一种利用24孔板筛选润滑油降解菌的方法
【专利摘要】本发明一种利用24孔板筛选润滑油降解菌的方法涉及一种功能型微生物的筛选方法，属于环境污染物生物降解领域。针对润滑油降解微生物的筛选，可以利用24孔板评价在菌种分离时获取的单菌落降解润滑油的能力，特别适用于大规模的菌种筛选。该方法利用在油水两相体系中，油膜的变化和细胞光密度的变化两个指标同时表征菌种对润滑油的降解能力，可以从大量的初筛菌株中优选出降解能力优良的菌种，为进一步开展菌种降解能力研究提供优化的菌种资源。该发明适用于油水两相实验体系，有效地减少了传统的以繁琐的摇瓶降解实验和含油量检测为评价依据的表征方法，大幅度地减少了工作量和实验耗材、缩短了实验周期。
【专利说明】一种利用24孔板筛选润滑油降解菌的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种功能型微生物的筛选方法，适合于微生物在油水两相反应体系中的功能特性表征，特别适用于大规模的菌种筛选，在环境微生物生物降解研究方面可以广泛应用。
【背景技术】
[0002]鉴于全球能源匮乏，以石油为原料加工而成的润滑油在生产加工、储运、使用过程中不可避免地会污染水土环境。在我国，润滑油消耗量已达到世界第二，且消耗量在逐年攀升。不同于燃油，润滑油在使用过程中因受到理化等因素的影响将导致品质下降，无法继续使用，而形成废油。受到能源需求紧张和严格的环保限制必须对废润滑油进行回收处理。在这部分废旧润滑油中，有近半数无法回收利用，由于包括废油处理企业在内的废润滑油产生单位缺乏有效的末端治理环节，而将其大量排入环境中，造成严重的环境污染和生态破坏。因此，利用生物降解技术进行润滑油污染的生物治理对于废油处理行业以及生态环境的可持续发展具有重要意义。
[0003]近年来，利用种群、功能多样化的微生物，针对废润滑油及其组分开展生物降解研究的报道越来越多。在这些研究中，高活力菌种资源的获取成为各类相关研究的物质基础。鉴于对于润滑油及其组分含量的检测手段较为繁琐，在大规模菌种筛选中工作量大，甚至难以在平行条件下进行菌种降解能力的评价。对此，本发明开发出一种利用24孔板筛选高活力润滑油降解菌种的方法。这种方法的理论基础建立在如下两个方面:其一，建立在油和水可以形成油水两相，且界面膜较为清晰，可以依赖于油膜在菌种作用下的消退情况来评价菌种对润滑油的降解能力；其二，依赖于润滑油被生物降解时生物量增加，同时，24孔板的每个参与实验的孔内，可以提供至少2mL以上的细胞发酵液，满足分光光度法检测对液体量的要求，因此，可以利用细胞光密度检测来作为另一判断依据。上述两个评价指标具有操作简单便捷、快速的优点，极大地减少了菌种大规模筛选的工作量，综合评价二者可以较为准确地评价菌种的润滑油生物降解特性。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种利用24孔板筛选润滑油降解菌种的方法。在油水两相体系中，润滑油在无机盐选择性培养基表面形成油膜，油水界面层清晰可见，生物降解作用则主要发生在油水两相间，实验表明，细胞利用润滑油的结果可以使油膜颜色从中间开始逐渐由黄色或近黑色变成乳白色，反之，若油膜未发生改变则认为该菌种不能较好地利用润滑油，即为非目的菌株。该方法的最大优点是操作简单，大幅度地减少了工作负荷。
[0005]实现本发明的进一步描写:
在5-7天的生物降解周期内，润滑油不断被利用，油膜逐渐消退，中心乳白色区域逐渐向边缘扩散，直至整个微孔内除边缘隐约可见润滑油外其它部分颜色完全消失，以此来作为菌种降解润滑油的评价依据 之一。对于降解能力较弱但可以利用润滑油的菌种，在此体系以及生物降解周期内，油膜颜色不消退或仅在中央部分消退，则初步判定该菌种不具备优良的润滑油降解能力。不过，实验过程中发现，该方法可能存在一定实验误差，为此，实验过程中可以平行设置3个以上平行样品参与实验，这样的实验设计不会产生过大的工作负荷。在进行降解能力评价时，对于降解能力良好者以表示，降解能力一般者以表示，降解效果不好，油膜基本不消退者以“ + ”表示，最终的菌种筛选结果则可以根据大规模菌种筛选的总体实验结果进行确定。比如，在某次大规模菌种筛选中，几株菌在降解实验中表现出3个-”，则可以考虑将降解效果低于2个和I个的菌种淘汰；而若出现的3个实验结果的菌种数量少，不能满足工作需要，甚至未出现最佳的实验结果，则可以保留2个和I个的菌种。总之，菌种的最终筛选结果可以根据实验工作需要灵活判定。
[0006]在此实验体系中，另外一个评价菌种降解能力的依据是细胞光密度值。实验表明，在多数情况下，细胞光密度OD6tltl值的变化趋势与油膜的变化趋势一致，即油膜消退意味著生物降解作用的发生，说明菌种具有润滑油降解能力，更多的底物被消耗且其中部分用以合成新细胞，而且，随着油膜的逐渐消退，0D_值逐渐增加。不过，反复的实验验证发现，少部分实验中油膜的消退存在着实验误差，反馈在OD6tltl值上，没有表现出增加的趋势，而且这种现象总是发生在油膜消退实验平行性不好的样本中，此时，应考虑淘汰菌种，或根据实际情况重复实验进行验证，亦可采用定量化检测方法予以验证。
[0007]上述实验可以实施的前提在于，经实验验证，24孔板的每个微孔的最大装液量可以达到3mL，无机盐选择培养基的用量可以控制在2.5mL，利用微量移液器可以有效移取
2.0mL以上的发酵液，利用最为常规的Icm比色杯可以实现细胞浓度的检测。实验证实，利用常规的Icm比色杯进行分光检测时，其最少装液量为1.7mL，高于此装液量检测得到的光密度值结果一致，因此，利用细胞光密度检测可以提高24孔板法筛选评价润滑油降解菌种的准确性。
[0008]【具体实施方式】来自斜面的菌种接种至IOmL富集培养基中，经过液培养至指数生长末期(不需严格控制)时，以1%_2%的接种量转接至新鲜的富集培养基中，在30-37°C，200rpm条件下培养至0D_=1.2 + 0.0`2 `;同时，在灭菌的24孔板内加入2.5mL无机盐选择培养基；取上述制备的种子液200 μ L接种到孔内培养基中，再立即加入300 μ L润滑油；将24孔板置于恒温培养箱中，在30-37°C下培养5-7天，每天观察记录油膜变化情况，待培养结束后用移液器将移液枪头插于培养基底部移取2mL (不得少于1.7mL)发酵液，在600nm波长下利用分光光度计检测细胞密度；根据油膜消退和细胞密度评价菌株对润滑油降解能力。
【权利要求】
1.利用24孔板开发出一种表征微生物降解润滑油能力的方法，来自斜面的菌种经2次LB培养基活化后，控制第二次活化的细胞培养液0D_=1.2±0.02，取ImL次级培养液在6000rpm下离心IOmin,弃上清液后用lmLpH=7.2的磷酸缓冲溶液重悬、洗漆细胞,重复离心、洗涤操作一次后，利用200 μ L的上述磷酸缓冲液制备成静止细胞，将新制备的静止细胞作为接种体接种到含2.5mL无机盐选择培养基的24孔板的微孔内，再向微孔内添加300 μ L润滑油，制备成菌种生物降解体系，每株菌做3个平行的微孔实验，将24孔板置于恒温培养箱中于37°C恒温培养6-8天，每天观察微孔表面油膜变化，以黄色或近黑色油膜中心出现乳白色视为润滑油开始被降解，且中心乳白色区域由内向外逐渐扩展润滑油颜色消退作为优良菌株的判断依据，同时，用微量移液器吸取2mL细胞发酵液利用分光光度计在600nm波长下测其光密度，根据油膜消退和光密度值评价微生物降解润滑油的能力。
2.权利要求1 请求保护的技术方案为菌种降解润滑油能力的评价方法。
【文档编号】C12Q1/04GK103820522SQ201410085920
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】姜岩, 张贤明, 杨颖
申请人:重庆工商大学