专利名称：多酚污染物生物降解过程中的相互作用及研究方法
技术领域：
本发明涉及一种多酚污染物生物降解过程中的相互作用及研究方法。
背景技术：
酚类化合物是指一系列芳香族碳氢化合物羟基衍生物的统称，会严重刺激呼吸系统和眼睛，腐蚀皮肤引起灼伤和皮炎，甚至造成慢性中毒引起消化系统障碍，神经系统紊舌L内脏受损等，在细胞内部会与蛋白质结合使其凝固，从而杀死细胞，具有极大原生质性的毒性危害。在水中存在的酚类化合物耗氧量较高，严重打破了水体生态中的氧平衡，而且在较低浓度下(l-10mg/L)会造成水体生物的大量死亡，抑制各种微生物生长，破坏水体生态平衡。含有酚类污染物的废水主要来自石油化工厂、塑料厂、合成纤维厂、炼油厂、树脂厂和焦化厂等化工企业，是水体的重要污染物之一。酚类污染物对所有生物活性体均能产生毒性，可通过与皮肤、粘膜的接触不经肝脏解毒直接进入血液循环，致使细胞破坏并失去活力，也可通过口腔侵入人体，造成细胞损伤。高浓度的酚液能使蛋白质凝固，并能继续向体内渗透，引起深部组织损伤，坏死乃至全身中毒，即使是低浓度的酚液也可使蛋白质变性。人如果长期饮用被酚污染的水能引起慢性中毒，出现贫血、头昏、记忆力衰退以及各种神经系统的疾病，严重的会引起死亡。工业含酚废水中同时含有苯酚、甲酚、氯酚、硝基酚等多种典型难降解酚类化合物，实现其无害化处理始终是一个世界性难题。酚类化合物被美国国家环境保护总局(EPA)列为129种优先控制污染物之一，并且规定废水中的酚浓度不得超过lmg/L。同时我国也将其列入“水中优先控制污染物黑名单”，对含酚废水的排放有着严格的标准。酚类污染物的处理手段有物理法，化学法与生物法。其中的生物法降解有机工业废水是目前应用最为普遍的含酚废水处理技术，但在生物处理过程中，有机污染物对微生物的毒害作用导致其降解效率低下，获得特异性的微生物菌种成为实现污染物高效降解的核心问题。但在从实 验室小试到实际废水处理应用过程中，往往由于污染物的复杂性和难降解性导致过程崩溃。研究发现，自然界中存在一些特殊微生物菌群，由于其系统组成和功能的多样性，能够表现出单菌株不具备的有机污染物降解代谢能力。在实验室条件下，多种纯培养微生物的混合培养也表现出对某一种或几种酚类污染物的降解作用的提高，甚至能够获得原先没有的降解能力。菌群组成和功能多样性带来的高污染物压力下的高效性和稳定性，为酚类污染物高效生物降解提供了继活性污泥和纯培养菌种之后的新思路。目前，含酚废水的治理方法随着对酚类危害认识和水处理技术不断发展而逐步发展起来的，主要分为三大类物理处理法，化学处理法和生物处理法。而且随着技术不断的发展各种方法不断结合和相互渗透，以达到更好的治理效果。生物法降解有机工业废水是目前应用最为普遍的含酚废水处理技术，至今已有一百多年的历史。它的工作原理是利用微生物的新陈代谢作用将废水中有机污染物转化为C02、N2和H2O等无毒害小分子物质排放。生物法处理效率高、应用广、处理能力强、设备较简单、产生二次污染极少、出水水质好、运行与操作方便及运行费用较低等优点，在当前工业废水处理技术中占主导地位。但生物处理过程受废水pH值、温度及含酚量和种类等因素的影响较大，所以对操作条件要求比较严格。尽管大量的苯酚降解野生菌已经被筛选出来，但是生产中含酚废水往往同时含有多种难降解化合物，限制纯菌株的应用发展。近些年研究发现，多种微生物的共同培养有利于它们代谢功能的有机结合。在实际废水中往往存在多种污染物，在其降解过程中存在着各种各样的相互作用，主要表现为相互抑制和促进的共代谢模式。因此单底物模型不能够描述这类混合物的降解。由于酚类污染物的复杂性和多样性，所以研究酚类污染物中各种组分对微生物降解的作用具有重要的实际意义。
发明内容
本发明提供了一种多酚污染物生物降解过程中的相互作用。本发明的另一个目的是提供对这种相互作用的一种研究方法。本发明所应用到的酚类污染物降解菌是铜绿假单胞菌 GMT1. 074。具体技术方案如下一种多酚污染物生物降解过程中的相互作用的研究方法，其步骤如下I)配置用于降解多酚污染物的培养基；酚类降解实验所用的选择性培养基是在无机盐培养基基础上添加苯酚或间甲酚作为碳源；在研究不同间甲酚浓度对苯酚降解影响时，固定苯酚的浓度，选择间甲酚的浓度不同浓度的几个梯度水平；在研究不同苯酚浓度对间甲酚的降解影响时，固定间甲酚的浓度，选择苯酚的不同浓度的几个梯度水平；每个梯度进行平行实验；2)利用铜绿假单胞菌GMT1. 074接种到培养基中进行培养；3)采用光密度法和恒重干`燥法进行测量菌体浓度；采用高效液相色谱法测定降解体系中的酚类物质浓度；4)根据培养过程中细胞浓度的变化和苯酚与间甲酚降解情况的变化，得到多酚污染物生物降解过程中的相互作用数据。所述的培养基是500mg(NH4)2S04，200mgKH2PO4, IOOmg MgSO4,800mgNa2HP04 · 12H20，20mg 酵母浸粉，IOmL 痕量元素母液和 IOOOmL H20。所述的痕量元素母液成分如下0· 4g MnSO4 · 4Η20，0· 4g ZnSO4 · 7H20，
0.1gNa2MoO4 · 2Η20，0· Ig CuSO4 · 5H20,1. Og CaCl2,10. Og Na2SO4, 2. Og FeSO4 · 7Η20，0· 5mLH2SO4, 2. Og NaOH, 12. Og 乙二胺四乙酸二钠和 IOOOmL H2O0所述步骤2)的培养方法是将纯净的初始OD6tltl值为O. 01的铜绿假单胞菌GIMT1. 074接种到培养基中，所有培养基初始pH值为7. 2，液体培养和固体培养温度为30°C，摇床培养时转速均为200rpm，培养时间为40小时。所述光密度法测量菌体浓度方法是光密度以相应的培养基做空白，在600nm波长下测定菌悬液的吸光度(OD6tltl);样品的浓度超过O. 8的时候需要稀释至0.8以下再用所测量的结果与稀释倍数相乘得到菌液的实际0D_值。6.如权利要求1所述的方法，其特征是恒重干燥法测量菌体浓度方法是将耐高温的离心管恒重至干重，称量记录，取一定体积不同生理时期不同浓度的菌液，离心，倾去上清液；用无菌蒸馏水冲洗细胞，反复洗涤两次，弃上清，然后将离心管和菌体放置干燥箱中干燥至恒重，称量记录。所述高效液相色谱法是高效液相色谱法色谱型号为安捷伦高效液相色谱1200，色谱柱型号为Eclipse XDB-C18,4. 6 X 250mm, 5 μ m ;流动相采用体积比甲醇水=4:3，流速1.OmL/min ;进样量为10 μ L，柱温30°C，UV器检测波长280nm。本发明利用铜绿假单胞菌GMT1. 074降解苯酚和间甲酚混合物的过程中发现I)间甲酚的浓度越高对苯酚降解的抑制作用越大，细胞浓度达到同样OD值所用的时间越长，但是在充足的反应时间之后，间甲酚浓度越高，最终细胞浓度越大；同时，间甲酚的浓度越高，完全降解苯酚和间甲酚所需要的时间越长；2)苯酚的浓度越高，对间甲酚降解具有一定的抑制作用，细胞浓度达到同样OD值所用的时间越短，但是在充足的反应时间之后，苯酚浓度越高，最终细胞浓度越大；同时，苯酚的浓度越高，完全降解间甲酚和苯酚的降解时间越长。本发明对培养过程中细胞浓度的变化和苯酚与间甲酚降解情况的变化进行分析，得到多酚污染物生物降解过程中的相互作用，这对于实际环境中酚类污染物的生物降解作用具有一定的理论指导意义和实际应用价值。
图1是不同浓度的间甲酚存在对铜绿假单胞菌GMT1. 074苯酚生物降解特性的影响，其中包括菌体的生物量变化趋势、体系中的苯酚浓度变化以及降解体系中间甲酚的浓
度变化。图2是不同浓度的苯酚存在对铜绿假单胞菌GMT1. 074间甲酚生物降解特性的影响，其中包括菌体的生物量变化趋势、体系中的苯酚浓度变化以及降解体系中间甲酚的浓
度变化。
具体实施例方式通过下面结合具体实例将有助于进一步理解本发明，但本发明的保护范围并不限制于此I配置用于降解多酚污染物的培养基A、无机盐培养基的成分是(NH4) 2S04500mg，KH2P04200mg, MgSO4IOOmg,Na2HPO4 · 12H20 800mg，酵母浸粉20mg，痕量元素母液10mL，H2O IOOOmL ;其中痕量元素母液成分如下MnSO4 · 4H20 O. 4g, ZnSO4 · 7H20 O. 4g, Na2MoO4 · 2Η20，0· lg, CuSO4 · 5H20 0. lg,CaCl 21· Og, Na2S0410. Og, FeSO4 · 7H20 2. Og, H2SO4O. 5mL, NaOH 2. Og,乙二胺四乙酸二钠12. Og, H2O IOOOmL0B、酚类降解实验所用的选择性培养基是在无机盐培养基基础上添加苯酚或间甲酚作为碳源。苯酚灭菌经过O. 22μm膜过滤，其他试剂和培养基灭菌在115°C下进行30min。在研究不同间甲酚浓度对苯酚降解影响时，固定苯酚的浓度为600mg/L，选择间甲酚的浓度为100、200、300、400、500mg/L五个梯度水平。在研究不同苯酚浓度对间甲酚的降解影响时，固定间甲酚的浓度为400mg/L，选择苯酚的浓度为200、300、400、500、600mg/L五个梯度水平，通过在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时；总共十个梯度，每个梯度进行三组平行实验。。每5小时取样测量反应体系中的菌体浓度和剩余的酚类污染物的浓度并进行分析，关联得到了不同成分对酚类污染物降解的影响作用方式。2铜绿假单胞菌GMT1. 074接种到培养基中培养将纯净的初始0D_值为O. 01的铜绿假单胞菌GMT1. 074接种到培养基中，进行培养，培养条件如下所有培养基初始PH值为7. 2，液体培养和固体培养温度均为30°C，摇床培养时转速均为200rpm。培养时间为40小时。3降解过程中的细胞浓度和酚类物质浓度测定方法是A.每隔5小时取出培养基中的样品，进行测量菌体的浓度和降解体系中的酚类物质浓度，测量菌体浓度的方法如下a菌体浓度采用光密度法和恒重干燥法进行测量。具体操作如下光密度以相应的培养基做空白，在600nm波长下测定菌悬液的吸光度(OD600)0需要注意的是，样品的浓度超过O. 8的时候需要稀释至O. 8以下再用所测量的结果与稀释倍数相乘得到菌液的实际OD60O 值。b恒重干燥法，将耐高温的离心管恒重至干重，称量记录，取一定体积不同生理时期不同浓度的菌液，离心，倾去上清液。用无菌蒸馏水冲洗细胞，反复洗涤两次，弃上清，然后将离心管和菌体放置干燥箱中干燥至恒重，称量记录。B.降解体系中的酚类物质浓度测定方法是 培养液中酚类物质的浓度采用高效液相色谱(HPLC)法测定。色谱型号为安捷伦(Agilent)高效液相色谱 1200,色谱柱型号为 Eclipse XDB-C18,4. 6 X 250mm, 5 μ m。流动相采用甲醇水=4:3 (V:V，流速1. OmL/min。进样量为10 μ L，柱温30°C，UV器检测波长280nm。具体测试数据如下实施例1苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第10小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为86. 31mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为100. 45mg/L和348. 79mg/L。实施例2 苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第15小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为151. 34mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为3. O lmg/L和276. 34mg/L。实施例3苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第20小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为213. 51mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酹和间甲酹的浓度分别为Omg/L和75. 24mg/Lo
实施例4苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第25小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为299. 61mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酹和间甲酹的浓度分别为Omg/L和5. 49mg/L。实施例5苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及600mg/L的苯酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第10小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为69. 28mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为596. 96mg/L和362. 49mg/L。实施例6苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及600mg/L的苯酚，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第20小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为326. 95mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为28 6. 45mg/L和321. 4lmg/L0实施例7苯酚浓度对间甲酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加400mg/L的间甲酹，以及600mg/L的苯酚，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第30小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为658. 34mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酹和间甲酹的浓度分别为Omg/L和103. 81mg/Lo实施例8间甲酚浓度对苯酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加600mg/L的苯酹，以及100mg/L的间甲酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第10小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为87. 21mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为281. 15mg/L和98. 29mg/L。实施例9间甲酚浓度对苯酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及100mg/L的间甲酚，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第15小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为163. 26mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为12.1 lmg/L和83. 24mg/L。实施例10间甲酚浓度对苯酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及100mg/L的间甲酚，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第20小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为364. 41mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酹和间甲酹的浓度分别为Omg/L和Omg/L。实施例11间甲酚浓度对苯酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及500mg/L的间甲酚，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第10小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为45. 48mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酹和间甲酹的浓度分别为598. 14mg/L和496. 31mg/L。实施例12 间甲酚浓度对苯酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及500mg/L的间甲酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第20小时用细胞干重测量法测得细胞的浓度为170. 63mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酚和间甲酚的浓度分别为312. 54mg/L和306. 5lmg/L0实施例13间甲酚浓度对苯酚降解的影响按要求配置酚类降解的无机盐培养基，在115°C下进行30min灭菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及500mg/L的间甲酹，在200rpm下的转速和30°C的摇床中培养40小时，在第30小时用细胞干重 测量法测得细胞的浓度为329. 15mg/L，运用液相色谱仪测量得到的苯酹和间甲酹的浓度分别为Omg/L和129. 46mg/L。测试数据绘制如图1和图2 :从图中可以明确得出多酚污染物生物降解过程中的相互作用，利用铜绿假单胞菌GMT1. 074降解苯酚和间甲酚混合物的过程中发现1.两种底物之间存在着相互抑制和促进作用，间甲酚的浓度越高对苯酚降解的抑制作用越大，细胞浓度达到同样OD值所用的时间越长，但是在充足的反应时间之后，间甲酚浓度越高，最终细胞浓度越大；同时，间甲酚的浓度越高，完全降解苯酚和间甲酚所需要的时间越长。2.苯酚的浓度越高，对间甲酚降解具有一定的抑制作用，细胞浓度达到同样OD值所用的时间越短，但是在充足的反应时间之后，苯酚浓度越高，最终细胞浓度越大；同时，苯酚的浓度越高，完全降解间甲酚和苯酚的降解时间越长。
权利要求
1.一种多酚污染物生物降解过程中的相互作用的研究方法，其特征是步骤如下 1)配置用于降解多酚污染物的培养基；酚类降解实验所用的选择性培养基是在无机盐培养基基础上添加苯酚或间甲酚作为碳源；在研究不同间甲酚浓度对苯酚降解影响时，固定苯酚的浓度，选择间甲酚的浓度不同浓度的几个梯度水平；在研究不同苯酚浓度对间甲酚的降解影响时，固定间甲酚的浓度，选择苯酚的不同浓度的几个梯度水平；每个梯度进行平行实验； 2)利用铜绿假单胞菌GIMT1.074接种到培养基中进行培养； 3)采用光密度法和恒重干燥法进行测量菌体浓度；采用高效液相色谱法测定降解体系中的酚类物质浓度； 4)根据培养过程中细胞浓度的变化和苯酚与间甲酚降解情况的变化，得到多酚污染物生物降解过程中的相互作用数据。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的培养基是500mg(NH4) 2S04，200mgKH2P04，IOOmg MgSO4,800mg Na2HPO4 · 12H20，20mg 酵母浸粉，IOmL 痕量元素母液和 IOOOmL H20。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是所述的痕量元素母液成分如下O. 4gMnS04 ·4Η20，0· 4g ZnSO4 ·7Η20，0· IgNa2MoO4 ·2Η20，0· Ig CuSO4 ·5Η20，1. Og CaCl2,10. OgNa2SO4, 2. Og FeSO4 ·7Η20，0· 5mL H2SO4, 2. Og NaOH, 12. Og 乙二胺四乙酸二钠和 IOOOmL H2O0
4.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤2)的培养方法是将纯净的初始0D_值为O. 01的铜绿假单胞菌GIMT1. 074接种到培养基中，所有培养基初始pH值为7. 2，液体培养和固体培养温度为30°C，摇床培养时转速均为200rpm，培养时间为40小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是光密度法测量菌体浓度方法是光密度以相应的培养基做空白，在600nm波长下测定菌悬液的吸光度(OD6tltl);样品的浓度超过O. 8的时候需要稀释至O. 8以下再用所测量的结果与稀释倍数相乘得到菌液的实际0D_值。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是恒重干燥法测量菌体浓度方法是将耐高温的离心管恒重至干重，称量记录，取一定体积不同生理时期不同浓度的菌液，离心，倾去上清液；用无菌蒸馏水冲洗细胞，反复洗涤两次，弃上清，然后将离心管和菌体放置干燥箱中干燥至恒重，称量记录。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是高效液相色谱法是高效液相色谱法色谱型号为安捷伦高效液相色谱1200，色谱柱型号为Eclipse XDB-C18，4. 6 X 250mm，5 μ m ;流动相采用体积比甲醇水=4:3，流速1.0mL/min ;进样量为1(^1^，柱温301，UV器检测波长280nm。
8.一种多酚污染物生物降解过程中的相互作用，其特征是利用铜绿假单胞菌GIMT1. 074降解苯酚和间甲酚混合物的过程中发现 1)间甲酚的浓度越高对苯酚降解的抑制作用越大，细胞浓度达到同样OD值所用的时间越长，但是在充足的反应时间之后，间甲酚浓度越高，最终细胞浓度越大；同时，间甲酚的浓度越高，完全降解苯酚和间甲酚所需要的时间越长； 2)苯酚的浓度越高，对间甲酚降解具有一定的抑制作用，细胞浓度达到同样OD值所用的时间越短，但是在充足的反应时间之后，苯酚浓度越高，最终细胞浓度越大；同时，苯酚的浓度越高，完全降解间甲酚和苯酚的降解时间越长。
全文摘要
本发明涉及一种多酚污染物生物降解过程中的相互作用及研究方法。配置用于降解多酚污染物的培养基；酚类降解实验选择性培养基是在无机盐培养基上添加苯酚或间甲酚作为碳源；在研究不同间甲酚浓度对苯酚降解影响时，固定苯酚的浓度，选择间甲酚的浓度不同浓度的几个梯度水平；利用铜绿假单胞菌GIMT1.074接种到培养基中在研究不同苯酚浓度对间甲酚的降解影响时，固定间甲酚的浓度，选择苯酚的不同浓度的几个梯度水平；每个梯度进行平行实验；对培养过程中细胞浓度的变化和苯酚与间甲酚降解情况的变化进行分析，得到多酚污染物生物降解过程中的相互作用，这对于实际环境中酚类污染物的生物降解作用具有一定的理论指导意义和实际应用价值。
文档编号C12Q1/02GK103060420SQ201210576260
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月25日 优先权日2012年12月25日
发明者贾晓强, 周征西, 闻建平 申请人:天津大学