一种发酵植物甾醇生产a环降解物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，包括以下步骤：A)制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂；B)发酵培养；C)分离提取；从而制得A环降解物。本发明发酵制备A环降解物的方法，转化为无油条件，有效的抑制了A环，B环开环，进而抑制了其降解，提高了收率，重量收率可达到35～40％。
【专利说明】一种发酵植物留醇生产A环降解物的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种留体激素重要中间体的制备方法，具体涉及一种发酵植物留醇生 产A环降解物的方法。
【背景技术】
[0002] 近代，有关使用微生物法转化植物留醇制备留体中间体的研究成果被广泛报道 和研究，相关报道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone在他们发表的两篇专利 Ber. 70470和Ber. 702079中，公开了通过酵母发酵将17-酮-类固醇还原成17-β-羟类固 醇。此后，peterson和Murray在美国专利NO. 2602769中公开一种用根霉属真菌产生孕酮 的ll-a_轻化方法。1972年，Kraychy等在美国专利NO. 3684657中公开了用Mycobacterium SP. NRRL B-3683降解17位脂肪链制备4-AD，ADD的方法。1973年，Marsheck等在美国专 利NO. 3759791中公开了用Mycobacterium SP. NRRL B-3805,以胆甾烷等17位有8个以上 碳原子的甾体原料制备4-AD。
[0003] A环降解物（δ-Lactone)，是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中间体，但 转化过程中留核A环、B环开环，非常容易降解，产品难以积累，从而难以达到产业化标准。 申请号为201410029845. 3的中国专利申请公开了一种偶发分枝杆菌及在发酵生产δ -内 酯中的应用，但发酵转化中用到大豆油，提取困难，且环境影响大。
【发明内容】
[0004] 本发明涉及一种留体激素重要中间体的制备方法，具体是一种植物留醇经微生物 转化为A环降解物的方法，本发明生产A环降解物中转化为无油条件，重量收率高，发酵效 率高。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：一种发酵植物留醇生产A 环降解物的方法，包括以下步骤：
[0006] Α)制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂：
[0007] al)斜面种子培养：将偶发分枝杆菌接种到斜面种子培养基上，28?32°C培养 3?5天；
[0008] a2) -级种子培养：将al中培养的菌落加入一级液体种子培养基中培养，培养的 温度为28?32°C，培养的时间为45?50小时，培养的转速为180?200rpm ;
[0009] a3)二级种子培养：将a2中培养的菌液接种到二级液体种子培养基中培养，接种 量为9?11 %，培养的温度为28?32°C，培养的时间为22?25小时，得含偶发分枝杆菌 的液体菌剂；
[0010] B)发酵培养：将步骤A中得到的含偶发分枝杆菌的液体菌剂接种到转化培养基中 培养转化，接种量为9?11 %，培养转化的温度为28?32°C，培养转化的时间为95?100 小时，培养转化的转速为200?250rpm，培养转化的空气流量为0. 33?0. 5vvm，培养转化 的罐压为0. 045?0. 055MPa ;
[0011] C)分离提取：步骤B转化完全后，用浓硫酸调节pH值为I. 9?2. 1，然后用氯仿提 取，浓缩，冷却，抽滤，滤饼层用甲苯冲洗，得A环降解物。
[0012] 进一步的，所述斜面种子培养基的配方为：酵母膏11?13g/L，硝酸钠6. 3? 6. 4g/L，磷酸二氢钾0· 9?I. lg/L，磷酸氢二钾L 9?2. lg/L，葡萄糖5. 5?6. 5g/L，氯化 钾0· 1?0· 2g/L，七水硫酸镁0· 7?0· 9g/L，琼脂18?22g/L，pH为7. 1?7. 2。
[0013] 进一步的，所述一级液体种子培养基的配方为：玉米浆19?21g/L，硝酸钠6. 3? 6. 4g/L，磷酸二氢钾0· 9?I. lg/L，磷酸氢二钾L 9?2. lg/L，葡萄糖5. 5?6. 5g/L，氯化 钾0· 1?0· 2g/L，七水硫酸镁0· 7?0· 9g/L，pH为7. 1?7. 2。
[0014] 进一步的，所述二级液体种子培养基的配方为：玉米浆19?21g/L，硝酸钠6. 3? 6. 4g/L，磷酸二氢钾0· 9?I. lg/L，磷酸氢二钾L 9?2. lg/L，葡萄糖5. 5?6. 5g/L，氯化 钾0· 1?0· 2g/L，七水硫酸镁0· 7?0· 9g/L，pH为7. 1?7. 2。
[0015] 进一步的，所述转化培养基的配方为：硝酸钠5. 3?5. 5g/L，磷酸氢二铵0· 55? 0· 65g/L，玉米浆32?36g/L，吐温-80 0· 4?0· 6g/L，消泡剂0· 2?0· 3g/L，β -环糊精 50?55g/L，植物甾醇19?22g/L，pH为8?8. 4。
[0016] 进一步的，所述含偶发分枝杆菌的液体菌剂中，所述偶发分枝杆菌的菌体浓度达 到10亿个/ml以上。
[0017] 本发明的发酵反应方程式为：
[0018]
【权利要求】
1. 一种发酵植物留醇生产A环降解物的方法，其特征在于，包括以下步骤： A) 制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂： al)斜面种子培养：将偶发分枝杆菌接种到斜面种子培养基上，28?32°C培养3?5 天； a2) -级种子培养：将al中培养的菌落加入一级液体种子培养基中培养，培养的温度 为28?32°C，培养的时间为45?50小时，培养的转速为180?200rpm ; a3)二级种子培养：将a2中培养的菌液接种到二级液体种子培养基中培养，接种量为 9?11 %，培养的温度为28?32°C，培养的时间为22?25小时，得含偶发分枝杆菌的液体 菌剂； B) 发酵培养：将步骤A中得到的含偶发分枝杆菌的液体菌剂接种到转化培养基中培养 转化，接种量为9?11 %，培养转化的温度为28?32°C，培养转化的时间为95?100小时， 培养转化的转速为200?250rpm，培养转化的空气流量为0. 33?0. 5vvm，培养转化的罐压 为 0? 045 ?0? 055MPa ; C) 分离提取：步骤B转化完全后，用浓硫酸调节pH值为1. 9?2. 1，然后用氯仿提取， 浓缩，冷却，抽滤，滤饼层用甲苯冲洗，得A环降解物。
2. 根据权利要求1所述的发酵植物留醇生产A环降解物的方法，其特征在于，所述斜面 种子培养基的配方为：酵母膏11?13g/L，硝酸钠6. 3?6. 4g/L，磷酸二氢钾0. 9?1. lg/ L，磷酸氢二钾1. 9?2. lg/L，葡萄糖5. 5?6. 5g/L，氯化钾0. 1?0. 2g/L，七水硫酸镁 0? 7 ?0? 9g/L，琼脂 18 ?22g/L，pH 为 7. 1 ?7. 2。
3. 根据权利要求1所述的发酵植物留醇生产A环降解物的方法，其特征在于，所述一 级液体种子培养基的配方为：玉米浆19?21g/L，硝酸钠6. 3?6. 4g/L，磷酸二氢钾0. 9? 1. lg/L，磷酸氢二钾1. 9?2. lg/L，葡萄糖5. 5?6. 5g/L，氯化钾0? 1?0? 2g/L，七水硫酸 镁 0? 7 ?0? 9g/L，pH 为 7. 1 ?7. 2。
4. 根据权利要求1所述的发酵植物留醇生产A环降解物的方法，其特征在于，所述二 级液体种子培养基的配方为：玉米浆19?21g/L，硝酸钠6. 3?6. 4g/L，磷酸二氢钾0. 9? 1. lg/L，磷酸氢二钾1. 9?2. lg/L，葡萄糖5. 5?6. 5g/L，氯化钾0? 1?0? 2g/L，七水硫酸 镁 0? 7 ?0? 9g/L，pH 为 7. 1 ?7. 2。
5. 根据权利要求1所述的发酵植物留醇生产A环降解物的方法，其特征在于，所述转化 培养基的配方为：硝酸钠5. 3?5. 5g/L，磷酸氢二铵0? 55?0? 65g/L，玉米浆32?36g/L， 吐温-800. 4?0? 6g/L，消泡剂0? 2?0? 3g/L，0 -环糊精50?55g/L，植物甾醇19?22g/ L，pH 为 8 ?8. 4。
6. 根据权利要求1至5任一所述的发酵植物留醇生产A环降解物的方法，其特征在于， 所述含偶发分枝杆菌的液体菌剂中，所述偶发分枝杆菌的菌体浓度达到10亿个/ml以上。
【文档编号】C12R1/33GK104404099SQ201410623898
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】应正平, 蒋青锋, 陈小良, 杨坤 申请人:江西赣亮医药原料有限公司