专利名称：编码拟南芥的gai基因的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及对植物的生长和/或发育进行的遗传控制以及克隆和表达与之相关的基因。更具体地讲，本发明涉及拟南芥(Arabidopsistha liana)的GAI基因和来自其它物种的同源基因的克隆和表达以及所说的基因在植物中的用途。
对影响包括开花在内的植物生长和发育的遗传机理的了解，提供了一种用于改变目标植物特性的手段。控制生长和/或发育特性对某些物种有利，所说的物种包括所有的作物，其中重要的实例有可能在较温暖的气候带中在农业上最重要的谷类、水稻和玉米以及在较温和的气候下的小麦、大麦、燕麦和黑麦。对于种子产品而言，重要的作物有油料种子油菜与canola、甜菜、玉米、向日葵、大豆和高粱。当然，用于收获根部的许多作物都是每年由种子长成的，并且任何一种种子的生成都在很大程度上取决于植物开花、被授粉和结籽的能力。在园艺学中，控制包括开花在内的生长发育的时间是很重要的。可以控制开花的园艺植物包括莴苣、菊苣和包括甘蓝、花茎甘蓝、花椰菜的芸苔属蔬菜以及香石竹和天竺葵。从不同的园艺学与农业的角度出发，有时是矮小的植物、而有时又是过大的较高的植物是有利的和/或人们所希望的。
拟南芥是植物遗传学家喜爱的一种模型生物。由于它具有小的鉴定完善的基因组，比较容易被转化和再生并且具有快速的生长周期，因此拟南芥属是一种用于研究生长发育及其控制的理想的模型植物。
许多植物的生长发育过程都受到名叫赤霉素(GA)的一族四环双萜类化合物的生长因子的特定成员的调节。拟南芥属的gai突变赋予了矮小的表型并且显著地降低了对GA的反应2-9。在本文中，我们报道了通过Ds转座子的诱变而进行的gai的分子克隆。
由Ds插入片段的等位基因所赋予的表型证实了gai为一种功能增益性(gain-of-function)突变，并且野生型的等位基因(GAI)是可有可无的5,6。GAI编码一种具有532个氨基酸残基的新的多肽(GAI)，其中在gai的突变多肽中缺少了一段17个氨基酸的功能域。这一结果与GAI起到植物生长阻抑物作用的认识是一致的，其活性受到GA的拮抗。尽管我们不受任何具体理论的限制，但是由于gai缺乏与GA信号相互作用的功能域，因此gai实际上抑制了生长。因此根据该模型，GA是通过脱阻抑来调节植物的生长。
gai为一种显性功能增益性突变，该突变能赋予暗绿色矮小的表型，并且干扰GA的接受或者随后的信号转导2-9。在包括玉米10-12和小麦13在内的其它植物物种中已知存在着能赋予类似表型的显性突变。由于后者是“绿色革命”中高产的半矮生小麦品种14的基础，因此后者尤为重要。上述品种的产量的提高是由于每个谷穗上谷粒的产量有所提高以及具有较强的茎秆强度。更短、更强壮的茎秆大大地减少了由倒伏造成的损失，其中所说的倒伏是指由雨/风使直立的小麦植株变平。由于gai对于了解GA信号-转导很重要，并且由于具有在开发小麦和其它作物(如含油种子油菜与水稻)中利用对GA-不敏感性的潜力，所述其它作物可以表现出与已在小麦中观察到的同样大的改进，我们开始从拟南芥属中克隆gai。
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种含有编码具有GAI功能的多肽的核苷酸序列的核酸分子。术语“GAI功能”是指与拟南芥的GAI基因一样，影响植物表型的能力。在植物中可以从表型上以抑制、压抑、阻抑或降低植物的生长来观察“GAI功能”，而所说的抑制、压抑、阻抑或降低受到GA的拮抗。GAI的表达倾向于在植物中赋予受GA拮抗的矮小的表型。可以利用植物中编码具有GAI功能的多肽的核苷酸序列的超量表达来赋予植物矮小的表型，其中可以通过用GA处理来校正矮小的表型。
根据本发明的另一方面，本发明提供了含有编码在表达的过程中具有赋予gai突变表型能力的多肽的核苷酸序列的核酸分子。与野生型植物相比，gai突变植物变得矮小，并且这种变矮的现象对GA是不敏感的。
赤霉素或GA是指具有如
图1所示的基本碳环结构并具有生物活性的双萜类化合物分子，即我们指的是具有生物活性的赤霉素。
可以通过一种或多种对细胞伸长、叶子衰老的刺激作用或者对谷物糊粉α-淀粉酶响应的诱导作用来定义生物活性。现有技术中有许多可用的标准的测定方法，其中，在任何一种或多种的阳性结果都预示着测试的赤霉素具有生物活性28,29,30。
在现有技术中可以采用的测定方法包括莴苣下胚轴测定、黄瓜下胚轴测定以及燕麦第一叶片测定，其中所有的测定方法都是在所施加的赤霉素能引起相应的组织伸长的能力的基础上测定生物活性的。优选的测定方法为那些将测试组合物施加给缺乏赤霉素的植物的方法。这些优选的测定方法包括处理矮小的缺乏GA的拟南芥属植物以测定其生长，测定其节伸长的矮小豌豆的测定方法，测定其中叶鞘伸长的Tanginbozu矮小水稻的测定方法以及同样也测定其中叶鞘伸长的d5-玉米的测定方法。对伸长进行的生物测定测量了在相应器官中普通细胞伸长的效果，并且所说的测定并不局限于具体的细胞类型。
其它可以采用的测定方法包括羊蹄(酸模属)叶片衰老测定与谷物糊粉α-淀粉酶测定。在谷物中包围着胚乳的糊粉细胞在发芽时分泌α-淀粉酶，而α-淀粉酶消化淀粉生成了随后被生长的植物所利用的糖类。该酶的生成受到GA的控制。能产生具有生物活性的GA的分离的糊粉细胞分泌α-淀粉酶，该酶的活性随后可以通过例如测量淀粉的降解来加以测定。
对高的生物活性很重要的结构特征(由GA1,GA2,GA4和GA7显示)为在B-环的C-6上的羧基；C-19,C-10内酯；以及在C-3上的B-羟基化。在C-2上发生的β-羟基化造成了失活(由GA8,GA29,GA34和GA51显示)。gai突变体对GA处理，例如用GA1、GA3或GA4进行的处理没有反应。
优选通过用水溶液喷洒来用GA进行处理，例如每周或更频繁地用10-4M GA3或GA4的水溶液进行喷洒，或者除喷洒以外也可以通过在植物上浇注小滴溶液来进行处理。可以把GA溶解在诸如乙醇或丙酮等的有机溶剂中来使用，因为与在水中的溶解度相比GA更易溶于有机溶剂中，但由于这些有机溶剂可能会损伤植物，因而并不优选这些溶剂。如果打算使用有机溶剂的话，合适的配方包括24ηl的溶于80％乙醇的0.6,4.0或300mM的GA3或GA4。可以在含有GA的培养基(如用琼脂固化并含有补充的GA的组织培养培养基(GM))上培育如拟南芥属的植物。
本发明的核酸可以含有拟南芥的野生型GAI基因的序列或者所说序列的突变体、衍生物、变体或等位基因。优选的突变体、衍生物、变体和等位基因是那些编码保留了由野生型基因编码的蛋白质的功能特性的蛋白质的核酸序列，其中尤其包括抑制植物生长的能力、而所说的抑制作用受到GA的拮抗，或者包括赋予植物对GA处理植物产生反应的一种或多种其它特性的能力。其它优选的突变体、衍生物、变体和等位基因编码赋予了gai突变表型的蛋白质，也就是说减弱了植物的生长、而所说的减弱对GA不敏感，即通过GA的处理不能克服生长的减弱。通过在所说的核酸中一次或多次地添加、插入、缺失或取代一个或多个核苷酸便可以改变一个序列以生成突变体、变体或衍生物，从而引起在所编码的多肽中添加、插入、缺失或者取代一个或多个氨基酸。当然本发明也包括没有造成被编码的氨基酸序列有所不同的核酸的改变。
对GAI基因而言，优选的核苷酸序列为编码图4中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，其中尤其是在图3中所示的编码序列。优选的gai突变体缺少在图4中划有下划线的17个氨基酸序列的部分或全部。
本发明也提供了包含具有任意一个所说的序列的核酸的核酸构建体或载体，该构建体或载体优选可以表达由上述核酸序列编码的多肽。所说的构建体或载体优选适于转化至植物细胞中。本发明还包括用上述构建体或载体转化的宿主细胞，尤其是植物细胞。因此，本发明提供了含有本发明的核酸的宿主细胞，如植物细胞。在上述细胞中，可以把所说的核酸插入到染色体中。每个单倍体基因组中可以有多于1个的异源核苷酸序列。正如下面所讨论的那样，与内源水平相比，这样可以提高基因产物的表达。
含有本发明的核酸的构建体或载体不必包含启动子或其它的调节序列，尤其是如果用所说的载体向细胞中引入所说的核酸以便重组进入基因组时，情况更是这样。但一方面，本发明提供了含有连接到用于控制表达的调节序列上的GAI或gai编码序列(其中包括来自除拟南芥以外的同源序列)的核酸构建体，所说的调节序列为除自然融合到所说的编码序列以外的序列并且优选为另一种基因的序列或者从另一种基因衍生出来的序列。
本发明的核酸分子和载体可以为一种分离物的形式，只要该分离物是从自然环境中以基本上纯净或者均一的形式或者不含或基本上不含感兴趣的物种或来源的核酸或基因分离出来的即可，其中的核酸除去编码能够影响包括开花在内的生长和/或发育的多肽的序列，例如，在拟南芥中除GAI编码序列以外的核酸。术语“核酸分离物”包括完全或者部分合成的核酸。
核酸当然可以是双链或单链的cDNA或基因组DNA、RNA，适当的时候它们可以是完全或部分合成的。当然，当本发明的核酸包括RNA时，应当参照所示的序列来构建RNA的等同物，用U代替T。
本发明也包括任意一种本文所公开的核酸序列的表达产物以及在合适的宿主细胞中在合适的条件下通过其编码的核酸的表达来制备表达产物的方法。本领域技术人员可以很好地构建载体并且可以设计出用于表达以及回收重组基因表达产物的实验方案。可以选择或者构建合适的载体，该载体中含有合适的调节序列，包括启动子序列、终止子片段、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因以及其它适宜的序列。为了获得更为详细的信息，可以参阅例如《分子克隆实验室手册第2版》Sambrook等，1989，冷泉港实验室出版社。转化方法取决于所使用的宿主，但所述的方法是人们熟知的。在《分子生物学实验方案》(第2版，Ausubel等编辑，John Wiley & Sons,1992)中详细地描述了用于操作核酸的许多已知的方法和实验方案，例如核酸结构的制备、诱变、测序、向细胞中引入DNA与基因表达以及蛋白质的分析。Bevan在《核酸研究》((1984)12,8711-8721)以及Guerineau和Mullineaux在《植物分子生物学Labfax》(Croy RRD编辑，牛津，BIOS科学出版社)的“植物转化与表达载体”((1993)，pp121-148)中描述了以前所使用的并在植物中取得了广泛成功的具体的方法和载体。Sambrook等与Ausubel等公开的内容以及所有在本文中提到的其它文献均被收入本文，仅供参考。
由于图4所示的拟南芥属的GAI氨基酸序列包括靠近其N-末端的5个连续的组氨酸，使用可从QIAGEN股份有限公司(美国)和DIAGENGmbH(德国)购得的Ni-NTA树脂基本上实现GAI或gai的纯化。参见Janknecht等31以及EP-A-0253303和EP-A-0282042。Ni-NTA树脂对在靠近蛋白质的N-末端或C-末端处有连续的组氨酸的蛋白质具有高的亲和力，因而可以使用该树脂来纯化来自植物、植物的部分或提取物或者来自能表达所述蛋白质的重组生物体(诸如酵母或细菌，如大肠杆菌)的GAI或gai蛋白质。
可以采用现有技术中的标准方法使用经纯化的GAI蛋白质来生产抗体，其中的GAI蛋白质例如可以通过重组的方法，借助其编码核酸的表达来生产。正如下文将进一步讨论的那样，在鉴定来自其它物种的同系物的过程中可以使用抗体以及含有抗体的抗原-结合片段的多肽。
生产抗体的方法包括用上述蛋白质或其片段免疫接种一种哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或猴)。可以采用现有技术中已知的多种方法中的任意一种方法从免疫接种的动物中得到抗体，并且可以优选使用将抗体结合到感兴趣的抗原上的方法来筛选抗体。例如可以使用Western印迹方法或免疫沉淀法(Armitage等，1992，自然357:80-82)。上述抗体可以是多克隆抗体或是单克隆抗体。
作为对免疫接种哺乳动物的代替或补充，可以从被表达的免疫球蛋白可变域的经重组生成的文库中得到具有适宜的结合特异性的抗体，例如使用在其表面上显示出功能性的免疫球蛋白结合域的λ噬菌体或丝状噬菌体；例如，参见WO92/01047。
可以在鉴定和/或分离同源多肽以及随后鉴定和/或分离其编码基因的过程中使用针对GAI或gai多肽而生成的抗体。因此，本发明提供了一种鉴定或分离具有GAI功能或者具有赋予gai突变表型能力的多肽的方法，该方法包括用含有抗体的抗原-结合域的多肽(例如整个抗体或其片段)筛选候选多肽，其中的抗体能够结合拟南芥属的GAI或gai多肽或者优选对上述多肽(诸如具有图4所示的氨基酸序列)具有结合特异性。
例如，用于筛选的候选多肽可以为采用来自于感兴趣的植物的核酸创建的表达文库的产物，或者可以为来自于天然来源的经纯化的产物。
可以分离出已发现的结合上述抗体的多肽，然后对所述多肽进行氨基酸测序。可以采用任何合适的方法或者全部或者部分地测定所述多肽的序列(例如可以测定所述多肽的一个片段的序列)。在获得编码上述多肽的核酸的过程中，可以使用氨基酸序列的信息，例如正如下文将进一步讨论的那样，通过设计一个或多个寡核苷酸(例如寡核苷酸的简并库)，从而在与候选核酸杂交的过程中把所说的寡核苷酸用作探针或引物。
再一方面，本发明提供了一种鉴定和克隆来自非拟南芥的植物物种的GAI同源序列的方法，该方法采用了来源于图3所示的核苷酸序列。来源于这些序列的序列自身可以用来鉴定和克隆其它的序列。本文所提供的核苷酸序列信息或其任意部分可以用于数据库的检索以便找到同源序列，可以测试该序列表达产物的GAI功能。另一方面，采用为本领域普通技术人员所熟知的方法可以筛选出核酸文库，然后可以测试由上述方法鉴定的同源序列。
例如，本发明还提供了一种鉴定和/或分离GAI或gai同源基因的方法，该方法包括用编码具有GAI功能的多肽的核酸或其片段或突变体、衍生物或等位基因来探测候选(或“目标”)核酸。候选核酸(例如可以为cDNA或基因组DNA)可以从含有或者推测会含有编码上述同系物的核酸的任意细胞或生物体中得到。
在本发明这一方面的一个优选的实例中，用于探测候选核酸的核酸编码图4所示的氨基酸序列，一个互补于编码序列的序列或者任意一种上述序列的片段，最优选地包括图3所示的核苷酸序列。
另一方面，正如本文所讨论的那样，可以采用通过测定多肽的序列而获得的氨基酸序列的信息来设计探针，其中的多肽被鉴定为可以与能够结合GAI或gai多肽的抗体的抗原-结合域相结合，例如，一种具有图4所示的氨基酸序列的多肽。
用于探测的优选条件为严格到足以存在具有鉴定为阳性的并可以进一步加以研究的少量杂交的简单形式即可。在现有技术中人们熟知逐渐地提高杂交的严格性直到仅有一些阳性克隆存在为止。
作为除探测以外的另一种方法，尽管仍然采用核酸杂交，但可以采用常规的方法在PCR或其它涉及核酸扩增的方法中使用寡核苷酸，其中所说的寡核苷酸被设计成扩增来自于GAI基因的DNA序列。例如，参见“PCR实验方案；方法及应用指南”，Innis等编辑，1990，学术出版社，纽约。
适于设计探针或PCR引物的优选的氨基酸序列为在GAI基因之间保守的(完全、基本上或者部分保守)序列。
在氨基酸序列信息的基础上可以设计出寡核苷酸探针或引物，考虑遗传密码的简并性，并在时机合适的时候，可以考虑候选核酸所来源的生物体的密码子使用。
本发明也延伸到编码GAI同系物的核酸，该核酸是用来源于图3所示的核苷酸序列得到的。
同样包括在本发明范围之内的有编码氨基酸序列的核酸序列，其中的氨基酸序列为由拟南芥的GAI所编码的多肽的同系物。该同系物可以来自非拟南芥的物种。
同源性可以存在于核苷酸序列和/或氨基酸序列的水平上。优选地，上述核酸和/或氨基酸序列与由图3的核苷酸序列所编码的序列之间有同源性，其中优选至少有大约50％、或60％、或70％、或80％的同源性，最优选至少有90％或95％的同源性。编码上述多肽的核酸优选可以与拟南芥的GAI基因具有同样的在植物的表达时赋予特殊表型的能力，其中优选为对GA有反应的表型(即在用GA处理时，植物的特性有所改变)，诸如抑制植物生长的能力，而这种抑制作用受到GA的拮抗。正如所指出的那样，GAI在植物中的表达可以影响植物的一个或多个其它的特性。可以与拟南芥的GAI基因共有的优选特性为互补于植物(例如拟南芥)中的GAI无效突变表型的能力，该表型对paclobutrazol的矮化作用具有抗性。
本发明的多肽的一些优选实例(由本发明的核酸实例所编码)包括图4中划有下划线的17个氨基酸的序列或者与图4中划有下划线的17个氨基酸序列中各自相应的残基(根据位置确定)之间至少有大约10个残基的相似性或同一性的氨基酸残基的邻接序列(contiguous sequence)，更优选为具有11,12,13,14,15,16或17个上述残基。
正如人们已经清楚地了解的那样，在氨基酸水平上的同源性通常依据的是氨基酸的相似性或同一性。相似性允许“保守变异”，即以一个疏水性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸)取代另一个疏水性残基，或者以一个极性残基取代另一个极性残基(如用精氨酸代替赖氨酸，用谷氨酸代替天冬氨酸，用谷氨酰胺代替天冬酰胺)。相似性可以通过Altschul等在《分子生物学杂志》(1990)215:403-10中的TBLASTN程序进行定义及测定，该程序为现有技术中标准的方法。同源性可以在图4全长的GAI序列的范围内，或者与图4中划有下划线的17个氨基酸相比更优选在所说的17个氨基酸的邻接序列的范围内，或者与图4的氨基酸序列相比在一个更长序列(例如大约有20,25,30,40,50或更多的氨基酸)的范围内，其中优选包括划有下划线的17个氨基酸。
在核酸水平上，同源性可以在全长的核苷酸序列的范围内或者更优选在相当于图3的序列中并编码图4中划有下划线的17个氨基酸的序列的51个核苷酸编码序列的范围内，或者在与上述序列相比长度更长的序列的范围内(例如大约有60,70,80,90,100,120,150或更多的核苷酸)，其中优选包括编码图4中划有下划线的17个氨基酸序列的图3所示的51个核苷酸。
本发明也提供了gai突变体的同源序列。所说的突变体可以是如下的突变体，其野生型包括在图4中划有下划线的17个氨基酸或者这17个氨基酸的邻接序列，所说的邻接序列与图4中划有下划线的17个氨基酸序列中的相应残基之间具有至少大约10个残基(更优选为11,12,13,14,15,16或17个残基)的相似性或同一性，但所说的突变体则与野生型的情况有所不同。编码所说的突变多肽的核酸可以在植物中表达，从而赋予植物对GA处理不敏感或没有反应的表型，即为用GA处理植物时不能克服或者无法回复到野生型表型的突变表型(尽管在供给或者消耗GA时，在植物中可能有一些反应)。
再一方面，本发明提供了具有编码一种多肽的核苷酸序列的核酸分离物，其中所述多肽包括一种氨基酸序列，所说的氨基酸序列为图4所示的拟南芥种的GAI氨基酸序列的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列或者为另一种物种的同源序列或其突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列，其中所说的突变的、等位基因的、衍生的、变异的序列或同源序列通过插入、缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸从而有别于图4所示的氨基酸序列，而所说的核酸分离物可以通过如下的方法得到通过用测试核酸转化具有GAI无效突变表型(其中该表型对paclobutrazol的矮化作用有抗性)的植物来生产转基因植物，在该转基因植物中引起或使得测试核酸进行表达，筛选那些显示出互补于GAI无效突变表型的转基因植物以便鉴定出能够互补于GAI无效突变型的测试核酸，从经过上述鉴定的能够互补于GAI无效突变型的核酸中缺失一段核苷酸序列，该核苷酸序列编码图4中划有下划线的17个氨基酸序列或者邻接这17个氨基酸的序列，其中所说的邻接序列与在图4中划有下划线的17个氨基酸序列相应位置处的各个氨基酸之间至少有10个残基具有相似性或同一性，更优选有11,12,13,14,15,16或17个残基具有相似性或同一性。
可以从在经济上很重要的单子叶作物(如小麦、稻和玉米)中鉴定GAI和gai基因的同源基因。尽管在单子叶植物和双子叶植物中编码同一蛋白质的基因在核苷酸水平上表现出极小的同源性，但是氨基酸序列则是保守的。
在公用序列数据库中，我们近来鉴定了几个EST序列，这些序列是在随机测序程序中得到的，并与GAI具有同源性。表2给出的详细结果表明在包括Zea Mays(玉米)、O.Sativa(稻)和Brassica napus(油菜)的不同物种中已经找到了同源序列。通过测序、研究表达型式以及检验改变其表达效果可以得到在其它植物中具有类似功能的GAI基因的同源基因。与上述针对拟南芥的基因进行的讨论一样，在本发明不同方面的范围内当然包括了这些序列的新的用途及其突变体、衍生物和等位基因。
含有本发明的核酸的细胞代表着本发明的另一方面，其中特别是指植物细胞或细菌细胞。
通过把编码所说酶的核酸引入上述细胞或其祖细胞中(例如采用现有技术中本领域技术人员可以使用的任适宜的方法进行转化)，所说的细胞可以含有所说的核酸。
本发明也提供了已向其基因组中插入了本文所公开的核酸的植物细胞。本发明还提供了一种含有上述植物细胞的植物。
本发明还提供了向其基因组中插入了如本发明所提供的核苷酸序列的植物细胞，该序列受一种调节序列的可行的控制，以控制其表达。再一方面，本发明提供了一种制备上述植物细胞的方法，该方法包括向植物细胞中引入含有所说核苷酸序列的载体，并且在载体与植物细胞的基因组之间引起重组或使重组发生以便将所说的核苷酸序列引入所述基因组中。
本发明的植物可以是一种在一个或多个性状方面没有纯育的植物。可以排除植物的品种(variety)，尤其是那些根据植物育种者权利可以登记入册的植物品种。应当指出的是不必仅仅因为所说的植物在其基因组中稳定地含有被引入到所说植物或其祖先的细胞中的转基因，就将该植物看作为“植物品种”。
除植物以外，本发明提供了上述植物、种子、自交或杂交子代和后代的任意的克隆以及上述任意物质的任何部分(如插条、种子)。本发明提供了任意的植物繁殖体，所说的繁殖体为可以用来进行有性或无性生殖或繁殖的任意部分，其中包括插条、种子等。本发明还包括可以有性或无性地繁殖子代的植物，该植物的克隆或后代或者所说的植物、子代、克隆或后代的任何部分或繁殖体。
本发明还提供了一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中表达异源的GAI或gai基因序列(如上所述或为其突变体、等位基因、衍生物或同源序列)。术语“异源”是指采用遗传工程的方法、即通过人为的干预(其中可以包括转化)将上述基因/核苷酸序列引入所说的植物或其祖先的细胞中。所说的基因可以位于基因组外的载体上或者优选稳定地插入基因组中。异源基因可以代替内源的等价基因、也即在控制生长和/或发育方面通常起到相同或类似功能的一种基因，或者被插入的序列可以是对内源基因的补充。引入异源基因的益处在于使该基因的表达受选择的启动子的控制，以便能够影响基因的表达，并从而使本发明植物的生长和/或发育达到优选的状态。而且，野生型基因的突变体和衍生物可以用来代替内源基因。对宿主细胞而言，被插入的基因可以是外源的，例如，另一种植物物种的。
利用本发明可以改变的主要特性是生长。
根据作为生长阻抑物的GAI基因的模型，至少在仅有一个赋予GAI功能的内源基因的植物中可以使用所述基因的表达不足来促进生长(例如不是具有可以补偿的内源同源序列的拟南芥属植物)。这可能涉及到反义调节或有义调节的应用。通过在感兴趣的植物中剔除GAI或有关的同源基因可以培育出较高的植物。可以培育出对抑制GA生物合成的化合物(如paclobutrazo1)有抗性的植物，例如允许使用GA生物合成抑制剂来保持杂草矮小却使作物植株长得很高。
GAI基因的超量表达可以造成植物矮小，然而正如GAI阻抑模型所预测的那样，上述状况可以用GA处理来加以纠正。
由于gai突变基因在表型上呈显性，因而可以使用这些基因来培育对GA不敏感的矮小的植物。上述技术例如可以应用于任何可转化的作物-植株、树木或者果树物种。例如可以提供一种产量更高/减少倒伏的Rht小麦。在水稻中，该技术可以提供对GA不敏感的、对恶苗病具有抗性的水稻，而这种病害正是在日本及其它地方遇到的问题。对园艺学及插瓶花市场而言，矮小的装饰性植物是很有价值的。序列操作可以提供变矮的不同的严重程度、对GA不敏感的表型，从而进行修整以达到每种作物-植物所需的或者是操作者所希望的严重程度。gai-突变序列的超量表达可能是最有用的。
可以改变的第二种特性为植物的发育，例如开花。在一些植物当中，以及在某些环境条件下，需要GA信号来进行成花诱导。例如，除非用GA进行处理，否则在短日照条件下长成的GA-缺陷型突变的拟南芥属植物就不开花当在长日照条件下进行培育时，上述植物会正常地开花。拟南芥属的gai突变植物在短日照条件下，表现出花期延迟重度突变体可能根本就不开花。因此，例如通过GAI或gai基因的表达或超量表达就可以生产出保持营养生长的植物，直至用GA进行处理以诱导成花。从园艺学的角度或者对于希望抑制抽苔的菠菜、莴苣和其它作物而言，这是很有用的。
可以使本发明的核酸受外部诱导型基因启动子的控制以便将GAI或gai编码序列置于使用者的控制之下。
本领域的普通技术人员可以清楚地理解用于启动子的术语“诱导型”。实质上，在诱导型启动子的控制下进行的表达“接通”或者增加了对所施加的刺激的响应。刺激的本质随启动子而变化。一些诱导型启动子在缺乏合适的刺激的情况下引起很少的或者检测不到的表达(或者没有表达)。一些诱导型启动子在缺乏刺激的情况下引起可以检测到的组成型表达。无论在缺乏刺激的情况下表达水平如何，但在存在合适的刺激的情况下会增加来自任何诱导型启动子的表达。优选的状况为在施加有关刺激的过程中，表达水平随着改变表型性状的有效量而增加。因此，可以使用在缺乏刺激的情况下引起础水平的表达的诱导型(或“开关”)启动子，其中所说的水平极低以致于不能产生所需的表型(实际上可能为0)。在施加刺激的过程中，可以把表达增加(或接通)至产生所需的表型的水平。
合适的启动子包括花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)基因启动子，该启动子实际上在所有的植物组织中都以高水平表达(Benfey等，1990a和1990b)；玉米谷胱甘肽-S-转移酶同种型Ⅱ(GST-Ⅱ-27)基因启动子，该启动子是在对施加外源安全剂产生响应时被激活的(WO93/01294,ICI有限公司)；花椰菜部分(meri)5启动子，该启动子在营养顶端分生组织以及几个在植物体中易于定位的位置(例如内韧皮部、花原基、在根和茎干上的分支点)上进行表达(Medford,1992:Medford等人，1991)；以及拟南芥的LEAFY启动子，该启动子是在花朵发育很早的时候进行表达的(Weigel等，1992)。
已经证实GST-Ⅱ-27基因启动子可以受某些化合物的诱导，而所说的化合物可以施加给正在生长的植物。上述启动子在单子叶植物和双子叶植物中都能发挥作用。因此，可以使用上述启动子来控制在多种经遗传修饰的植物中的基因表达，其中包括大田作物(如canola、向日葵、烟草、甜菜、棉花)；谷类(如小麦、大麦、稻、玉米、高粱)；水果(如西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉和甜瓜)；以及蔬菜(如胡萝卜、莴苣、甘蓝和洋葱)。GST-Ⅱ-27启动子也适用于多种组织，其中包括根、叶、茎干以及生殖组织。
因此，在另一方面，本发明提供了含有可操作地连接到本发明所提供的核苷酸序列(诸如拟南芥的GAI基因，来自另一植物物种的同源序列或其任意的突变体、衍生物或等位基因)上的诱导型启动子的基因构建体。这样可以控制所述基因的表达。本发明也提供了用所说的基因构建体转化的植物及方法，该方法包括把该构建体引入植物细胞中和/或通过施加合适的刺激、即一种有效的外源诱导物来诱导一种构建体在植物细胞中表达。所说的启动子可以是GST-Ⅱ-27基因启动子或任何其它的诱导型植物启动子。
当把选定的基因构建体引入细胞中时，必须对某些为本领域普通技术人员所熟知的因素加以考虑。应当把待插入的核酸装配进含有驱动转录的有效的调节因子的构建体中。必须采用一种把所说的构建体转运进入细胞的方法。一旦所述构建体位于细胞膜中，就将会发生或者不发生向内源染色体物质上的整合。最后，就植物而言，靶细胞的类型必须是能够再生成为全植株的细胞。
可以使用由赋予选择性表型的嵌合基因组成的选择性的遗传标记，所说的表型例如为对卡那霉素、潮霉素、膦基麦黄酮(phosphinotricin)、chlorsulfuron、氨甲蝶呤、庆大霉素、放线壮观素、咪唑啉酮和glyphosate等抗生素的抗性。
本发明一方面涉及本发明的核酸在生产转基因植物中的用途。
另一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括将所说的核酸引入到植物细胞中并引起或使得所说的核酸插入到该细胞的基因组中。
任意一种适用于植物转化的方法都可以用来生成含有本发明的核酸的植物细胞。在转化后，可以从转化的植物细胞和组织中再生成植物。
在把所述核酸引入植物细胞之后、也可以选择性地在把植物细胞再生成植物之后选择成功地进行了转化的细胞和/或植物(即含有插入到其基因组中的所述结构)，例如，使用一个或多个诸如抗生素抗性的标记基因(参见上文)。
通过在植物的遗传操作中已经熟知的标准方法可以生产出用含有上述序列的DNA片段转化的植物。可以采用任何合适的技术把DNA转化进植物细胞中，例如由利用其天然的基因转化能力的农杆菌携带的非杀伤性(disarmed)的Ti-质粒载体(EP-A-270355,EP-A-0116718,NAR 12(22)8711-87215 1984)、粒子或微粒轰击(US5100792,EP-A-444882,EP-A-434616)、微量注射(WO 92/09696,WO94/00583,EP 331083,EP 175966,Green等(1987)植物组织和细胞培养，学术出版社)、电穿孔(EP 290395,WO 8706614 Gelvin Debeyser-参见附录)、其它形式的直接DNA摄取(DE 4005152,WO 9012096,US4684611)、脂质体介导的DNA摄取(例如Freeman等，植物细胞生理学29:1353(1984))、或涡旋方法(例如Kindle,PNAS美国87:1228(1990d))。Oard在《生物技术进展》((1991)9:1-11)中综述了用于转化植物细胞的物理方法。
在现有技术中，本领域普通技术人员广泛地使用农杆菌转化来转化双子叶植物。近来在几乎所有与经济相关的单子叶植物中，在常规生产稳定的可育的转基因植物方面已经取得了实质性的进展(Toriyama等(1988)生物/技术6,1072-7074；Zhang等(1988)植物细胞报道7,379-384；Zhang等(1988)应用遗传学理论76,835-840；Shimamoto等(1989)自然338,274-276；Datta等(1990)生物/技术8,736-740；Christou等(1991)生物/技术9,957-962；Peng等(1991)国际水稻研究所，马尼拉，菲律宾563-574；Cao等(1992)植物细胞报道11,585-591；Li等(1993)植物细胞报道12,250-255；Rathore等(1993)植物分子生物学21,871-884；Fromm等(1990)生物/技术8,833-839；Gordon-Kamm等(1990)植物细胞2,603-618；D’Halluin等(1992)植物细胞4,1495-1505；Walters等(1992)植物分子生物学18,189-200；Koziel等(1993)生物技术11,194-200；Vasil I.K.(1994)植物分子生物学25,925-937；Weeks等(1993)植物生理学102,1077-1084；Somers等(1992)生物/技术10,1589-1594；WO 92/14828)。具体地讲，农杆菌介导的转化现在也正成为单子叶植物的一种高效的转化方法(Hiei等(1994)植物杂志6,271-282)。
在禾谷类稻、玉米、小麦、燕麦和大麦中已经实现了可育的转基因植物的生产(在下列文献中进行了综述Shimamoto,K.(1994)生物技术现代观5,158-162；Vasil等(1992)生物/技术10,667-674；Vain等1995，生物技术进展13(4):653-671；Vasil,1996，自然生物技术14第702页)。
当农杆菌效率低或无效时，优选微射轰击、电穿孔和直接DNA摄取。另一方面可以利用不同技术的结合来提高转化过程的效率，例如用涂覆了农杆菌的微粒进行轰击(EP-A-486234)或者微射轰击来诱导受伤，随后用农杆菌进行共培养(EP-A-486233)。
Moloney等(1989)在植物细胞报道8:238-242中披露了欧洲油菜(Brassica napus)的转化。
在转化后，例如可以从单细胞、愈伤组织或叶复盘(1eaf discs)再生植物，而这一技术是现有技术中的标准技术。几乎任意一种植物都能完整地从所述植物的细胞、组织和器官中再生出来。可以采用的技术在下面的文献中进行了综述Vasil等，植物的细胞培养与体细胞遗传学，第Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ卷，实验室方法及其应用，学术出版社，1984以及Weissbach和Weissbach，用于植物分子生物学的方法，学术出版社，1989。
对转化技术进行的具体的选择将由转化某些植物物种的效率以及用所选择的具体方法实施本发明的人员的经验和喜好来决定。对本领域普通技术人员来说显而易见为了把核酸引入植物细胞而对转化系统进行的具体的选择对本发明并非是必不可少的或者并不限制本发明，而且对植物再生技术的选择情况也相同。
在本发明中，超量表达可以通过引入以有义取向的核苷酸序列来实现。因此，本发明提供了一种影响植物特性的方法，该方法包括引起或使得来自所说植物细胞中的核酸的本发明的核酸的表达。
所说基因产品多肽的表达不足可以通过使用反义技术或“有义调节”来实现。目前已经很好地确定了使用反义基因或部分基因的序列进行基因表达的减量调节。将DNA置于启动子的控制下，以便使该DNA的“反义”链转录生成RNA，该RNA互补于由靶基因的“有义”链转录的正常的mRNA。对双链DNA而言，这可以通过在启动子的控制下设置以“逆向取向”的编码序列或其片段来实现。然后人们人为互补的反义RNA序列与mRNA结合生成了双螺旋，这就抑制了内源mRNA从靶基因翻译为蛋白质。无论上述情况是否属实，但上述作用的方式仍是不确定的。但应当明确的是该技术真的奏效。例如，参见Rothstein等，1987；Smith等(1988)自然334,724-726；Zhang等(1992)植物细胞4,1575-1588；English等(1996)植物细胞8,179-188。在以下综述性文献中也回顾了反义技术Bourque(1995)植物科学105,125-149以及Flavell(1994)PANS美国91,3490-3496。
不必使用对应于以逆向取向的编码序列的完整序列，例如，可以使用足够长的片段。对本领域普通技术人员来说，从编码序列的不同部分筛选不同大小的片段以优化反义抑制的水平为常规技术。包括起始蛋氨酸ATG密码子以及可能有的位于该起始密码子上游的一个或多个核苷酸是有利的。另一种可能性为寻靶基因的调节序列，例如一种序列，该序列对一种或多种病原体中的一个或多个基因是特征性的，其对病原体的抗性是人们所需的。合适的片段至少可以有大约14-23个核苷酸，例如大约有15,16或17或者更多个核苷酸，至少大约有25个、至少约有30个、至少约有40个、至少约有50个或更多的核苷酸。在共同抑制中可以使用以有义取向的上述片段(参见下文)。
序列的完全互补并非是必不可少的，尽管这种情况为优选的情况。在反义构建体中，可以有一个或多个核苷酸区别于靶基因。对相应的反义和有义RNA分子而言，其间优选有足够的同源性以便进行杂交，尤其是在存在于植物细胞中的条件下情况更是如此。
因此，本发明还提供了一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使得本发明的核酸进行反义转录。
当以有意义的取向、即与靶基因相同的取向插入靶基因的额外的拷贝时，可以产生多种表型，其中包括来自靶基因的蛋白质发生超量表达的一些表型以及所述蛋白质发生表达不足的一些表型。当所插入的基因仅为内源基因的一部分时，在转基因群体中表达不足的个体的数目会增加。发生有义调节的机理、尤其是减量调节的机理目前尚不十分清楚。但是，在科学和专利文献中已经大量报道了这一技术并常规使用该技术进行基因控制。例如，参见van der Krol等(1990)植物细胞2,291-299；Napoli等(1990)植物细胞2,279-289；Zhang等(1992)植物细胞4,1575-1588；以及US-A-5,231,020。
因此，本发明还提供了一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使本发明的核酸进行表达。该方法可以用来影响生长。
现在将参照附图通过举例的方式来说明本发明的几个方面及实施方案。对本领域普通技术人员来说，进一步的方面及实施方案是显而易见的。在本文中所提到的所有的文献都被收作本文参考。
本文包括下面的附图图1赤霉素的基本碳环结构。
图2含有被转座的Ds的gai-t6品系，Ds间断了被转录的基因。
图2a对GAI、gai和gai-t6而言，所示的植物为纯合的(从左至右)。GAI和gai-t6植物是无法区别的。
图2b使用Ds探针进行DNA凝胶-印迹杂交。在GAI泳道中的DNA缺乏Ds。gai泳道含有来源于植物的DNA，该植物对gai和T-DNAA2645而言是纯合的，它含有Ds(18.0 kb EcoRI片段)。gai-t6泳道含有来自于植物的DNA，该植物对A264和被转座的Ds(15.5 kb片段)而言是纯合的。
图2c使用放射性标记的GAI cDNA探针进行DNA凝胶-印迹杂交。所说的cDNA能与来自GAI和gai的DNA中的5.1 kb Bc1Ⅰ片段进行杂交，而在gai-t6中能与6.4和2.8 kb的片段杂交。由于在Ds中一经Bc1Ⅰ切割，Ds插入片段的任一侧翼为编码所说cDNA基因(GAI)。在1.7kb处的较微弱的杂交为几种经较长时间曝光后观察到的杂交中的一种杂交，并确认其为与GAI有关的序列。
图3编码具有GAI功能的多肽的GAI基因的核苷酸序列。
图4:GAI和gai蛋白质的一级结构。该图示出了由GAI的基因组DNA序列推定的氨基酸序列。以黑体字和双划线来表示在gai中缺失的17个氨基酸的片段。
图5用于由GA调节的植物生长的脱阻抑模型。
图6:gai-衍生的等位基因的核苷酸及其所编码的氨基酸的序列。
图6a:gai-d1的核苷酸序列。
图6b:gai-d1的氨基酸序列。
图6c:gai-d2的核苷酸序列。
图6d:gai-d2的氨基酸序列。
图6e:gai-d5的核苷酸序列。
图6f:gai-d5的氨基酸序列。
图6g:gai-d7的核苷酸序列。
图6h:gai-d7的氨基酸序列。
实施例1GAI和gai基因的克隆和鉴定把gai对拟南芥属植物的染色体12进行定位，其距离携带Ds转座子5,15的T-DNA插入片段大约11cM。遗传分析表明，功能丧失性等位基因能赋予高大的表型，该表型与野生型等位基因(GAI)5,6所赋予的表型是无法区分的。我们曾尝试通过插入诱变利用Ds趋于优先转座到连接位点上的趋势来克隆GAI16,17。
构建出对A264和gai为纯合的植物品系，该品系含有表达Ac转座酶的转基因(ΔNaeⅠ-sAc(GUS)-1)。从如下所述5的材料中分离出对推定的Ds插入等位基因而言为纯合的植物，该植物命名为gai-t6。该材料是通过自花授粉经过几代积累而形成的。在该积累过程中，筛选具有比对gai纯合子所期望的分枝长得更长的茎的分枝的植物。把从上述分枝的自花授粉得到的种子播种下去，以便进行周密的检测。一个上述分枝的子代以大约四分之一的频率分离出高大的表型，该表型与由GAI赋予的表型无法区分(图2a)。这些植物对新的gai等位基因来说是纯合的，我们将其命名为gai-t6。
DNA凝胶-印迹实验表明gai-t6含有插入已知包含GAI的1号染色体的区域(约为200kb)中的转座的Ds(图2b)(数据未显示)。用公知方法进行基因组DNA的制备以及凝胶-印迹杂交5。将EcoRⅠ消化液与Ds探针(Ac的放射性标记的3.4 kb XhoⅠ-BamHⅠ亚片段)进行杂交。通过遗传分离，丧失了gai-t6(ΔNaeⅠ-sAc(GUS)-1)。
进一步的实验表明转座的Ds阻断基因(GAI)的转录区，并且拟南芥的基因组至少含有一个与GAI之间有显著的序列同源性的额外的基因(图2c)。如前所述，分离出含有在gai-t6中靠近转座Ds的3’末端的基因组DNA的放射性标记的IPCR片段24。在使用该探针时必须十分小心，因为该探针可能会受到来源于A264中Ds(仍存在于gai-t6品系中)的T-DNA 3’的序列的污染。但是，该探针与来自缺少任意T-DNA插入片段的植物的DNA发生杂交实际上表明该探针可以用来克隆基因组DNA的区域，其中已经插入了gai-t6中转座的Ds。已经表明该探针与基因组DNA粘粒克隆杂交，而该克隆事先已通过以限制性酶切图谱为基础的克隆被鉴定为有可能含有GAI。使用这些粘粒中的一种通过杂交来鉴定来自cDNA文库的克隆，其中所说的文库是由从气生植物的部分(拟南芥属)中分离出来的mRNA构成的。根据上述cDNAs与来自GAI、gai和gai-t6的基因组DNA进行杂交来对这些cDNAs分类。这些克隆中的一些克隆与含有GAI的片段微弱地杂交(通过由在gai-t6中Ds的插入引起的片段大小的改变来进行定义)，但其与其它有关序列更强烈地进行杂交。据推测，上述cDNAs是从mRNAs衍生出来的，其中mRNAs是从在序列上与GAI有关的基因转录而来的、而不是从GAI自身转录来的，并且在一方面将上述cDNAs用于进一步的研究。一种cDNA、即pPC1与GAI强烈地杂交，并与含有与GAI有关的序列的片段进行不太强烈的杂交。该cDNA的部分DNA序列与位于gai-t6中Ds插入片段旁侧的约150bp的基因组DNA是相同的。
逆向分析表明从gai-t6中切除Ds与显性矮小表型的恢复有关。
两个重叠的GAI cDNAs的DNA序列显示出一个编码一种具有532个氨基酸残基的蛋白质(GAI)的开放读框(ORF)。从GAI和gai基因组DNA扩增含有该ORF的DNA片段。使用来源于重叠的cDNAs pPC1和pPC2的DNA序列的寡核苷酸引物通过PCR扩增来自GAI和gai基因组DNA的1.7kb的片段。所使用的引物的序列为引物N6: 5’TAG AAG TGG TAG TGG3’；引物AT1: 5’ACC ATG AGA CCA GCC G3’。
引物AT1的序列与基因组和c-DNA克隆的序列有一个碱基的区别。在获得最终校正型式的序列之前，在测序步骤的极早期就合成了该引物。
测定了来自重复扩增的片段的DNA序列，从而避免了由PCR引入的错误。
GAI基因组序列几乎与重叠cDNAs的序列相同。其中有3个核苷酸的取代，这可能是由于生态型之间存在着差异并且它不会改变推测的GAI的氨基酸序列。上述基因组片段的序列表明ORF没有被内含子阻断(图3)。
在gai-t6中的Ds插入片段位于Glu182与Asn183密码子之间(图4)。推测的GAI的二级结构显示出具有极少的突出特征。GAI在很大程度上是一种亲水性蛋白质，在靠近其氨基-末端处有一个意义不明确的多组氨酸序列，并且有一个弱的疏水性区域包围着在Asn183处的可能的糖基化位点。计算机分析表明该疏水区域极不可能为一个跨膜结构域。
对DNA与蛋白质序列数据库的检索表明在GAI中没有明显的功能域。gai从GAI ORF中缺失了51 bp。这种符合读框的缺失使得在gai中缺少一段17个氨基酸残基的片段，其中该片段位于靠近推测的GAI蛋白质的氨基末端处(图4)。
Laurenzio等人45在本申请的优先权日之后报道了一个针对拟南芥属植物的SCR(SCARECROW)基因的序列，该基因的突变导致根部缺少一个细胞层。公开的SCR序列与本发明的拟南芥GAI序列之间有一些同源性，但其缺少所述的17个氨基酸基序。
以前出版的文献描述了在γ-辐射诱变后分离gai衍生的等位基因5。当这些等位基因为纯合时，它们赋予了与由GAI赋予的表型无法区分的高大的表型。对从几种衍生的等位基因(gai-d1,gai-d2,gai-d5与gai-d7)扩增的片段所进行的序列测定表明每种都含有gai特有的51 bp的缺失。图6中示出了上述等位基因的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列。它们也包含额外的突变，而该突变可能会产生非功能性基因产物(表1)。gai突变表型的丧失与上述每种突变有关的事实以及可逆数据(reversion data)(参见上文)证明已经克隆了GAI。此外，上述结果与gai-d6等位基因为无效等位基因5,6的预测是一致的。
由于插入性诱变为功能增益性突变，因而通过插入性诱变克隆gai是可行的。由于多种原因，上述突变具有显性效应，其中包括正常基因产物的异位表达或表达提高或者改变了突变基因产物的功能。在本文中，我们证明了gai突变与产物的改变有关。从GAI中缺失17个氨基酸残基的结构域便生成了突变蛋白质(gai)，该蛋白质以遗传显性型式造成矮态。这就强烈地暗示着GAI为一种生长阻抑物，并且GA通过拮抗GAI的作用脱去了对生长的阻抑。在突变的gai蛋白质中缺失的结构域是造成与GA信号或与GA自身相互作用的原因。然后，gai将以组成型方式阻抑生长，这是由于GA不能拮抗gai的缘故。在图5中将进一步详细地描述GA-介导的植物生长调节的脱阻抑模型，但应当指出的是不能以该设想来限制本发明的范围。为了实施本发明，不必预先了解GAI和gai作用的实际模式的知识，即它们是如何起作用的，而该知识是在克隆野生型GAI基因及其突变型式的过程中发现的。
位于拟南芥属的SPINDLY(SPY)基因座处的突变提高了对GA生物合成抑制剂的抗性、减少了对用于生长调节的GA的依赖18，并且赋予了以前在其它植物物种中所述的细长突变体特有的表型19-23。最近的实验已经表明由gai赋予的矮小的表型可部分受到位于SPY和其它基因座的突变的抑制6,9。我们设想SPY与由上述其它的基因座编码的蛋白质均参与了来源于GAI的生长阻抑信号的下游转导(图5)，而这一设想也不限制本发明的范围。
根据图5所示的模型，由于GA(或GA信号元件)对GAI(阻抑生长的一种蛋白质)的活性产生拮抗，因此GA可以脱去对植物生长的阻抑作用。通过SPY6,18,GAR26,GAS2(J.P.与N.P.H.，未出版)和其它的蛋白质来传导生长阻抑信号。正常的植物(GAI)之所以长得高是由于内源GA的含量高到基本上足以拮抗GAI阻抑物的活性。GA缺陷型植物含有的GA不足以拮抗GAI的阻抑作用到相同的程度，因而使植物变得矮小25-27。gai突变植物变得矮小2是由于突变的gai蛋白质不受GA的拮抗并以显性型式阻抑生长。spy,gar2与gas2突变在一定程度上抑制了gai表型并且赋予了对GA生物合成抑制剂的抗性6,18。与spy,gar2或gas2的任意一种突变单独起的作用相比，这三种突变的配对组合使得gai的抑制作用更为突出并且提高了对GA生物合成抑制作用的抗性。因此，我们设想这些基因编码下游的组分，该组分造成了来自GAI的生长阻抑信号的传递。有可能gai突变与在玉米10-12和小麦13中对GA不敏感的突变功能相同。因此，可以使用该模型来对由GA调节的植物生长进行一般性的解释。
针对在玉米11,12中对GA-不敏感的矮小突变体以及在豌豆和大麦19-23中不依赖于GA的细长突变体进行的独立的研究已经暗示着在GA的信号转导中涉及阻抑物的功能。从本文所述的能起作用的实例表明拟南芥的GAI大概就为这样的一种阻抑物。这就重要地暗示着GA不是通过激活、而是通过脱阻抑来调节植物的生长的。
实施例2从小麦、稻和芸苔属植物(Brassica sps)克隆GAI同源序列从小麦、稻和芸苔属植物中通过降低探查cDNA或含有来自上述物种的DNA的基因组DNA文库的严格性来分离含有潜在的GAI同源序列的DNA。然后使用标准的技术来纯化杂交克隆。
另一方面，通过针对cDNA和其它序列进行EST数据库的筛选来鉴定潜在的GAI同源序列，所说的序列与GAI序列之间有在统计学上显著的同源性。然后，通过从相应的分布中心中寻求上述序列来得到克隆。表2给出了在包含EST序列的公共序列数据库中检索的详细结果，其中的EST序列是在随机测序程序中得到的，上述结果表明在包括Zea Mays(玉米)、O.Sativa(稻)以及Brassica napus(油菜)在内的不同的物种之间已经发现了同源序列。
就小麦和玉米而言，重要的是了解上述同源序列是否对应于以前表征过的Rht和D8遗传基因座。这可以通过如下的步骤进行测定。
把来自稻、小麦或玉米的cDNA或基因组DNA在小麦的基因组图谱上进行定位，从而测定所说的DNA在图谱上的位置是否对应于小麦中的Rht基因座在图谱上的位置。另外，在玉米中存在D8的潜在的转座子-插入片段的等位基因，利用这些事实可以证明D8的克隆方式与我们已证实的来自拟南芥属植物的gai的克隆方式相同。通过对这些不同的cDNA以及基因组DNA的克隆进行测序、研究其表达形式并检验改变其表达的效果，得到了在调节植物生长方面具有类似于GAI功能的基因。
制备出了上述序列的突变体、衍生物、变体以及等位基因并按照适宜的方法进行了鉴定。
实施例3在大肠杆菌中表达GAI和gai蛋白质使用PCR从含有GAI和gai基因的基因组DNA克隆(基因中没有内含子)中扩增含有完整的GAI或gai开放读框的DNA片段。使用将ATG翻译起始密码子转变成BamHⅠ限制性内切酶位点的引物进行扩增。在另一末端处(在终止密码子以外)，该片段具有一个PstⅠ限制性内切酶位点。克隆上述产物，并且测定其DNA序列以确保在PCR过程中没有错误引入。将正确的片段克隆进BamHⅠ/PstⅠ消化的PQE30表达载体中(来自Qiagen公司的Qiaexpressionist试剂盒)，从而生成了具有在大肠杆菌中表达GAI和gai蛋白质的潜能的构建体。在该载体中的表达受到了IPTG-诱导型启动子的调节，并且得到的蛋白质带有一个N-末端多组氨酸的标记，其中可以使用所说的标记从细胞提取物中纯化所说的蛋白质。
用IPTG进行的诱导造成了GAI和gai蛋白质在大肠杆菌中的高水平的表达。
实施例4表达构建体以及转化植物(a)使用内源启动子进行正常水平的表达通过从合适的基因组克隆中进行亚克隆将GAI和gai基因分离成5kb的EcoRⅠ/EcoRⅤ片段(在编码序列的旁侧含有大约1.5kb的非编码序列)。把上述片段克隆进Bluescript载体(再分离成EcoRⅠ/XbaⅠ片段)中并将其连接到二元载体上以便转移到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1中，其中如Valvekens等32所述或者通过新近的真空渗入方法33将T-DNA引入拟南芥属及烟草植物中，并且如Moloney等人34所述使用高效的农杆菌转化技术将T-DNA引入欧洲油菜中。
(b)使用外源启动子的超量表达使用来自载体pJIT60与pJIT62的DNA已制备出了构建体，其中pJIT60含有一个双35S启动子36，pJIT62为pJIT60的修饰形式，它含有一个单35S启动子。把来自上述载体的启动子与大约100 bp的5’非编码序列融合，该非编码序列的后面跟随了一个ATG以及完整的GAI或gai的开放读框、其后为翻译的终止密码子、其后为大约20 bp的3’非编码序列、其后为一个聚腺苷酸化信号上述所有的序列均携带在SstⅠ/XhoⅠ片段上。
已将该片段连接到二元载体中，以便如以前所述的那样通过使用根癌农杆菌或以裸DNA引入到转基因植物中。
实施例4修饰GAI与gai序列通过在PCR中使用合适的寡核苷酸引物从GAI和gai扩增包含gai缺失的GAI开放读框的一段短的片段，其中的引物是在本文所提供的序列信息的基础上设计出来的。然后使扩增的片段经历一次或多次不同形式的诱变(例如参见Sambrook等)，从而生成了一系列重叠缺失突变体，或者如果人们需要的话，在该区域中可以取代单个的核苷酸。
通过限制性内切酶消化以及随后的连接反应，然后用突变的扩增片段代替GAI中与之相当的区段。然后如上所述，在转基因植物中以正常水平或者通过超量表达来表达这种新的变体。
对构建体进行研究以便评价其在模型(例如拟南芥属与烟草)和作物(例如小麦、稻和玉米)物种中对植物生长调节的作用。不同的构建体赋予了不同程度的矮态并且尤其可以分别适用于修饰和改进特定的作物物种或者在特定环境中生长的作物。
实施例5GAI无效等位基因提高了对paclobutrazol的抗性Paclobutrazol为一种三唑衍生物，在贝壳杉烯氧化酶反应36,37中它特异性地抑制GA的生物合成，从而降低了内源GA的含量，并且在接触到该物质的植物中赋予了植物矮小的表型。豌豆和大麦的细长突变体对paclobutrazol的致矮作用有抗性36-42，这与拟南芥属组成型GA-反应突变体spy43,44一样。因此在这些突变体中，茎的伸长至少部分地与正常植物特有的GA介导的控制不发生联系。令人感到惊奇的是gai-t6突变体也表现出对paclobutrazol的抗性。当在含有paclobutrazol的培养基上进行培育时，gai-t6突变体比GAI对照植物呈现出更长的花的苔茎。该结果表明GAI功能的丧失造成了在茎伸长的过程中对GA的依赖性有所下降。另一方面，GAI无效突变体似乎比正常的植物需要更少的内源GA以实现某种程度的生长。gai-t6没有完全放弃对GA的依赖，这可能是由于序列中与GAI有关的基因产物(参见上文)能够基本上、但并不是完全地补偿GAI功能的丧失。这些观测结果很有价值，因为这些结果表明野生型基因产物GAI为一种GA信号-转导组分。
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表1在GAI等位基因中的突变等位基因突变的性质在编码序列 突变结果中的位置gai-d1 CAG至TAG Glu239终止密码子，截短的多肽gai-d2 GAT至GA Asp274移码，添加了两个新的氨基缺失一个碱 酸，截短的多肽基gai-d5 缺失7个碱 其后为Leu281移码，添加了18个新的氨基基也为C至 酸，截短的多肽Ggai-d7 GTT至GTVa1l56移码，添加了27个新的氨基缺失一个碱 酸，截短的多肽基*下划线代表在每个等位基因中核苷酸的取代。上述等位基因是在经γ-辐射诱变gai纯合子5后分离出的。从来自每个等位基因的基因组DNA中扩增1.7 kb片段，并且如上所述对该片段进行序列测定。每个等位基因含有gai特有的51 bp的缺失，这就证实了它们均真正地来源于gai而并非污染物。
于11/1/96检索的数据库 表2与GAI c-DNA具有同源性的ESTs1．与头200个氨基酸的同源性。克隆鉴定 物种清除(blast)泊松可能性EM_EST1:ATTS3217 拟南芥 4.8.e-32EM_EST1:AT7823 拟南芥 4.8.e-24EM_EST1:AT7938 拟南芥 7.2.e-22EM_EST3:OSS0803A O.Sativa(稻) 7.8.e-11EM_EST1:AT5178 拟南芥 0.014EM_EST1:AT9456 拟南芥 0.0262．-与氨基酸200-400的同源性。克隆鉴定 物种清除泊松可能性EM EST1:ATTS4818 拟南芥 1.5.e-21EM EST3:ZM3101 Zea Mays(玉米) 9.1.e-14EM EST1:ATTS1110 拟南芥 7.9.e-10EM EST1:ATTS3935 拟南芥 1.7.e-9EM STS:ZM7862 Zea Mays(玉米) 4.5.e-7EM EST1:AT7938 拟南芥 0.00011EM EST3:OSS3989A O.Sativa(稻)0.000503．-与最后132个氨基酸的同源性。克隆鉴定物种 清除泊松可能性EM EST1:AT2057 拟南芥 3.1.e-52EM EST1:ATTS3359 拟南芥 3.2.e-42EM EST3:OS0713A O.Sativa(稻) 2.8.e-10EM EST1:BN6691 B.Napus(油菜) 3.0.e-5EM EST1:ATTS3934 拟南芥 0.00034EM EST1:ATTS4819 拟南芥 0.00059EM EST1:AT4839拟南芥 0.00060EM EST1:ATTS1327 拟南芥 0.00073EM EST1:AT1868拟南芥 0.0054EM EST1:AT79316 拟南芥 0.092EM EST1:AT7747拟南芥 0.3权利要求
1．一种核酸分离物，该分离物具有编码包含图4所示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列。
2．根据权利要求1的核酸，其中所说的编码核苷酸序列包含图3所示的编码核苷酸序列。
3．根据权利要求1的核酸，其中所说的编码核苷酸序列包括通过在图3所示的编码核苷酸序列中添加、取代、插入和/或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因、衍生物或变体。
4．一种核酸分离物，该分离物具有编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括一个氨基酸序列，所说的氨基酸序列为图4所示的拟南芥的GAI氨基酸序列的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列或者为其它物种的同源序列或其突变体、等位基因、衍生物或变体，其中所说的突变体、等位基因、衍生物、变体或同源序列通过插入、缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸以区别于图4所示的氨基酸序列，其中所说的核酸在植物中的表达造成了对植物生长的抑制，而该抑制作用受赤霉素(GA)的拮抗。
5．根据权利要求4的核酸，其中所说的核酸在植物中的超量表达赋予了植物矮小的表型，该矮小表型可以通过用GA处理来加以校正。
6．根据权利要求4或权利要求5的核酸，其中所说的多肽包括图4中划有下划线的17个氨基酸的序列。
7．根据权利要求4或权利要求5的核酸，其中所说的多肽包括17个氨基酸残基的邻接序列(Contiguous Sequence)，其中至少有10个残基与图4中划有下划线的17个氨基酸序列相应位置处的残基之间具有相似性。
8．一种核酸分离物，该分离物具有编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括一个氨基酸序列，所说的氨基酸序列为图4所示的拟南芥的GAI氨基酸序列的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列或者为其它物种的同源序列或其突变体、等位基因、衍生物或变体，其中所说的突变体、等位基因、衍生物、变体或同源序列通过插入、缺失、添加和/或取代一个或多个氨基酸以区别于图4所示的氨基酸序列，其中所说的核酸的表达互补于植物中的GAI无效突变表型，该表型对paclobutrazol的致矮作用具有抗性。
9．根据权利要求4至8之任一权利要求的核酸，其中所说的植物为拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
10．一种核酸分离物，该分离物具有编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括一个氨基酸序列，所说的氨基酸序列由权利要求8的核酸进行编码只是缺失图4中划有下划线的17个氨基酸的序列或者17个氨基酸的邻接序列，而所说的邻接序列中至少有10个残基与图4中划有下划线的17个氨基酸序列相应位置处的残基之间具有相似性。
11．一种核酸分离物，该分离物具有编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括一个氨基酸序列，所说的氨基酸序列为通过插入、缺失、添加和/或取代一个或多个图4所示的拟南芥的GAI氨基酸序列或者其它物种的同源序列的氨基酸而生成的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列，其中所说的核酸在植物中的表达赋予植物一种对赤霉素不产生反应的矮小的表型。
12．根据权利要求11的核酸，其中所说的多肽包括图4所示的缺失了划有下划线的17个氨基酸的氨基酸序列。
13．根据权利要求12的核酸，其中所说的编码核苷酸序列包括图3所示的编码核苷酸序列，但其缺失了编码图4中划有下划线的氨基酸的核苷酸。
14．根据权利要求12的核酸，其中所说的编码核苷酸序列包括一个核苷酸序列，该核苷酸序列为通过插入、缺失、添加和/或取代一个或多个图3所示的但缺失了编码图4中划有下划线的氨基酸的核苷酸的核苷酸序列的核苷酸而生成的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列。
15．根据权利要求11的核酸，其中所说的多肽具有一个氨基酸序列，该氨基酸序列为通过缺失图4中划有下划线的17个氨基酸并且添加、插入、取代和/或缺失一个或多个氨基酸而生成的图4所示的氨基酸序列的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列。
16．根据权利要求11至15之任一权利要求的核酸，其中所说的植物为拟南芥。
17．一种核酸，该核酸具有编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽包括一个氨基酸序列，所说的氨基酸序列为通过插入、缺失、添加和/或取代一个或多个图4所示的拟南芥的GAI氨基酸序列的氨基酸而生成的突变的、等位基因的、衍生的或变异的序列，其中所说的多肽具有图6b、图6d、图6f或图6h所示的氨基酸序列。
18．根据权利要求17的核酸，其中所说的编码核苷酸序列为图6a、图6c、图6e或图6g所示的核苷酸序列。
19．根据权利要求1至18之任一权利要求的核酸，该核酸还包括用于从所说的编码核苷酸序列中进行表达的调节序列。
20．根据权利要求19的核酸，其中所说的调节序列包括诱导型启动子。
21．一种核酸分离物，该分离物具有互补于编码序列的至少14个邻接核苷酸的序列的核苷酸序列或者具有互补于根据权利要求1至15之任一权利要求的核酸的编码序列的序列，其适用于以反义或有义调节(“共同抑制”)所说的编码序列的表达。
22．根据权利要求21的核酸，该核酸为DNA并且其中所说的互补核苷酸序列是在调节序列的控制下进行反义转录的。
23．根据权利要求22的核酸，其中所说的调节序列包括诱导型启动子。
24．一种核酸载体，该载体适于转化植物细胞并且包括根据前述之任一权利要求的核酸。
25．一种宿主细胞，该细胞含有根据前述之任一权利要求的异源核酸。
26．根据权利要求25的宿主细胞，该细胞为微生物细胞。
27．根据权利要求25的宿主细胞，该细胞为植物细胞。
28．根据权利要求27的植物细胞，该细胞在其基因组中含有异源的所说的核酸。
29．根据权利要求28的植物细胞，该细胞在每个单倍体基因组中含有多于一个的所说的核苷酸序列。
30．根据权利要求27至29之任一权利要求的植物细胞，该细胞包含在植物、植物的部分或植物繁殖体或者植物的提取物或衍生物中。
31．一种生产根据权利要求25至30之任一权利要求的细胞的方法，该方法包括通过转化将所说的核酸插入所说的细胞中。
32．根据权利要求31的方法，该方法包括把所说的核酸与所说细胞的基因组核酸重组，从而使所说的核酸稳定地插入其中。
33．根据权利要求31或权利要求32的方法，该方法包括从一个或多个转化的细胞中再生植物。
34．一种植物，该植物含有根据权利要求27至29之任一权利要求的植物细胞。
35．一种植物，该植物为根据权利要求31的植物的有性或无性繁殖的子代、克隆或后代，或者为所说植物、子代、克隆或后代的任意部分或繁殖体。
36．根据权利要求35的植物的部分或繁殖体或提取物或衍生物。
37．一种生成植物的方法，该方法包括把根据权利要求1至24之任一权利要求的核酸插入到植物细胞中并从所说的植物细胞再生植物。
38．根据权利要求37的方法，该方法包括有性或无性繁殖或培育由所说的植物细胞再生的植物的子代或后代。
39．一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使得权利要求1至3之任一权利要求的异源核酸进行表达。
40．一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使得权利要求4至7之任一权利要求的异源核酸进行表达。
41．一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使得权利要求8或权利要求9的异源核酸进行表达。
42．一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使得权利要求10至16之任一权利要求的异源核酸进行表达。
43．一种影响植物特性的方法，该方法包括在所说植物的细胞中引起或使得权利要求21至23之任一权利要求的核酸进行转录。
44．根据权利要求1至3之任一权利要求的核酸在生产转基因植物中的用途。
45．根据权利要求4至7之任一权利要求的核酸在生产转基因植物中的用途。
46．根据权利要求8或权利要求9的核酸在生产转基因植物中的用途。
47．根据权利要求10至16之任一权利要求的核酸在生产转基因植物中的用途。
48．根据权利要求21至23之任一权利要求的核酸在生产转基因植物中的用途。
全文摘要
本发明克隆了拟南芥的GAI基因以及突变的和同源的基因序列。在植物中表达上述基因将影响包括生长在内的植物的特性。GAI的表达可抑制植物的生长,该抑制作用受到赤霉素(GA)的拮抗。gai突变体的表达赋予了对GA不敏感的矮小的表型。操纵植物中GAI和gai基因的表达会生成高大或者矮小的植物。矮小的植物特别有利于减少由倒伏引起的作物的损失。
文档编号C12N15/00GK1228784SQ97193739
公开日1999年9月15日 申请日期1997年2月12日 优先权日1996年2月12日
发明者N·P·哈伯德, J·彭, P·卡罗尔, D·E·里查德斯 申请人:植物生物科学有限公司