员。以类似于本文所述的用于小鼠的方法，将人细胞系，优选将骨髓基质细胞系体外暴露于电离辐射中，使用示差法鉴定由电离辐射诱导的SAA基因家族的那些成员。在计划移植自身骨髓的白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤或包括乳腺癌的实体肿瘤治疗过程中，在暴露于电离辐射的病人中可进一步证实SAA基因的体内表达。使用针对家族各个成员产生的特异性引物，和用这些引物逆转录酶(RT)PCR扩增此家族中的各个SAA基因即可测定被诱导的人SAA基因家族内的基因或基因片段。特别有用的是人基因SAA1和SAA2，人SAA2基因与小鼠SAA3基因的表现相似，即在对照中实际上检测不到，但暴露于电离辐射之后显示出持久的，可测的增加。在对照中和经照射的培养物中都存在人SAA1基因。
一旦鉴定出本发明的生物指示剂，即可将它用于测定受试者以前是否曾暴露于电离辐射。使用试验测量可能曾暴露于电离辐射的细胞群体中生物指示剂的表达水平，将此水平与未曾暴露于显著水平的电离辐射的对照群体的表达水平相比较。被检测的细胞可以是刚从受试者体内取出的细胞，也可以是以前从受试者体内取出，再经培养的细胞。此试验利用了Northern印迹或RT-PCR技术。当使用RT-PCR检测既往暴露时，特异于由本发明的示差法分析鉴定的照射-诱导的转录物的序列被用作引物。
测定受试者以前是否曾暴露于电离辐射的成分在试剂盒中被方便地包装在一起以检测对电离辐射的既往暴露。试剂盒中包括特异于基因或基因片段的引物，所述基因或基因片段为电离辐射既往暴露之持久指示剂；用于RT-PCR分析的试剂；和在确定取自受试者的细胞是否含有以前曾暴露于电离辐射的持久指示剂的试验中使用引物和试剂的说明。在优选的实施方案中，试剂盒包括特异于SAA基因，尤其是人SAA1或人SAA2的引物。
下列实施例阐明了鉴定指示对电离辐射的既往暴露的持久的，可测的生物指示剂的具体方案。应理解在本发明的精神和范围内可对所述方案进行多种改变和修饰。实施例1．体外照射鼠细胞和分离RNA根据本发明，将多个鼠细胞系体外暴露于电离辐射中，其中主要的细胞系是以前曾被描述过的D2XRII细胞系，即最早分离自C3H/HeJ长期骨髓培养物的鼠成纤维细胞基质细胞系。已将这些细胞分类为骨髓成纤维细胞或前-脂肪细胞，Naparstek等，细胞生理学杂志，126:407(1986)。在含有10％FBS的DMEM中使D2XRII细胞生长至铺满的单层，然后以200cGy/分钟的剂量速率暴露于1,5,10或50Gy的6MeV X-射线中，照射1小时，1天，4天，1周，2周和3周后收获细胞，根据Chomcynski和Sacchi，分析生物化学，162:156(1987)的方法，使用总RNA分离试剂盒(Promega公司，Madison,WI)分离总RNA，在Northern印迹，RT-PCR和示差分析中使用经DNA酶处理过的总RNA。实施例2．示差分析示差法使用可商购的RNAmap试剂盒(GenHunter公司，Brookline,MA)。简单地说，将200ng经DNA酶处理过的总RNA用作模板以使用4个基于寡聚(dT)的引物中的一个进行逆转录，逆转录之后，联合使用寡聚(dT)引物和20个任意的10-碱基引物中的一个PCR扩增cDNA，联合使用4个下游的基于寡聚(dT)的引物和20个上游的任意引物扩增的cDNA显示出细胞中存在的10,000个mRNA种类(Liang等，1993)，扩增后，在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物，然后使凝胶干燥，通过放射自显影检测产物。
然后比较RNA群体之间每种显示转录物的丰度，为了使假阳性的分离降低至最低程度，每种示差反应对相同的RNA群体需进行2次，仅进一步检查在两套反应中显示出相同丰度变化的转录物。
从聚丙烯酰胺凝胶上直接切下显示出差异表达的带，从凝胶条中分离DNA，使用原有的引物和条件用Taq DNA聚合酶PCR扩增，并连接到pT7-Blue T-载体上，用所得质粒转化XL-1 Blue细胞(Novagen公司，Madison,WI)。分离含有克隆的PCR产物的菌落，使用fmol DNA测序试剂盒(Promega公司，Madison,WI)测定质粒中插入物的序列。在从亚克隆片段中得到不止1个序列的情况下，证实每一序列的表达模式以测定哪一个是所需的序列。实施例3．Northern印迹分析例如，可按已列入本文作为参考的Sambrook等，分子克隆实验室手册(冷泉港实验室出版，1989)的描述进行Northern印迹。简单地说，在1％甲醛-琼脂糖凝胶上电泳10-20μg总RNA，将总RNA转移到被支持的硝酸纤维素膜(Schleicher和Schuell)上并在含有1％BSA,250mM Na2HPO4,1mM EDTA和7％SDS的溶液中与代表所需PCR亚克隆的α32P-dCTP(NEN)-标记的探针杂交，洗涤后，将印迹暴露于X-omat胶片(Kodak)上，通过光密度法定量测定带。使用煮沸的0.1％SDS使相同的印迹脱色，并依次与代表甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(G-3-PDH)的探针杂交，以作为每个泳道RNA量的上样对照。实施例4．RT-PCR分析在总体积为20μl的20mM Tris-HCl pH8.4,50mM KCl,5mM MgCl2,1mM dNTP,20单位RNA酶抑制剂(Pharmacia,Piscataway,NJ)中，用200单位的逆转录酶(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)对经DNA酶处理的RNA(1μg)进行寡聚(dT)-引发的逆转录。将反应物在室温下保温10分钟，然后在37℃保温45分钟，接着在99℃变性5分钟，在缺乏逆转录酶的情况下进行对照反应。用水将反应物稀释至100μl，在200μM dNTP,1.5mM MgCl2,Tris-HCl pH8.4，和2.5单位的Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)存在下，用20pmol有义引物和20pmol反义引物扩增5μl经稀释的反应物(约释放50ng的RNA)，以94℃30秒，60℃30秒和72℃1分钟共进行20次扩增循环。用特异于亚克隆或所需基因的引物和G-3-PDH基因的引物进行平行的PCR反应，扩增后，在琼脂糖凝胶上电泳产物，并通过溴化乙锭染色观察结果。实施例5．分析体外照射鼠细胞后得到的示差转录物体外照射D2XRII细胞培养物产生了一组基因表达水平显示出增加或降低的示差转录物，表达有所增加的第一组的24个克隆列于表1。
<p>G91,G101,A113,T34,T36,T101/2和C122这7个示差转录物在照射后1周表现出水平增加，选择它们作进一步研究，将这7个转录物中的一个，即克隆C122重新扩增，亚克隆并测序。
使用差异表达序列检索GenBank数据库以测定与已知序列同源性的存在，比较结果表明C122与鼠血清淀粉样A3基因的3’末端相同，比较结果示于图1。与GenBank序列的最适性比较表现出与SAA3基因99％相同。
在选定片段与已报道的序列没有同源性的情况下，可使用未知序列的PCR产物作为探针以筛选全长克隆的适当cDNA文库(对照或经照射的)，例见Sambrook等，1989，文献同上。
表2示出表达有所降低的第2组的12个克隆。
<p>在表现出表达降低的克隆中，发现克隆31与位于c-myc上游的单链结合蛋白MSSP-1和MSSP-2同源，比较结果分别列于图2A和图2B。与GenBank序列的最适性比较显示出与MSSP-1和MSSP-2基因95％相同。
已在其它的体外暴露于辐射的细胞系中阐明SAA3增加的表达，例如，发现巨噬细胞系暴露后SAA3的mRNA水平增加了2倍。实施例6．用Northern印迹证实经体外照射之细胞表达的SAA3通过Northern印迹分析证实由克隆122表达SAA3，将D2XRII细胞暴露于10或50Gy的X-射线1小时，1天，1周或3周后，从细胞中收集RNA，在1％甲醛-琼脂糖凝胶上电泳后，将RNA转移到硝酸纤维素膜上并与代表示差带C122的32P-标记的探针杂交，通过放射自显影检测杂交信号，对琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色证实了每个泳道中RNA的存在，Northern印迹分析确证在经照射的细胞中鉴定的示差片断不是人为的假象。实施例7．鼠细胞体外暴露不同时间后SAA3的表达和剂量-反应曲线的绘制通过Northern印迹分析也证实了在照射后长于1周的时间里，克隆122的SAA3表达，暴露于10Gy的X-射线1小时，1天，4天或1周，2周或3周后，从D2XRII细胞中收集RNA，在1％甲醛-琼脂糖凝胶上电泳后，将RNA转移到硝酸纤维素膜上并与代表示差带C122的32P-标记的探针杂交，通过放射自显影检测杂交信号，对琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色证实了每个泳道中RNA的存在。
体外照射4天后诱导了SAA3基因，照射后至少3周，mRNA水平仍然较高。暴露于10Gy的X-射线后，SAA3转录物的丰度在暴露4天后增加约10倍，暴露1周后增加20倍，暴露2周后增加35倍，暴露3周后增加40倍。这表明将细胞体外暴露于电离辐射可诱导SAA3 mRNA的长期产生。SAA3的剂量-反应曲线显示出体外经100cGy电离辐射之后检测到mRNA水平，暴露于500,1000和5000cGy之后达到最大诱导。实施例8．由暴露于电离辐射的小鼠建立的细胞培养物中SAA3的表达CBA/Ca雄性小鼠(Brookhaven实验室，纽约)接受了200cGy的全身照射(250KVP,GE Maxitron，剂量速率90R/分钟，1mm铝和0.5mm铜滤除)，照射后100天，通过颈错位处死经照射的小鼠，对照组包括相同数目的年龄相当的雄性CBA/Ca对照小鼠。
将分别得自经照射小鼠和对照小鼠的骨髓注入15ml圆锥形离心管中，所述离心管中含有添加了25％马血清和10-5M氢化可的松的Fisher氏培养基，分别建立各个经照射小鼠和对照小鼠的后肢(胫骨和腓骨)骨髓连续培养物。
4周后，根据已知方法用25％的胎牛血清替代马血清以使培养物的寿命最长。每周更换一次培养基以维持培养物直至它们不再显示出可测的圆石样小岛似的形状或每瓶产生104个以上的细胞。利用代表性的瓶建立特定时间点的骨髓基质细胞系，在体外将分离出的细胞培养3个月。
由对照小鼠的骨髓基质细胞培养物和以前经照射的小鼠的骨髓基质细胞培养物建立骨髓基质细胞系，在检测由本发明的体外技术鉴定的推定生物指示剂的mRNA水平之前，将所得细胞系培养约1年。使用与本文所述的用于体外暴露于电离辐射的D2XRII细胞相同的技术评估推定生物指示剂的水平。
使用表3所示的SAA鼠基因家族成员的特异性引物扩增对照和经照射小鼠培养物中的鼠SAA1,SAA2,SAA3和SAA4基因。在对照培养物中未鉴定出任何一种SAA转录物，但在经照射小鼠的培养物中发现了SAA3转录物。表3．鼠SAA家族成员的引物序列
<p>得自对照培养物的代表性细胞系被称为CC3细胞系，直至体外暴露于50Gy电离辐射1周，它仍不含显著水平的SAA3 mRNA。此细胞系体外暴露于50Gy电离辐射1周后，SAA3 mRNA的丰度增加2-3倍，此结果与体外照射D2XRII细胞所得的结果相当。
与之相比，被称为CT4细胞系的由以前经照射的小鼠建立的代表性细胞系含有大量SAA3 mRNA。体外照射CC4细胞系的细胞甚至能进一步地增加SAA3的mRNA水平。
通过Northern印迹分析证实CC3和CT4细胞中SAA3的表达，从暴露于0-50Gy的X-射线1周后的细胞中收集RNA，将印迹与代表示差带C122的32P-标记的探针杂交，通过放射自显影检测杂交信号，对琼脂糖凝胶的溴化乙锭染色证实了每个泳道中RNA的相同上样量。实施例10．暴露于电离辐射的小鼠中SAA3的体内表达使用CBA/Ca小鼠的亚系CBA/CaJ小鼠(Jackson实验室，BarHarbour,ME)证实活体暴露于电离辐射后SAA3表达的增加。将CBA/CaJ小鼠全身暴露于50cGy,200cGy,400cGy和700cGy的X-射线照射中，于暴露后第7天，14天，28天，3个月和7个月处死小鼠，收集全部的骨髓和其它组织。从骨髓和组织中分离RNA并立即使用RT-PCR分析SAA1,SAA2,SAA3和SAA4mRNA的存在，所述PCR使用了分别特异于实施例8所述的SAA1,SAA2,SAA3和SAA4的引物。在对照骨髓中未检测到mRNA，但在暴露于700cGy全身照射的小鼠中，于暴露后延续的时间点在骨髓中检测到SAA3 mRNA。
由包括C57B16/J和C3H/HeJ小鼠的其它小鼠细胞系的细胞已得到相似的结果，结果表明将小鼠活体暴露于电离辐射可诱导骨髓基质细胞中的SAA3的mRNA，在暴露后很长一段时间仍能检测到mRNA水平的增加，这表明SAA3基因适于作为对电离辐射之暴露的生物指示剂。实施例9．体外照射人细胞后SAA转录物的表达根据本发明，将多种人细胞系体外暴露于电离辐射中，其中主要的细胞系是骨髓基质细胞系KM101,KM102和KM104，它们被描述于FitzGerald等，Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys,15:1153-1159(1988)中。在含有10％FBS的DMEM中将细胞培养至铺满的单层，然后暴露于0Gy(对照)或10Gy的电离辐射中。使用表4所示的人SAA基因家族成员的特异性引物扩增人SAA1,SAA2,SAA3和SAA4基因。表4．人SAA家族成员的引物序列
在所有3个细胞系中，在经照射的细胞中观察到SAA1转录物，与对照细胞相比，经照射细胞的mRNA水平有所增加。从第4天开始在对照KM101细胞中观察到SAA1转录物，在任何时间，任何对照细胞中都未观察到SAA2转录物，但在经照射细胞中观察到SAA2转录物，并在暴露后能持续，在对照或经照射细胞中都未观察到SAA3和SAA4转录物。实施例10．人活体暴露于电离辐射后SAA转录物的表达为了证实SAA转录物在人中的表达，在计划移植自身骨髓的白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤或包括乳腺癌的实体肿瘤治疗过程中，在暴露于电离辐射之前的病人体内取样，深低温保存样品，然后使病人接受全身照射，当临床迹象再现时，或在照射后特定的时间点，抽取骨髓供分析并进行组织培养。得到并扩展人骨髓基质细胞的技术描述于Greenberger,In Vitro,15(10):823-828(1979)，该文献的内容列入本文作为参考。
取出部分样品供临床组织病理学分析，然后将抽取的骨髓置于组织培养瓶中，所述瓶中含有添加了10-6M氢化可的松和McCoys 5A培养基的25％胎牛血清，在33℃,7％CO2，高湿度培养箱中培养细胞，通过胰蛋白酶消化和重新平铺细胞来扩展贴附于培养瓶表面的基质细胞。
将得自用电离辐射治疗前的相同病人的骨髓细胞深低温保存等分试样融化，并在相同条件下培养细胞，扩展在25％胎牛血清和10-6M氢化可的松存在下生长成贴附于培养瓶表面的单层的基质细胞。当细胞生长至适当数目，即每个制品约107个细胞之后，通过刮擦或胰蛋白酶消化收获细胞。提取总RNA，使用人SAA转录物通过RT-PCR扩增总RNA，通过上文所述的Northern印迹评估和证实每种SAA转录物的水平。实施例11．测定人受试者对电离辐射的既往暴露的试验对人受试者的骨髓基质细胞进行活组织检查以检测受试者相对于对照群体而言是否表现出增加的SAA表达，所述对照群体未曾暴露于显著水平的电离辐射中。可使用上文实施例9中所述的方法和引物立即检测细胞，或者从受试者体内取出后先培养，然后再分析SAA的水平。
除了用于鉴定对既往照射的暴露的生物指示剂外，上文中所述方法还可用于鉴定对疾病引发剂，例如，对系统毒素，化疗烷化剂，化学致癌剂和其它能使DNA链断裂并诱导照射修复的试剂的暴露的生物指示剂。更具体地，可使用示差法检测取自暴露于上述引发剂的受试者的组织中本发明生物指示剂表达水平的提高。
权利要求
1．鉴定暴露于电离辐射的生物指示剂的方法，所述方法包括步骤将细胞群体暴露于电离辐射；使用示差法将暴露于电离辐射的细胞群体的基因表达与未暴露于电离辐射的对照细胞群体的基因表达相比较；在暴露的细胞群体中选择基因表达水平与对照细胞群体相比有所变化的基因或基因片段，所述表达水平在暴露于电离辐射之后可以持续。
2．根据权利要求1的方法，另外包括测定基因或基因片断序列的步骤。
3．根据权利要求1的方法，其中将细胞群体暴露于电离辐射的步骤是体外暴露细胞培养物的步骤。
4．根据权利要求1的方法，其中将细胞群体暴露于电离辐射的步骤是活体暴露细胞的步骤。
5．根据权利要求1的方法，其中基因或基因片断对应于编码血清淀粉样成分的基因。
6．根据权利要求5的方法，其中血清淀粉样成分是鼠血清淀粉样A3。
7．根据权利要求5的方法，其中血清淀粉样成分是人血清淀粉样A1或A2。
8．根据权利要求1的方法，其中细胞是骨髓细胞。
9．根据权利要求1的方法，其中基因或基因片断在暴露的细胞群体中的基因表达水平比在对照细胞群体中的有所增加。
10．根据权利要求9的方法，其中增加的表达水平至少为对照群体中的2倍。
11．根据权利要求9的方法，其中通过常规技术实际上检测不到对照群体中的生物指示剂水平。
12．根据权利要求1的方法，其中基因或基因片断在暴露的细胞群体中的基因表达水平比在对照细胞群体中的有所降低。
13．确定个体是否曾暴露于辐射中的方法，所述方法包括步骤从个体中得到细胞，然后检测细胞中以前曾暴露于辐射的持久的生物指示剂的存在。
14．根据权利要求13的方法，另外包括在检测细胞步骤之前的培养细胞的步骤。
15．根据权利要求13的方法，其中在检测步骤中使用Northern印迹分析。
16．根据权利要求13的方法，其中在检测步骤中使用RT-PCR分析。
17．根据权利要求13的方法，其中生物标记是对应于编码血清淀粉样成分之基因的基因或基因片断。
18．根据权利要求17的方法，其中血清淀粉样成分是鼠血清淀粉样A3。
19．根据权利要求17的方法，其中血清淀粉样成分是人血清淀粉样A1或A2。
20．根据权利要求13的方法，其中细胞是骨髓细胞。
21．根据权利要求13的方法，其中基因或基因片断在暴露的细胞群体中的基因表达水平比在对照细胞群体中的有所增加。
22．根据权利要求21的方法，其中增加的表达水平至少为对照群体中的2倍。
23．根据权利要求21的方法，其中通过常规技术实际上检测不到对照群体中的生物指示剂水平。
24．根据权利要求13的方法，其中基因或基因片断在暴露的细胞群体中的基因表达水平比在对照细胞群体中的有所降低。
25．检测对电离辐射的既往暴露的试剂盒，其中包括特异于一种基因或基因片段的引物，所述基因或基因片段为电离辐射既往暴露之持久指示剂；用于RT-PCR分析的试剂；和在确定取自受试者的细胞是否含有以前曾暴露于电离辐射的持久生物指示剂的试验中使用引物和试剂的说明。
26．权利要求25中要求的试剂盒，其中细胞是骨髓细胞。
27．权利要求26中要求的试剂盒，其中引物特异于SAA基因或其片断。
全文摘要
使用暴露于电离辐射的持久的生物指示剂,尤其是核酸指示剂可测定受试者是否曾暴露于电离辐射,通过示差技术可鉴定这种生物指示剂。
文档编号C12Q1/68GK1216069SQ97193746
公开日1999年5月5日 申请日期1997年2月18日 优先权日1996年2月15日
发明者K·L·戈特里理, J·S·格林伯格 申请人:匹兹堡大学