专利名称：通过LXRa基因多态性进行牛育种方法
技术领域：
本发明涉及牛育种方法，具体涉及通过牛LXRa基因多态性检测来进行牛育种的方法。
背景技术：
牛肉肉质鲜美、营养丰富、蛋白质含量要比一般肉类高，其不仅含有人类所必需的一切氨基酸，还具有低胆固醇、低脂肪的优点，是人类肉类食品中的佳品。从上世纪60年代开始，国际市场对牛肉的需求持续增长，世界的肉牛业在快速发展，而我国也成为继美国、 巴西之后的世界第三大牛肉生产国。随着人民生活水平的不断提高，肉食结构的改善，牛肉的消费量呈现持续增长的局面，目前我国每年仍需要进口大量的高档牛肉。优质牛肉产品成为世界人民消费的发展趋势，但牛肉质量正成为制约我国肉牛业发展的一个瓶颈。培育优质的肉牛品种一要注重生长速度、肌肉丰度和育肥速度；二要重视肉质性状和生长性状。在西方国家，肌内脂肪、嫩度、背膘厚等指标是作为育种的重要指标；在东方国家，日本和韩国特别重视从本国的役用牛品种培育出适合自己本国人民口味的优质肉牛品种。意大利皮埃蒙特牛、日本和牛及韩国韩牛都是从本土品种选育而成的颇具特色的优质肉牛品种，其品味独特、肉质优良、产肉率高，价格也比其他牛肉高。肉牛品种是肉牛产业中的关键，要生产高品质的牛肉就需要有优良的肉牛品种。 我国的黄牛品种资源丰富、肉质良好、适应性强，有清香之特色，是世界牛品种资源的宝库。 但我国黄牛在历史上以役用为主，要作为规模化产肉品种还是有一些差距的。我国本地黄牛多具有产肉少、育肥速度慢、后躯不发达的缺点，加之品种内个体间肉用性能差异较大 (陈幼春，2001)，没有系统化的选育，高档肉块相对较少，因而肉牛生产的规模和效益与国外专门化肉牛品种相比较差。但在一些群体或者部分个体上，我国本地黄牛具有很好的肉用性能(陈幼春，1990 ；邱怀，1986)，若经过高强度的品种内选育，很有可能在较短时间内培育出我国特有的优质肉牛品种。在育种进程中，韩牛和皮埃蒙特牛为了保持自身品种牛肉肉质的特性没有引入外源血统，而是通过纯繁育种选育的，这为我国本地黄牛选育提供了丰富的经验(许尚忠， 2005)。我国育种工作者从1981年开始通过引种和杂交等方法对本地黄牛品种进行改良， 经过20年的努力成功选育了中国西门塔尔牛品种，这是一个肉乳兼用的新品种。2007年， 我国又成功培育了 “夏南牛”，这是我们国家第一个肉牛品种，它是以法国夏洛来牛为父本， 我国本地黄牛南阳牛为母本，采用了正反回交、导入杂交和横交固定的育种技术培育出来的，填补了我们国家肉牛品种的空白。但引进外来品种和我国本地品种杂交并不能从根本上加快我国肉牛业的发展，新品种也不一定能很快适应当地的自然条件及人民的口味的需要，同时也不能最大效率的利用我国优良的地方品种资源。据报道，我国本地黄牛品种，如秦川牛和晋南牛分别有5-10%和20- %的个体不亚于国外优质肉牛品种的性能特点(张英汉，2001)。因此，我们要充分利用本地黄牛品种的优质资源，应用现代分子生物技术并结合传统育种方法，培育具有我国特色的优良品质肉牛。
鲁西牛鲁西牛(LuXi Cattle, LX)主要分布于山东省菏泽市，作为五大地方良种黄牛之一，其生长速度较快、肉用性能好、役用能力强，肉质细嫩、柔软多汁、大理石花纹明显，耐粗饲，体躯高大结实、性情温和，是选育中国肉牛的基础(石璞等2006)。缺点是需要耗费大量的粗、精饲料，现牛存栏数少，杂交利用过度，对纯种保护没有重视(王淑辉等2007)。郏县红牛郏县红牛(JiaXian Catltle，JX)主产于我国河南省平顶山市郏县及周边地区，是我国八大优良地方黄牛品种之一。其体格较大、结构勻称、体质结实、肌肉发达，被毛红色、 毛短且富有光泽，遗传稳定、抗逆性强且耐粗饲，对地理环境的适应性及分布的广泛性是其他品种不可比拟的(张花菊等2005，2006)。郏县红牛肉用性能较好，具有明显的大理石花纹，肉质细嫩、肉味香醇、色泽鲜红，具有很好的生产潜力，可以向肉役兼用型、肉用型牛品种发展，缺点是后躯不发达、生长缓慢(马桂变等2009)。秦川牛秦川牛^jinChuan Cattle, QC)主要分布于陕西关中一带，因产于八百里秦川而得名，在地方黄牛品种中体型最高大。其皮质优良、肉质鲜美、适应性强、遗传稳定、役肉兼用， 被誉为“国之瑰宝”(蒋洪茂等1993)，是中国五大优良黄牛品种之一，在国际市场上占有重要的地位，国内市场上也高于其它牛品种价格。缺点是产肉效率低、饲料利用率低，正在向肉牛品种的方向选育(陈宏等2002 ；张岩2004)。南阳牛南阳牛(NangYang Cattle，NY)主要分布于河南省南阳市，是我国五大优良黄牛品种之一，役肉兼用型的黄牛品种。其体型高大、结构紧凑、皮薄毛细、肌肉发达、耐粗饲，产肉能力强、大理石纹明显、肉质细嫩，毛色以黄色为主(王冠立2000 ；张玉才等2010)。缺点是生长发育缓慢、不耐寒、产肉率一般、饲料利用率低(王建钦2006)。DNA分子标记是指能够反映生物种群间或个体间基因组上某段DNA片段差异性的技术，常用电泳谱带的形式直接反映DNA水平上的遗传多态性，这项研究开始于19世纪80 年代。随着DNA分子标记研究的深入，它在动物遗传及动物育种上也发挥了重要作用。分子育种即分子标记辅助选择育种(MAS)，是应用分子数量遗传学的理论及技术来改良畜禽品种，是传统育种理论和方法的发展，其包括转基因动物育种和基因组育种。前者采用基因转移技术，外源DNA被导入另种动物基因组上，培育出新品系；其是在DNA水平上对目标性状的基因进行选择，选种准确率得到很大提高，且选育时间由传统育种的8 10代缩短到2 3代，克服了传统动物育种方法的缺陷，加快了品种改良和新品种培育的进展(陈宏等2008 ；陈丹霞等2009)。后者是以基因组和比较基因组研究为基础，利用DNA 分子标记技术对动物数量性状基因座位进行筛选，或者通过标记辅助淘汰清除不利基因而达到改良品系性状的目的。DNA分子标记可以用来构建家畜的基因图谱、预测家畜杂种优势、鉴定品种或个体、分析亲缘关系或遗传分化和保护遗传资源。在肉牛育种进程中，育种工作者希望通过选择与生长或肉质性状密切相关的DNA标记，达到提高育种准确性和早期选种的目的，以期在动物品种选育中获得较快的进展。随着基因组计划的逐步实施以及深入发展，分子标记育种已经在动物遗传育种过程中发挥着愈来愈重要的作用，也正不断呈现出广阔的应用前景，并带来巨大的效用和经济价值。单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms, SNPs)是基因组 DNA 序列中某一个特定核苷酸发生改变而引起的多态性，它包括单个碱基的插入或者缺失、碱基转换或者颠换等，是生物基因组中最广泛存在的一类变异(刘万清等1998 ；Halushka M K等 1999)。1996年，这个概念由美国人Lander提出，被称为“第三代DNA遗传标记”。前两代以序列的长度差异作为遗传标记，SNPs则是以由单个碱基改变而造成的单链构象的差异为标记。SNI^s分布广泛，每一千个核苷酸中就可能出现一个碱基突变(Bond C等1998)。SWs的特点是(1)高多态性。虽然每个SNP就只有2种变异体，其变异程度也不如微卫星或者小卫星DNA强，但是在整体上SNPs数量巨大，占基因组所有已知多态性的90% 以上(Lewis R 2002)。( 高遗传稳定性。SNPs的遗传稳定性高，在漫长历史上先形成的SNPs在群体中会稳定遗传，常有很高的频率，而后形成的则所占的频率较低(BrookesA J1999)。同时，SM^s在各地各群体中所占比例也并非相同，但仍然有大约85%是共通的 (Cargill M 1999)。(3)检测方法多。SNP是由单个核苷酸突变引起的，凡是可以检测点突变的方法都可以用于鉴定SWs位点。检测分析SNPs的技术很多，常用且有代表性的有限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、单链构象多态性分析(single strand conformaion polymorphism，SSCP)、寡核苷酸连接分析 (οligo-nucleotide ligation assay，OIJV)、$f生梯月交电^永分(denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)等(方唯意等 2003)。本实验中采用的是 RFLP、SSCP 和 DNA 直接测序法。(4)功用广泛。DNA分子标记的的研究一直很活跃，其功用也十分广泛。研究者们常利用DNA分子标记技术对可以用家畜基因图谱进行构建，鉴定分析品种优势和起源进化等，对保护生物多样性和遗传资源发挥了重要作用。肝χ 受体(liver X receptors, LXRs)家族有两个亚型，LXRa (NR1H3)及 LXR^ (NR1H2)，是 1994年在人和鼠上分离得到的(Apfel et al. 1994 ；Shinar et al. 1994 ； Song etal. 1994)。LXRi^在各组织中都有表达，LXRα则仅仅在脂类代谢旺盛的组织表达， 如肝脏、肾脏、脾脏和肠Olin et al. 2009)。序列分析表明LXRα和LXRi^在配体结合区及 DNA结合区具有77%的高同源性。LXR α结构中包含核心的DNA结合区(DBD)和配体结合区(LBD)，与维甲酸X受体 (RXR)结合形成异源二聚体LXR/RXR，再与配体结合后引起异源二聚体与靶基因上特异的 DNA元件(LXRE)结合，从而调节靶基因在转录水平上的表达。此途径在维持机体内胆固醇和脂肪的代谢平衡中具有非常重要的作用(Wu and Zhao 2009 ；Kim etal. 2008)。LXRa调控Angptl3基因，可激活甾醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory elementbinding protein-lC, SREBPlC)的表达，从而在脂肪酸代谢中也发挥重要作用， 导致肝脏内脂肪的积聚和血浆中甘油三酯水平的升高，甚至引起肝脂肪变性(黄晓宇等 2006 ；ChaJY et al. 2007 ；Zhou J et al. 2008 ；Yan qin et al. 2009)。韩春春发现鹅 LXR α mRNA基因在填饲条件下表达丰度增加(韩春春等2009)。于浩则发现猪LXR α基因的表达在3-12月龄间随着月龄的增大表达量增加(于浩等2009)。LXRa介导的信号转导途径对胆固醇合成、外源胆固醇的吸收及逆转运有重要调节作用(Millatt LJ et al. 2003)。 当胆固醇在血管壁细胞内过多时，通过激活细胞膜上ATP结合盒转运子Al (ABCAl)将细胞内多余的胆固醇转移到血浆HDL分子上运回肝脏代谢，这一过程称为胆固醇的逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT) (Sabine Rode et al. 2008 ；朱静和王素莉2009)。 LXRa也是糖代谢的重要调控者(Stuinig et al. 2002)。LXR α能被胰岛素诱导表达，抑制糖异生关键酶(曾建涛等2008)，故LXRa可作为糖尿病治疗中重要的药物作用靶点。LXRa 还参与调节特异与非特异的免疫反应。LXRa基因敲除小鼠更容易感染李斯特(Listeria) 细菌，而LXRi3基因敲除小鼠没有这种现象，这表明LXRα发挥了重要的保护作用(Jowph SB et al. 2004)。
发明内容
本发明的目的在于，通过分析牛LXRa基因的单核苷酸多态性，并将其与生产性状进行关联分析，以筛选出SNP位点以辅之于育种，加快牛育种进程。为了实现上目的，本发明采取如下技术方案一种基于LXRa基因多态性进行牛育种的方法，筛选具有特定LXRa基因的牛作为父本和/或母本进行育种，其特征在于所述的LXRa基因的1514位点序列TT。在本发明的一个优选实施方式中，进一步的，所述的LXRa基因的10 位点序列为CC。在本发明的一个优选实施方式中，所述的牛为鲁西黄牛或郏县红牛，优选为鲁西黄牛。本发明还涉及具有特定LXRa基因的牛筛选方法，包括提取待筛选牛的DNA，其特征在于采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATCGTGTCCGACTCTCTGC 作为 PCR 引物对牛 DNA 进行扩增；或者采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATAGCGGACTGCGGCGT 作为 PCR 引物对牛 DNA 进行扩增；并进一步包括对扩增产物进行凝胶电泳检测。在本发明的一个优选实施方式中，还包括GAGTTTTCAGGTCGGAGAGA和 TAGGCACGAGAACCAGCAC作为PCR引物对牛DNA进行扩增；并进一步包括对扩增引物进行凝胶电泳检测。通过本发明的方法，能够培育出在体高、体斜长和腰角宽等指标上都更加优良的牛，促进我国的肉牛养殖行业的快速发展。
图1牛LXRa基因Pl (561bp)对引物扩增结果；图2牛LXRa基因P2 (455bp)和P3(139bp)对引物扩增结果图3牛LXRa基因Pl对引物测序图谱图4牛LXRa基因P2对引物测序图谱；
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。1引物设计与合成以GenBank公布的牛LXRa基因(登录号NC_007313)和ANGPTL4基因(登录号 NC_007305)序列为参照，使用I^rimer Premier 5. 0软件设计引物，送南京金斯瑞公司合成，具体信息见表1。表1牛LXRa基因和ANGPTL4基因引物相关信息
Table 1 Primers information of bovine LXR α and ANGPTL4 gene
权利要求
1.一种基于LXRa基因多态性进行牛育种的方法，筛选具有特定LXRa基因的牛作为父本和/或母本进行育种，其特征在于所述的LXRa基因的1514位点序列TT。
2.根据权利要求1所述的牛育种方法，进一步的，所述的LXRa基因的10 位点序列为CC。
3.根据权利要求1或2所述的牛育种方法，所述的牛为鲁西黄牛或郏县红牛，优选为鲁西黄牛。
4.一种特定LXRa基因的牛筛选方法，包括提取待筛选牛的DNA，其特征在于采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATCGTGTCCGACTCTCTGC 作为 PCR 引物对牛 DNA 进行扩增；或者采用 GACCCCTTGTGTCTCTCTTTC 和 ATAGCGGACTGCGGCGT 作为 PCR 引物对牛 DNA 进行扩增；并进一步包括对扩增产物进行凝胶电泳检测。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，还包括GAGTTTTCAGGTCGGAGAGA和 TAGGCACGAGAACCAGCAC作为PCR引物对牛DNA进行扩增；并进一步包括对扩增引物进行凝胶电泳检测。
6.根据权利要求4或5所述的牛育种方法，所述的牛为鲁西黄牛或郏县红牛，优选为鲁西黄牛。
全文摘要
本发明公开了一种基于LXRa基因多态性进行牛育种的方法，筛选具有特定LXRa基因的牛作为父本和/或母本进行育种，其特征在于所述的LXRa基因的1514位点序列TT。通过本发明的方法，能够培育出在体高、体斜长和腰角宽等指标上都更加优良的牛，促进我国的肉牛养殖行业的快速发展。
文档编号C12Q1/68GK102242199SQ20111013615
公开日2011年11月16日 申请日期2011年5月25日 优先权日2011年5月25日
发明者李芬, 李荣荣, 杨婷, 林峰, 王新庄, 石奎林, 陈宁博, 马云 申请人:信阳师范学院