专利名称：一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及多环芳烃(PAHs)污染物的修复技术，具体地说是一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂。
背景技术：
常规环境修复技术主要指化学修复法、物理修复法、生态修复法和生物修复法，后两者常被归为统一的技术，工程上一般采取原位方式。对于多环芳烃污染土壤生物修复技术已有很多研究，其优点是①费用省，其费用约为焚烧处理费用的1/4-1/3。②环境影响小，生物修复只是一个自然过程的强化，其最终产物是二氧化碳、水和脂肪酸等，不形成二次污染或导致污染物转移。③可以最大限度地降低污染物浓度等。且能改良土壤，提高地力，因此具有广泛的应用和发展前景。应用微生物来治理环境污染的研究越来越受到世界各国的重视，我国自20世纪90年代开始，针对石油及多环芳烃污染土壤生物修复技术开展了大量研究，从理论和应用均取得了显著的研究成果，但目前仍没有实用规模的成熟的生物处理技术。我国有大量污染农田土壤需要修复，特别急需农田PAHs污染土壤的生物修复技术。沈阳抚顺属于老工业化的城市，30-40年的石油污水灌溉使土壤积累了大量的PAHs，由于低环组分易于挥发、降解，而中高环部分的自然降解能力相对较低，因此土壤中更多地积累了 PAHs高环组分，其中PAHs含量按环数排列4环>5环>3环>6环>2环，4环、5环、6环占PAHs总量的79. 76%，属于老化的石油源污染土壤。对于这种大面积的污染土壤必须采用原位修复技术，而微生物的降解是去除PAHs的主要途径。如何筛选高效的降解菌，有效发挥微生物的活性是生物修复技术的关键
发明内容
本发明的目的是提供一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂由土著混合菌组成，所述土著混合菌为假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )B08、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)BM、芽抱杆菌(Bacillussp. )BYB、芽抱杆菌(Bacillus sp. )B07、苍白杆菌(Ochrobactrum sp. )ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.) BGDS 和分枝杆菌(Mycobacterium sp.) BFZG ；上述菌株已于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号分别为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.) B08 (保藏编号CCTCC M 2011082)、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)BM(保藏编号 CCTCC M 2011085)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)BYB(保藏编号 CCTCC M 2011086)、芽孢杆菌(Bacillus sp.) B07 (保藏编号 CCTCC M 2011081)、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)ZHL-4(保藏编号CCTCC M 2011087)、戈登氏菌(Gordonia sp.)B⑶S (保藏编号 CCTCC M 2011084)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.) BFZG (保藏编号 CCTCCM 2011083)。
将土壤样品经过含PAHs污染物的富集培养基的富集培养，再以PAHs污染物为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、筛选获得，即得到所述以PAHs污染物为唯一碳源的土著混合菌剂。所述富集培养基按重量百分比计为葡萄糖O. 1%、蛋白胨O. 1%、酵母膏O. 1%,NaCl O. 5%, NH4NO3 O. I %, K2HPO4 O. 5%, MgSO4 · 7Η200· 05 %、余量为自来水，ρΗ7· 2 ;所述的无机盐培养基按重量百分比计为=NaCl O. 01%,NH4NO3 O. 5%, K2HPO4 O. 5%,MgSO4 ·7Η20
O.05%,ρΗ7. 2。所述富集培养基和无机盐培养基中菲、芘和苯并(a)芘3种污染物总量的浓度均为180 ZSOmgL'将混合菌剂按5_10 (质量)％的接种量投加到污染土壤或水体中。本发明所具有的优点 I本发明的混合菌剂经过含PAHs污染物的富集培养基的富集培养；再以PAHs污染物为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、筛选获得。其生长、繁殖能力及适应性较强。2本发明的菌剂是由土著混合菌组成，保持原微生物种群结构，有利于提高微生物的活性和生物量。3本发明的菌剂降解率高，采用本发明的菌剂当PAHs初始浓度为180. .时，培养9天后其降解率可达91.21%。
图I为本发明实施例提供的菌剂中假单胞杆菌(Pseudomonassp. )B08革氏染色和鞭毛染色效果图。图2为本发明实施例提供的菌剂中假单胞杆菌(Pseudomonassp. )BM菌落形态图。图3为本发明实施例提供的菌剂中芽孢杆菌(Bacillus sp.)BYB的革氏染色和鞭毛染色效果图。图4为本发明实施例提供的菌剂中芽孢杆菌(Bacillus sp.)B07的革氏染色效果图。图5为本发明实施例提供的菌剂中苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)ZHL4的革氏染色和鞭毛染色的效果图。图6为本发明实施例提供的菌剂中戈登氏菌(Gordonia sp. )B⑶S的菌落形态图。图7为本发明实施例提供的菌剂中分枝杆菌(Mycobacteriumsp. )BFZG的菌落形态图。图8为本发明实施例提供的PAHs总量为180. 67mg/l时，混合菌剂对菲、芘和苯并(a)芘的降解效果图。图9为本发明实施例提供的PAHs总量为232. 88mg/l时，混合菌剂对菲、芘和苯并(a)芘的降解效果图。
具体实施例方式实施例I7株高效降解菌的筛选菌液的制备在90ml含有PAHs污染物的富集培养基中，加入IOg污灌区(抚顺市三宝屯北后屯耕层土壤)老化的PAHs污染土壤,于120rpm/min恒温(30°C )摇床中振荡培养7d，待用。所述含有PAHs污染物的富集培养基为将2. 5ml PAHs溶液加入到无菌的500ml三角瓶中，使富集培养基中多环芳烃总量浓度为200mg/L ;待溶剂挥发完后，再将分装好的90ml无菌富集培养基倒入三角瓶中。所述富集培养基按重量百分比计为葡萄糖O. I %、蛋白胨 O. 1%、酵母膏 O. l%、NaCl O. 5%, NH4NO3 0.1%, K2HPO4 O. 5%,MgSO4 · 7H20 O. 05%,余量为自来水，pH7. 2。灭菌条件为0. IMpa湿热灭菌30min。而后按10%接种量将上述种液转接到30ml无机盐培养基的150ml三角瓶中，该培养基中PAHs总量浓度为200mg/L。于28°C，120rpm/min条件下进行驯化培养5d。以此重复三次上述富集培养和驯化培养，即得到以PAHs为唯一碳源的菌株作为微生物的混合菌剂。所述无机盐培养基按重量百分比计为NaCl O. 01 NH4NO3 0.5%, K2HPO4
0.5%,MgSO4 · 7H20 O. 05%、pH7. 2。灭菌条件为0. IMpa 湿热灭菌 30min。 所述菌株为高效降解菌，分别为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)B08、假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )BM、芽抱杆菌(Bacillus sp. )BYB、芽抱杆菌(Bacillus sp.)B07、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.) ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.) BGDS 和分枝杆菌(Mycobacteriumsp.) BFZG (参见图 1-7)。上述菌株已于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号分别为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.) B08 (保藏编号CCTCC M 2011082)、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)BM(保藏编号 CCTCC M 2011085)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)BYB(保藏编号 CCTCC M 2011086)、芽孢杆菌(Bacillus sp.) B07 (保藏编号 CCTCC M 2011081)、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)ZHL-4(保藏编号CCTCC M 2011087)、戈登氏菌(Gordonia sp.)B⑶S (保藏编号 CCTCC M 2011084)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.) BFZG (保藏编号 CCTCCM 2011083)。各菌株的形态分别为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)的菌株B08菌体形态为细胞短杆状,革兰氏染色阴性，无芽孢，极生鞭毛。好氧。生长最适温度28_30°C。假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)的菌株BM菌体形态为细胞杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢，极生鞭毛，好氧。最适温度28-30°C。芽孢杆菌(Bacillus sp.)的菌株BYB菌体形态为革兰氏染色阳性杆菌,末端圆，单个或呈短链排列，直径为I. 2 I. 5X2. O 4. O微米，能运动。周生鞭毛，好氧。芽孢为
1.O I. 2X1. 5 2. O微米，椭圆形，中生或次端生。最适温度28-30°C。芽孢杆菌(Bacillus sp.)的菌株B07菌体形态为革兰氏染色阳性杆菌，周生鞭毛，单个或呈短链排列，直径为I. O I. 2X2. O 3. O微米，好氧。芽孢中生或次端生。苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)的菌株ZHL-4菌体形态为细胞为短杆状,革兰氏染色呈阴性，无芽孢，菌体的大小为0.2 0.4 μ mX 0.4 I. I μ m。在固体培养基表面，菌体形成不透明的浅黄色小菌落，菌落干，边缘不整齐。最适温度28-30°C。戈登氏菌属(Gordonia sp.)的菌株B⑶S菌体形态为革兰氏染色阳性杆菌,无芽孢，无鞭毛，不抗酸，好氧。最适温度28_30°C。分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)的菌株BFZG菌体形态为革兰氏染色阳性杆菌，无芽孢，无鞭毛，抗酸染色阳性，好氧。生长较慢，最适温度28-30°C以上7种菌最适生长及最佳降解温度为28°C -30°C，在低于10°C或高于40°C时生长缓慢；最适生长PH值为7-7. 5，当pH值低于5或高于10时，其生长受到明显抑制。实施例2将上述以PAHs为唯一碳源的菌液按10%接种量，接入到富集培养基中进行扩大培养，即获得降解PAHs的微生物混合菌剂，保存备用。而后进行混合菌剂对PAHs降解能力实验，每个处理3个重复。在无机盐液体培养基中进行。无机盐培养基调节其PH为7. O，分装于150ml三角瓶中，每瓶30ml，装瓶后高压灭菌30min，冷却后，每瓶投加上述混合菌剂1.5ml (5%的接种量)；投加菲、芘和苯并(a)芘溶液。每种污染物初始浓度(实测值)分别为-J2. 84mg/l、67. 49mg/l和40. 34mg/l,3种污染物总量为180. 67mg/l。130转/min，保持28°C。振荡培养9天后，测定3种污染物的残留浓度。用二氯甲烷萃取培养基中残留污染物3次，合并提取液，提取液过无水硫酸钠柱 后定容至25ml。取过膜(0.2um的有机膜)后的提取液，放入样品瓶中，氮气吹干后用色谱纯甲醇定容，用HPLC测定。经过9天降解后各处理中PAHs残留浓度测定结果见表1，其降解率见图8。由图8看出当PAHs初始浓度为180. 6711^171时，培养9天后PAHs总量降解率可达91. 21%。对3、4环的菲和芘去除率均90%以上，即使对5环难降解的BaP也有81. 06%降解率。说明本发明混合菌剂对PAH s污染物的生物修复具有很好的应用前景。所述无机盐培养基成分(% ) =NaCl O. 01 ；NH4NO3 O. I ；CaCl2 O. 01 ；MgS04. 7Η200· 02 ；FeCl3 O. 002 ；KH2PO4 O. I ；K2HPO4 O. 1，水 100ml，ρΗ7· 2。
表I混合菌剂降解PAHs残留浓度比较(mg · I/1)
处理__法 Bap 总量72. 84~67. 49~40. 34~180. 67
对照 62.63 65. 41 38.47 166.50
混合菌剂 1.51 6. 74 7. 64 15. 88实施例3将上述菌剂从冰箱中取出放置至室温，进行活化。所述活化即在无菌条件下，按10%接种至已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中，130转/min，28°C振荡培养2_3d。实验采用摇瓶液体培养法进行。每个处理设3个重复。在无菌条件下，吸取O. 60mlPAHs溶液置于已灭菌的150ml空三角瓶中，盖上通气的高温塑料膜，通风至近干，再加入O. 5ml丙酮，通过振摇将污染物溶解，通风至少量，加入已灭菌的30ml无机盐培养基。在30ml培养基中接种3ml菌剂(10%的接种量)，130转/min，28°C震荡培养10天。所述PAHs溶液为菲、花和苯并(a)花混合液,菲、花浓度为4mg/ml,苯并[a]花为2mg/ml，3种污染物浓度总量约为10mg/ml，溶剂为二氯甲烷。样品预处理采用二氯甲烷萃取，在三角瓶中加入二氯甲烷10ml，盖上密封塑料膜，180转/min振荡5min,静止分层后，下层(二氯甲烧层)放入装有无水Na2SO4漏斗中，过滤到25ml比色管中。上层再萃取两次，步骤同上，最后定容至25. 0ml，取2ml过O. 22um有机膜。准确吸取过膜后的液体40ul置于样品瓶中，自然挥发近干后，用过膜的色谱纯甲醇定容至1ml，用高效液相色谱仪测定。分析培养液中污染物的残留浓度，根据初始投加量的减少，计算去除率。研究结果见表2和图9。结果表明，当菲、芘和苯并[a]芘初始浓度为 94. 36mg/ml、95. 61mg/ml 和 42. 91mg/ml 时，10 天后去除率分别为 89. 85%,89. 76%和81. 08%。不投加混合菌剂的对照去除率分别为31. 13%,27. 15%和13. 59%。实验结果表明混合菌剂有非常明显的去除效果。表2混合菌剂降解PAHs残留浓度比较(mg · Γ1)
权利要求
1.一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂，其特征在干由土著混合菌组成，所述土著混合菌为假单胞杆菌(Pseudomonas sp. )B08、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)BM、芽孢杆菌(Bacillus sp.)BYB、芽抱杆菌(Bacillus sp. )B07、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.)BGDS 和分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)BFZG ; 上述菌株已于2011年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号分别为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.) B08 (保藏编号CCTCC M 2011082)、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)BM(保藏编号 CCTCC M 2011085)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)BYB(保藏编号 CCTCC M 2011086)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)B07 (保藏编号 CCTCC M 2011081)、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)ZHL-4(保藏编号 CCTCC M 2011087)、戈登氏菌(Gordonia sp.)B⑶S(保藏编号CCTCC M 2011084)和分枝杆菌(Mycobacterium sp.)BFZG(保藏编号CCTCCM 2011083)。
2.按权利要求I所述的降解多环芳烃污染物的混合菌剂，其特征在于将土壤样品经过含PAHs污染物的富集培养基的富集培养，再以PAHs污染物为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养、筛选获得，即得到所述以PAHs污染物为唯一碳源的土著混合菌剂。
3.按权利要求2所述的降解多环芳烃污染物的混合菌剂，其特征在于所述富集培养基按重量百分比计为葡萄糖0. I %、蛋白胨0. I %、酵母膏0. I %、NaCl 0.5%、NH4NO30.I %, K2HPO4 0. 5%, MgSO4 7H200. 05 %、余量为自来水，pH7. 2 ;所述的无机盐培养基按重量百分比计为NaCl 0. 01%, NH4NO3 0. 5%, K2HPO4 0. 5%,MgSO4 7H20 0.05%、pH7.2。
4.按权利要求2所述的降解多环芳烃污染物的混合菌剂，其特征在于所述富集培养基和无机盐培养基中菲、芘和苯并(a)芘3种污染物总量的浓度均为180 2501^1^。
5.按权利要求I所述的降解多环芳烃污染物的混合菌剂，其特征在于将混合菌剂按5-10 (质量)％的接种量投加到污染土壌或水体中。
全文摘要
本发明涉及多环芳烃(PAHs)污染物的修复技术，具体地说是一种降解多环芳烃污染物的混合菌剂。由土著混合菌组成，所述土著混合菌为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)B08、假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)BM、芽孢杆菌(Bacillus sp.)BYB、芽孢杆菌(Bacillus sp.)B07、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)ZHL4、戈登氏菌(Gordonia sp.)BGDS和分枝杆菌(Mycobacterium sp.)BFZG；采用本发明菌剂可按5-10％的接种量投加，当PAHs初始浓度为180.67mgL-1时，处理9天后PAHs总量降解率可达91.21％。
文档编号C12N1/20GK102776135SQ20111012828
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者刘宛, 台培东, 巩宗强, 张春桂, 张海荣, 李晓军 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所