用于处理木质纤维素的酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
【专利摘要】本发明提供了具有木质纤维素水解活性，例如，糖基水解酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、P-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、木糖苷酶(例如，P-木糖苷酶)、阿拉伯呋喃糖苷酶和/或葡萄糖氧化酶活性的多肽，编码这些多肽的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽的方法。在一方面，本发明提供了能够酶促处理(水解）甘蔗渣的多肽，即用于甘蔗渣降解或用于生物质处理的多肽，和编码这些酶的多核苷酸以及制备和使用这些多核苷酸和多肽。在一种实施方式中，本发明提供了本发明的热稳定和耐热形式的多肽。本发明的多肽可以用于各种药物、农业和工业环境；例如，本发明提供了多酶系统，其能够水解糖工厂中处理的甘蔗的甘蔗渣成分中的多糖。本发明提供了用于将木质纤维素残余物生物转化成可发酵糖的酶；并且这些糖可以作为化学原料使用，用于生产乙醇和燃料，包括生物燃料如生物乙醇、生物丙醇、生物丁醇和生物柴油。
【专利说明】用于处理木质纤维素的酶、编码它们的核酸及其制备和应 用方法
[0001] 本申请为分案申请，原申请的申请日为2008年01月30日，申请号为 200880010663. 4 (PCT/US2008/052517 )，发明名称为"用于处理木质纤维素的酶、编码它们 的核酸及其制备和应用方法"。
[0002] 参考通讨EFS-WEB提夺的序列表
[0003] 本申请通过USPTO EFS-WEB服务器电子提交，如在MPEP § 1730II. B. 2. (a) (A)所 批准并阐明的，并且该电子提交包括电子提交的序列（SEQ ID)表；该序列表的全部内容通 过引用明确并入本文用于所有目的。序列表根据如下电子提交的.txt文件确定：
【权利要求】
1.分离的、合成的或重组的核酸，其包括： (a)核酸序列（多核苷酸)，其与如下序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、 57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全（100%)的序列同一性 ：SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQ
和/或SEQ ID NO: 720,或其编码酶活性子序列（片段）的核酸， 其中所述核酸(多核苷酸）编码具有木质纤维素酶活性的多肽，或编码能够产生与如 下序列特异性结合的抗体的多肽或肽：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID
SEQ ID NO: 478、SEQ ID NO: 479、在 SEQ ID NO:490 至 SEQ ID NO:700 之间所有偶数编号的 SEQ ID NO:、SEQ ID NO:719和/或SEQ ID NO:721，和/或它们的酶促活性子序列（片段)， 其中所述木质纤维素活性包括糖基转移酶、纤维素酶、纤维素分解活性、内切葡聚糖酶、纤 维二糖水解酶、β_葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β_木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖苷酶活 性， 并且任选地，所述序列同一性通过运用了序列比较算法的分析或通过视觉观察来确 定； 并且任选地，所述序列比较算法包括BLAST版本2. 2. 2的算法，其中过滤设置被设置为 blastall-p blastp-d〃nr pataa〃-F F，并且所有其它的选项被设为默认值； (b) 在严格条件下与（a)的核酸的互补序列杂交的核酸序列（多核苷酸)，其中所述核 酸编码具有木质纤维素活性的多肽，并且所述木质纤维素活性包括糖基转移酶、纤维素酶、 纤维素分解活性、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、β -葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、 β -木糖苷酶或阿拉伯呋喃糖苷酶活性， 并且所述严格条件包括洗涤步骤，所述洗涤步骤包括在0. 2 X SSC中在大约65°C的温 度洗涤大约15分钟； (c) 核酸序列，其编码与以下序列具有至少80%序列同一性的多肽：SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID
之间所有偶数编号的SEQ ID NO:、SEQ ID NO: 719和/或SEQ ID NO: 721，或它们的酶促活 性子序列(片段)，其中所述多肽具有纤维二糖水解酶Π 活性； (d) ，（a)、（b)或（c)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有至少一个保守氨基酸置换并 保持其木质纤维素活性的多肽， 其中任选地，所述保守氨基酸置换包括用相似性质的另一氨基酸置换氨基酸；并且任 选地，保守置换包括：脂肪族氨基酸用另一个脂肪族氨基酸替代；丝氨酸用苏氨酸替代或 相反；酸性残基用另一个酸性残基替代；带有酰胺基的残基用另一个带有酰胺基的残基替 代；碱性残基与另一个碱性残基交换；或芳香族残基用另一个芳香族残基替代； (e) ，（a)、（b)、（c)或（d)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有木质纤维素活性但缺少 信号序列、前原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块（CBM)的多肽， 其中任选地，所述糖结合模块（CBM)包括纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合 模块、甘露聚糖酶结合模块、木葡聚糖特异的模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块，或由 之组成； (f) ，（a)、（b)、（c)、（d)或（e)所述的核酸(多核苷酸)，其编码具有木质纤维素活性的 多肽并进一步包含异源序列； (g) ，（f)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源序列包括这样的序列或由这样的序列 组成，该序列编码：（i)异源信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域 (CD)或它们的组合；（ii)，（i)所述的序列，其中所述异源信号序列、糖结合模块或催化结 构域（CD)从异源木质纤维素酶得到；或（iii)标签、表位、靶向肽、可剪切序列、可检测部分 或酶； (h) ，（g)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源糖结合模块（CBM)包括如下模块或由如 下模块组成：纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木葡 聚糖特异模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块； (i) ，（g)所述的核酸(多核苷酸)，其中所述异源信号序列将所编码的蛋白质靶向液泡、 内质网、叶绿体或淀粉颗粒；或 (」），与仏)、〇3)、（(3)、（(1)、（6)、江)、（0、（11)或（1)完全(全部）互补的核酸序列（多 核苷酸)。
2. 表达盒、载体或克隆载体，其包括含有权利要求1所述的核酸序列的核酸，其中任 选地，所述克隆载体包括病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、细菌噬菌体或人工 染色体，并且任选地，所述病毒载体包括腺病毒载体、反转录病毒载体或腺相关病毒载体， 并且任选地，所述克隆载体包括细菌人工染色体（BAC)、质粒、细菌噬菌体Pl-衍生的载体 (PAC)、酵母人工染色体（YAC)或哺乳动物人工染色体（MAC)。
3. 转化的、感染的、转染的宿主细胞，其包括： (a) 包含权利要求1所述的核酸，或权利要求2所述的载体或克隆载体； (b) ，（a)所述的细胞，其中所述细胞为细菌细胞、哺乳动物细胞、真菌细胞、酵母细胞、 昆虫细胞或植物细胞； (c) ，（b)所述的植物细胞，其中所述植物细胞衍生自下列属的植物：腰果属 (Anacardium)、花生属（Arachis)、天门冬属（Asparagus)、颠爺属（Atropa)、燕麦属 (Avena)、芸苔属（Brassica)、柑橘属（Citrus)、西瓜属（Citrullus)、辣椒属（Capsicum)、 红花属（Carthamus)、椰子属（Cocos)、咖啡属（Coffea)、十字花科（Cruciferae)、黄 瓜属（Cucumis)、南瓜属（Cucurbita)、胡萝卜属（Daucus)、油棕属（Elaeis)、草莓属 (Fragaria)、大豆属（Glycine)、棉属（Gossypium)、向日葵属（Helianthus)、萱草属 (Heterocallis)、大麦属（Hordeum)、天仙子属（Hyoscyamus)、莴苣属（Lactuca)、亚麻 属（Linum)、黑麦草属（Lolium)、羽扇豆属（Lupinus)、番爺属（Lycopersicon)、苹果属 (Malus)、木薯属（Manihot)、薄荷属（Majorana)、苜猜属（Medicago)、烟草属（Nicotiana)、 木犀榄属（Olea)、稻属（Oryza)、黍属（Panieum)、狼尾草属（Pannisetum)、鳄梨属 (Persea)、菜豆属（Phaseolus)、黄连属（Pistachia)、豌豆属（Pisum)、梨属（Pyrus)、李属 (卩；10111118)、萝卜属（1^)1^11118)、菌麻属（1?；[(3；[11118)、黑麦属（360316)、千里光属（36116(3；[〇)、 白芥属（Sinapis)、爺属（Solanum)、高粱属（Sorghum)、可可属（Theobromus)、胡卢巴属 (Trigonella)、小麦属（Triticum)、蚕豆属（Vicia)、葡萄属（Vitis)、紅豆属（Vigna)或黍 属（Zea);或 (d)，（b)所述的植物细胞，其中所述植物细胞源自玉米植物、高粱植物、马铃薯植物、番 茄植物、小麦植物、含油种子植物、油菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物、草或烟草植 物， 并且其中所述转化的细胞产生由权利要求1所述的核酸编码的并具有木质纤维素酶 活性的多肽。
4. 转基因非人动物、植物、植物部分或种子，其包含如权利要求1所述的核酸序列，或 权利要求2所述的载体或克隆载体，其中任选地，所述转基因非人动物为小鼠、大鼠、猪、牛 或羊，其中任选地，所述植物为玉米植物、高粱植物、马铃薯植物、番茄植物、小麦植物、含 油种子植物、油菜籽植物、大豆植物、水稻植物、大麦植物、棕榈、向日葵植物、芝麻植物、水 稻、花生植物、草或烟草植物，所述植物部分或种子是这些植物的植物部分或种子，其中任 选地，所述植物为下列属的植物：腰果属、花生属、天门冬属、颠茄属、燕麦属、芸苔属、柑橘 属、西瓜属、辣椒属、红花属、椰子属、咖啡属、十字花科、黄瓜属、南瓜属、胡萝卜属、油棕属、 草莓属、大豆属、棉属、向日葵属、萱草属、大麦属、天仙子属、莴苣属、亚麻属、黑麦草属、羽 扇豆属、番茄属、苹果属、木薯属、薄荷属、苜蓿属、烟草属、木犀榄属、稻属、黍属、狼尾草属、 鳄梨属、菜豆属、黄连属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、蓖麻属、黑麦属、千里光属、白芥属、茄 属、高粱属、可可属、胡卢巴属、小麦属、蚕豆属、葡萄属、豇豆属或黍属，所述植物部分或种 子是这些植物的植物部分或种子， 并且其中所述转基因非人动物、植物、植物部分或种子的所述转化的细胞产生由权利 要求1所述的核酸编码的并具有纤维二糖水解酶II活性的多肽。
5. 分离的、合成的或重组的多肽，其包含 (a)氨基酸序列，其与如下序列具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、 59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、 78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99% 或更高或完全（100%)的序列同一性：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:477、SEQ ID NO:478、SEQ ID NO:479, SEQ
ID NO:490 至 SEQ ID NO:700 之间所有偶数 编号的SEQ ID NO:、SEQ ID NO: 719和/或SEQ ID NO: 721，或其酶促活性子序列（片段)， 其中所述核酸编码具有木质纤维素活性的多肽， 其中任选地，所述序列同一性通过使用序列比较算法的分析或通过视觉观察确定，并 且任选地，所述序列比较算法是BLAST版本2. 2. 2算法，其中过滤设置被设定为blastall-p blastp-d〃nr pataa〃-F F，并且所有其它选项被设为默认值； (b) 由权利要求1的核酸编码的氨基酸序列，其中所述多肽具有（i)木质纤维素活性， 或（ii)具有免疫原活性，原因是其能够产生与具有序列（a)的多肽特异性结合的抗体，和 /或其酶促活性子序列(片段）； (c) ，（a)或（b)所述的氨基酸序列，包括至少一个氨基酸残基保守置换和保留其木质纤 维素酶活性， (d) ，（c)所述的氨基酸序列，其中所述保守置换包括脂肪族氨基酸用另一个脂肪族氨 基酸替代；丝氨酸用苏氨酸替代或相反；酸性氨基酸用另一个酸性氨基酸替代；带有酰胺 基的残基用另一个带有酰胺基的残基替代；碱性残基与另一个碱性残基交换；或，芳香族 残基用另一个芳香族残基替代；或其组合， 并且任选地，所述脂肪族残基包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或其合成的等效 物；所述酸性残基包括天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等效物；所述包含酰胺基的残基包括 天冬氨酸、谷氨酸或其合成的等效物；所述碱性残基包括赖氨酸、精氨酸或其合成的等效 物；或所述芳香族残基包括苯丙氨酸、酪氨酸或其合成的等效物； (e) ，（a)、（b)、（c)或（d)所述的多肽，其具有木质纤维素活性，但是缺少信号序列、前 原结构域、锚定结构域和/或糖结合模块（CBM)， 其中任选地，所述糖结合模块（CBM)包括如下模块或由之组成：纤维素结合模块、木质 素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木葡聚糖特异模块和/或阿拉伯呋喃糖 苷酶结合模块； (0，（8)、（13)、（(3)、（(1)或（6)所述的多肽，其具有木质纤维素活性，进一步包括异源序 列； (g) ，（f)所述的多肽，其中所述异源序列包括如下部分，或由如下部分组成：（i)异源 信号序列、异源糖结合模块、异源锚定结构域、异源催化结构域（CD)或其组合；（ii)，（ i)所 述的序列，其中所述异源信号序列、糖结合模块或催化结构域（CD)源自异源木质纤维素酶； 和/或（iii)标签、表位、靶向肽、可剪切序列、可检测部分或酶； (h) ，（g)所述的多肽，其中所述异源糖结合模块（CBM)包括如下模块或由如下模块组 成：纤维素结合模块、木质素结合模块、木糖结合模块、甘露聚糖酶结合模块、木葡聚糖特异 模块和/或阿拉伯呋喃糖苷酶结合模块；或 (i) ，（a)至（g)任一项所述的多肽，其中所述多肽包括至少一个糖基化位点，和任选地 所述糖基化是N-连接的糖基化。
6.分离的、合成的或重组的多肽，其具有如下氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、 SEQ ID N0:6,SEQ ID N0:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ
SEQ ID NO: 477、SEQ ID NO: 478、SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO:490 至 SEQ ID NO:700 之间所 有偶数编号的 SEQ ID NO:、SEQ ID NO: 719和 /或 SEQ ID NO: 721。
7.权利要求6所述的多肽，其具有木质纤维素酶活性、信号序列和糖结合模块。
8. 产生重组多肽的方法，其包括： (A) ，（a)提供核酸，其中所述核酸包含权利要求1中所述的核酸序列；和 (b)在允许所述多肽表达的条件下表达步骤（a)所述的核酸，由此产生重组多肽；或 (B) ，（A)所述的方法，其中所述方法进一步包括用步骤（a)所述的核酸转化宿主细胞， 接着表达步骤（a)所述的核酸，由此在转化细胞中产生重组多肽；或 (C) ，（A)或（B)所述的方法，其中所述启动子是如下启动子或包括如下启动子：病毒、 真菌、细菌、哺乳动物或植物启动子；或，植物启动子；或，马铃薯、水稻、玉米、小麦、烟草或 大麦启动子；或，组成型启动子或CaMV35S启动子；或，诱导型启动子；或，组织特异的启动 子或环境调节的或发育调节的启动子；或，种子特异的、叶特异的、根特异的、茎特异的或脱 落诱导的启动子；或，种子优选的启动子、玉米Y玉米醇溶蛋白启动子或玉米ADP-gpp启动 子。
9. 产生编码具有木质纤维素活性的多肽的核酸变体的方法，其包括以下步骤： (I) (a)提供包含权利要求1所述的核酸序列的模板核酸；和 (b)在该模板序列中修饰、缺失或添加一个或多个核苷酸，或进行修饰、缺失和添加的 组合，以产生所述模板核酸的变体， 其中任选地，所述方法进一步包括表达所述变体核酸，以产生具有木质纤维素活性的 变体多肽， 并且任选地，所述的修饰、添加或缺失通过包括如下方法中的方法来引入：易错PCR、 改组、寡核苷酸诱导的定向诱变、装配PCR、有性PCR诱变、体内诱变、盒式诱变、递归整体诱 变、指数整体诱变、位点特异性诱变、基因再装配、基因位点饱和诱变（GSSM)、合成连接重装 配（SLR)、重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、缺口双链 体诱变、点错配修复诱变、修复缺陷型宿主株诱变、化学诱变、放射诱变、缺失诱变、限制选 择诱变、限制纯化诱变、人工基因合成、整体诱变、嵌合核酸多聚体生成及其组合， 并且任选地，所述方法被迭代重复，直到产生与所述模板核酸编码的多肽相比具有改 变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的木质纤维素酶；或 (II) ，（I)所述的方法，其中由所述变体核酸编码的所述多肽：（a)是耐热的，且在暴露 于增高的温度之后仍保持一些活性；（b)与模板核酸编码的木质纤维素酶相比，具有增加 的糖基化；或，（c)在高温下具有纤维二糖水解酶II活性，其中由所述模板核酸编码的木质 纤维素酶在所述高温下不具有活性。。
10. 在编码木质纤维素酶的核酸中修饰密码子的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 提供编码具有木质纤维素酶活性的多肽的核酸，所述核酸包含权利要求1所述的 核酸序列；和 (b) 鉴定步骤（a)所述核酸中的密码子，并用与被替代密码子编码相同氨基酸的不同 密码子替换它，由此修饰编码木质纤维素酶的核酸中的密码子。
11. 嵌合多肽，其含有 (a)，至少第一结构域和至少第二结构域，所述至少第一结构域含有权利要求5的多肽 的氨基末端残基1至12、1至13、1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、 1 至 21、1 至 22、1 至 23、1 至 24、1 至 25、1 至 26、1 至 27、1 至 28、1 至 28、1 至 30、1 至 31、1 至 32、1 至 33、1 至 34、1 至 35、1 至 36、1 至 37、1 至 38、1 至 40、1 至 41、1 至 42、1 至 43 或 1至44所述的信号序列(信号肽（SP))或前导序列，所述至少第二结构域含有异源的多肽或 肽，其中所述异源多肽或肽与所述信号肽（SP)或前导序列不是天然相连的， 并且任选地，所述异源多肽或肽不是纤维二糖水解酶II酶，并且任选地，所述异源多 肽或肽在所述信号肽（SP)或前导序列的氨基端、羧基端或两端； (b) ，第一结构域和至少第二结构域，其中所述第一结构域包括权利要求5的多肽，所 述第二结构域包括一个异源或修饰的糖结合结构域（CBM)、至少一个内部重排的CBM、异源 的或修饰的锚定结构域、异源的或修饰的前原结构域、或异源的或修饰的活性位点； (c) ，（b)所述的嵌合多肽，其中所述异源的或修饰的或内部重排的CBM包括如下或由 如下组成：CBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、 CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、 CBM_16或来自CBM_1至CBM_48的CMB家族的任何CBM ;糖基水解酶结合结构域；如在表5 或表6中所述的CBM ;或它们的任何组合； (d) ，（b)或（c)所述的嵌合多肽，其中所述糖结合结构域（CBM)包括纤维素-结合模块 或木质素-结合结构域； (e) ，（b)、（c)或（d)所述的嵌合多肽，其中所述至少一个CBM在位置上靠近所述多肽 的催化结构域； (f) ，（e)所述的嵌合多肽，其中所述至少一个CBM被如下定位：靠近所述多肽的催化结 构域的C-末端，或，靠近所述多肽的催化结构域的N-末端，或者靠近所述多肽的催化结构 域的两端；或 (g) ，（a)、（b)、（c)、（d)、（e)或（f)所述的嵌合多肽，其中所述嵌合多肽是重组嵌合蛋 白质。
12.组合物或制造产物，包括 (a) 木质纤维素酶的混合物(或"鸡尾酒")，其包含（i)每种内切葡聚糖酶、纤维二糖水 解酶I (CBH I)、纤维二糖水解酶II (CBH II)和β-葡糖苷酶的至少一种；（ii)每种木聚糖 酶、β -木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的至少一种；或，（iii)，（i)或（ii)的至少一种的组 合；其中（a)的所述混合物包括至少一种权利要求5所述的酶； (b) 半纤维素-水解酶和纤维素-水解酶的混合物(或"鸡尾酒")，包括（i )每种内切葡 聚糖酶、木质纤维素酶、纤维二糖水解酶I (CBH I)、纤维二糖水解酶II (CBH II)、阿拉伯呋 喃糖苷酶和木聚糖酶中的至少一种；（ii)，（ i)所述的混合物，其中所述葡萄糖氧化酶是葡 萄糖氧化酶-1或β -葡糖苷酶；或（i i i )，（ i )或（i i )的混合物，其中所述葡萄糖氧化酶是 葡萄糖氧化酶-2或β -木糖苷酶；其中（b)所述的混合物包括至少一种权利要求5所述的 酶； (c) 半纤维素-水解酶和纤维素-水解酶的混合物(或"鸡尾酒")，包括：每种内切葡聚 糖酶；纤维二糖水解酶I (CBH I);纤维二糖水解酶II (CBH II);阿拉伯呋喃糖苷酶；木聚糖 酶；葡萄糖氧化酶-1 ( β -葡糖苷酶）;和葡萄糖氧化酶-2或β -木糖苷酶的至少一种；其 中（c)所述的混合物包括至少一种权利要求5所述的酶； (d) 酶混合物(或"鸡尾酒")，包括：（1)内切葡聚糖酶，其切割内部的β -1，4键，产生更 短的葡糖寡糖，（2)纤维二糖水解酶，其以"外切"方式作用，向前释放纤维二糖单位（β-1，4 葡萄糖-葡萄糖二糖)，和（3) β -葡糖苷酶，用于从短的纤维寡糖(例如，纤维二糖）释放葡 萄糖单体；其中（d)所述的混合物包括至少一种权利要求5所述的酶； (e) 酶混合物(或"鸡尾酒")，包括如表4中所述的酶的组合； (f) ，（a)至（e)任一项所述的组合物或制造产物，其中，内切葡聚糖酶包括SEQ ID NO: 4,纤维二糖水解酶 I 包括 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 30 或 SEQ ID NO: 356,纤维二糖 水解酶Π 包括SEQ ID NO: 282，β-葡糖苷酶包括SEQ ID NO: 124,木聚糖酶包括SEQ ID NO: 262,或其任何组合，或 (g) ，（a)至（f)任一项所述的组合物或制造产物，其中至少一种酶包括额外的糖结合结 构域（CBM)。
13. 酶混合物或鸡尾酒，其包括 (a) 权利要求5所述的多肽，权利要求1所述的核酸编码的多肽，或权利要求11所述的 嵌合多肽； (b) 如表4中所述的酶组合； (c) (i)每种内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I (CBH I)、纤维二糖水解酶II (CBH II) 和β-葡糖苷酶的至少一种；（ii)每种木聚糖酶、β-木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的至 少一种；或（iii)，（i)或（ii)的至少一种的组合；其中所述混合物包括至少一种权利要求 5所述酶； (d) 酶混合物(或鸡尾酒)，包括半纤维素和纤维素水解酶，其中所述纤维素水解酶包括 至少一种葡萄糖氧化酶、内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II和β -葡糖 苷酶；所述半纤维素水解酶包括至少一种木聚糖酶、β -木糖苷酶和阿拉伯呋喃糖苷酶；其 中（d)所述的混合物包括至少一种权利要求5所述的多肽； (e) 至少一种半纤维素水解酶和/或纤维素水解酶，包括（i)每种内切葡聚糖酶、葡萄 糖氧化酶、纤维二糖水解酶I (CBH I)、纤维二糖水解酶II (CBH II)、阿拉伯呋喃糖苷酶和木 聚糖酶的至少一种；（ii)，（ i)所述的混合物，其中所述葡萄糖氧化酶是葡萄糖氧化酶-1或 β -葡糖苷酶；和/或（iii)，（ i)或（ii)所述的混合物，其中所述葡萄糖氧化酶是葡萄糖氧 化酶-2或β -木糖苷酶；其中所述混合物包括至少一种权利要求5所述的酶； (f) 至少一种半纤维素水解酶和/或纤维素水解酶，包括：每种内切葡聚糖酶；纤维二 糖水解酶I (CBH I);纤维二糖水解酶II (CBH II);阿拉伯呋喃糖苷酶；木聚糖酶；葡萄糖氧 化酶-1 ( β -葡糖苷酶);和/或葡萄糖氧化酶-2或β -木糖苷中的至少一种；其中（f)所 述的混合物包括至少一种权利要求5所述的酶； (g) 至少一种（1)内切葡聚糖酶，其切割内部的β-1，4键，产生更短的葡糖寡糖，（2) 纤维二糖水解酶，其以"外切"方式作用，向前释放纤维二糖单位（β_1，4葡萄糖-葡萄糖二 糖)，和/或（3) β -葡糖苷酶，用于从短的纤维寡糖(例如，纤维二糖）释放葡萄糖单体；其 中（g)所述的混合物包括至少一种权利要求5所述的酶。
14. 用于水解、分解或破坏纤维寡糖、阿拉伯木聚糖寡聚体，或含木质纤维素、木质素或 纤维素组合物的方法，所述方法包括以下步骤： (A)，（a)提供如权利要求5所述的多肽，或由权利要求1所述核酸编码的多肽，权利要 求11所述的嵌合多肽，或权利要求12所述的组合物或制造产物，或权利要求13所述的酶 混合物或鸡尾酒； (b)提供包含木质纤维素、木质素和/或纤维素的组合物；和 (C)使步骤（a)的多肽与步骤（b)的组合物在其中纤维二糖水解酶II酶水解、分解或 破坏所述含木质素、纤维寡糖或纤维素的组合物的条件下接触； (B) ，（A)所述的方法，其中所述组合物包括植物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或 动物细胞， (C) ，（A)或（B)所述的方法，其中（A) (a)的所述多肽是重组多肽； (D) ，（C)所述的方法，其中所述重组多肽作为待水解的含木质纤维素、木质素或纤维素 组合物内的异源重组多肽被产生； (E) ，（C)所述的方法，其中所述重组多肽通过在细菌、酵母、植物、昆虫、真菌和动物中 表达编码所述重组多肽的异源多核苷酸来产生，并且任选地，所述生物体选自里氏木霉、粟 酒裂殖酵母、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌、链霉菌属某种、杆菌属某种和乳酸杆菌 属某种；或 (F) ，（A)至（E)所述的方法，其中所述含木质纤维素、木质素或纤维素组合物包括：单 子叶植物或双子叶植物或植物产物；或，单子叶玉米、甘蔗、水稻、小麦、大麦、柳枝稷或芒属 植物；或双子叶含油种子作物、大豆、油菜、油菜籽、亚麻、棉花、棕榈油、甜菜、花生、树木、白 杨或羽扇豆。
15. 制备燃料的方法，包括 (A) ，将包含纤维寡糖、木质素、木质纤维素、纤维素或可发酵糖的组合物与权利要求5 所述的多肽、或由权利要求1所述核酸编码的多肽，权利要求11所述的嵌合多肽，或权利要 求12所述的组合物或制造产物，或权利要求13所述的酶混合物或鸡尾酒接触； (B) ，（A)所述的方法，其中所述包含纤维寡糖、木质素、木质纤维素、纤维素或可发酵糖 的组合物包括植物、植物产物或植物衍生物； (C) ，（A)或（B)所述的方法，其中所述植物或植物产物包括甘蔗植物或植物产物、甜菜 或甜菜、小麦、玉米、大豆、马铃薯、水稻或大麦； (D) ，（C)所述的方法，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，或所述植物是单子 叶玉米、甘蔗、水稻、小麦、大麦、柳枝稷或芒属植物；或所述植物是双子叶含油种子作物、大 豆、油菜、油菜籽、亚麻、棉花、棕榈油、甜菜、花生、树木、白杨或羽扇豆； (E) ，（A)、（B)、（C)或（D)所述的方法，进一步包括处理或配制作为液体和/或气体的所 述燃料，其中任选地，所述燃料包括生物燃料和/或合成燃料，或所述燃料包括生物乙醇、 生物甲醇、生物丙醇或生物丁醇；和/或汽油-乙醇、甲醇、丁醇和/或丙醇混合物。
16. 处理生物质材料的方法，包括将生物质材料与权利要求5所述的多肽，或由权利要 求1所述核酸编码的多肽，权利要求11所述的嵌合多肽，权利要求12所述的组合物或制造 产物或权利要求13所述的酶混合物或鸡尾酒接触， 其中任选地，所述生物质材料来源于农作物，是食品或饲料生产的副产品，是木质纤维 素废品，或是植物材料，加工的植物副产品或残渣或废纸或废纸产品， 并且任选地，所述植物材料或植物残渣包括甘蔗渣、茎、叶、皮、壳、玉米或玉米穗、玉米 秸杆、干草、秸杆、木材、木片、木浆、废纸、木材废料和锯屑， 并且任选地，所述废纸包括丢弃的或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本 纸、打字机纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料， 并且任选地,进一步包括处理所述生物质材料以产生生物醇、生物乙醇、生物甲醇、生 物丁醇或生物丙醇。
17. 分离的、合成的和/或重组的糖结合结构域-模块（CBM)，其包括如下或由如下组 成 a. 糖结合结构域模块（CBM)基序，所述糖结合结构域模块（CBM)基序包括权利要求5 所述多肽的子序列或由权利要求1所述核酸编码的多肽，或由权利要求5所述多肽的子序 列或由权利要求1或权利要求5所述核酸编码的多肽组成，其中所述糖结合结构域-模块 (CBM)包括 CBM_1、CBM_2、CBM_2a、CBM_2b、CBM_3、CBM_3a、CBM_3b、CBM_3c、CBM_4、CBM_5、 CBM_5_12、CBM_6、CBM_7、CBM_8、CBM_9、CBM_10、CBM_11、CBM_12、CBM_13、CBM_14、CBM_15、 CBM_16或来自CBM_1至CBM_48的CMB家族的任何CBM，或由之组成； b. 至少一个如表5和序列表中所述的糖结合结构域-模块（CBM); c. 至少一个如表6和序列表中所述的糖结合结构域-模块（CBM)或； d. 它们的组合。
18. 组合物，包括权利要求5所述的多肽，或权利要求1所述的核酸编码的多肽，权利要 求11所述的嵌合多肽，权利要求12所述的组合物或制造产物，或权利要求13所述的酶混 合物或鸡尾酒，其中任选地，所述组合物是药物组合物、洗涤剂组合物、隐形眼镜溶液、水处 理组合物、消毒剂、生物防御或生物解毒剂，或其中任选地所述组合物是燃料，其中任选地 所述组合物是醇类，其中任选地所述醇类是乙醇，或其中任选地所述组合物是生物质或生 物质材料、纸、废纸、再循环纸制品、纸浆、纸制品、木材、木制品、木浆、木材废料、纺织品、织 物、纱线或纤维,或其中任选地所述组合物是纤维素或纤维素衍生物组合物,或其中任选地 所述组合物是饮料、食品、饲料、食品或饲料补充剂、乳制品或营养补充剂、饮食补充剂、可 食用的酶输送基质或丸剂，或其中任选地所述食品是面团、面包或焙烤产品，或其中任选地 所述生物质材料衍生自农作物，或所述生物质材料是食品或饲料生产的副产品，或所述生 物质材料是废品，或所述生物质材料是植物残渣或废纸或废纸制品，或所述生物质材料包 括植物残渣，和任选地所述植物残渣包括茎、叶、壳、甘蔗、甘蔗渣、皮、玉米穗、玉米秸杆、干 草、木材、木片、木浆和/或锯屑，和任选地所述废纸包括废弃或用过的复印纸、计算机打印 纸、笔记本纸、记事本纸、打字机用纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料。
19. 处理或修饰组合物的方法，包括将所述组合物与权利要求5所述的多肽，或权利要 求1所述的核酸编码的多肽，权利要求11所述的嵌合多肽，权利要求12所述的组合物或制 造产物，或权利要求13所述的酶混合物或鸡尾酒接触，其中任选地，所述组合物是药物组 合物、洗涤剂组合物、隐形眼镜溶液、水处理组合物、消毒剂、生物防御或生物解毒剂，或其 中任选地所述组合物是燃料，其中任选地所述组合物是醇类，其中任选地所述醇类是乙醇， 或其中任选地所述组合物是生物质或生物质材料、纸、废纸、再循环纸制品、纸浆、纸制品、 木材、木制品、木浆、木材废料、甘蔗、甘蔗渣、纺织品、织物、纱线或纤维，或其中任选地所述 组合物是纤维素或纤维素衍生物组合物，或其中任选地所述组合物是饮料、食品、饲料、食 品或饲料补充剂、乳制品或营养补充剂、饮食补充剂、可食用的酶输送基质或丸剂，或其中 任选地所述食品是面团、面包或焙烤产品，或其中任选地所述生物质材料衍生自农作物，或 所述生物质材料是食品或饲料生产的副产品，或所述生物质材料是废品，或所述生物质材 料是植物残渣或废纸或废纸制品，或所述生物质材料包括植物残渣，和任选地所述植物残 渣包括茎、叶、壳、皮、玉米穗、玉米秸杆、干草、木材、木片、木浆和/或锯屑、甘蔗、甘蔗渣， 和任选地所述废纸包括废弃或用过的复印纸、计算机打印纸、笔记本纸、记事本纸、打字机 用纸、报纸、杂志、纸板和基于纸的包装材料。
【文档编号】C12P7/10GK104212822SQ201410085996
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2008年1月30日 优先权日:2007年1月30日
【发明者】J·T·斯特格, C·常, N·阿伯沙迪, G·乔尔杰维奇, E·伯克, P·卢京比尔, M·戴塞库, T·理查德松, J·波伦, Y·黑夫纳, S·M·米勒斯 申请人:Bp法人北美有限公司, 先正达公司