专利名称：一种病原丝状真菌特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丝状真菌特异性启动子及其应用。
背景技术：
病原丝状真菌，包括植物病原真菌和昆虫病原真菌，侵染宿主时，首先要形成侵染结构附着胞。附着胞的功能是提供机械压力和分泌水解酶，以形成侵染钉穿透宿主体壁；因此，附着胞的形成对于病原丝状真菌成功侵染宿主至关重要。目前，对病原真菌附着胞形成期间的基因表达已有一些报道，但对附着胞形成和分化过程中的基因调控目前尚无报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种病原丝状真菌的特异性启动子，所述启动子来自于蝗绿僵菌，其能够在病原丝状真菌附着胞形成期特异性表达。本发明的另一目的在于提供上述启动子在制备高侵染能力的转基因菌株中的应用，其能够驱动同、异源基因在附着胞形成期间高效表达。本发明病原丝状真菌的特异性启动子PMagasl，来源于蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)Magasl基因的上游序列，可以是下述核苷酸序列之一(1)至少含有SEQ ID NO. 1所示的DNA序列；(2)与SEQ ID NO. 1所示序列互补的DNA序列；(3)与SEQ IDN0. 1所示序列或其互补序列具有90%或90%以上相似性，且具有相同功能的DNA序列。本领域普通技术人员均知晓因不同启动子之间核苷酸相似性非常低， 通常只是其中的一些顺式作用元件具有保守性，改变启动子中某些非重要核苷酸并不会影响启动子的活性，但改变几个核苷酸会导致相似性低于100%、大于等于90%，因此与SEQ ID NO. 1所示序列或其互补序列具有90%或90%以上相似性，且具有相同功能的DNA序列也属于本发明的保护范围。含有上述病原丝状真菌的特异性启动子的重组表达载体、转基因菌株以及该转基因菌株的制备方法等均属于本发明的保护范围。本发明构建了含有PMagasl启动子驱动外源基因的表达载体，在一个优选的实施方式中，所述的表达载体为PMagasl-EGFP，其具有如图1所示的结构。本发明含上述病原丝状真菌的特异性启动子的转基因菌株的构建方法，包括以下步骤(1)、将PMagasl启动子与目的基因可操作地连接；(2)、构建含有PMagasl启动子与目的基因的表达载体；(3)、将所述表达载体转化菌株，得到转基因菌株。侵染结构附着胞的形成是植物和昆虫病原真菌侵染的前提条件，发明人对蝗绿僵菌基因组的研究中发现，其Magasl基因在附着胞期间大量表达，发明人随后经大量实验研究证明PMagasl启动子在附着胞时期特异性高效表达。本发明启动子为研究病原丝状真菌
3在附着胞形成及穿透寄主体壁过程的调控，以及野生型昆虫病原菌株基因工程改造提供了重要工具，具有重要很好的应用价值。
图1 :PMagasl_EGFP表达载体图谱；其中PMagasl =Magasl基因启动子；EGFP 绿色荧光蛋白；TTrpC 构巢曲霉色氨酸合成酶基因终止子；Bar cassette 除草剂抗性元件； Kan 卡那霉素抗性元件；LB和RB为Ti质粒双元载体左右边界。图2 转化子PCR电泳验证图；M =DNA标准；泳道1_13为13个不同转化子；NC 阴性对照，蝗绿僵菌CQMal02野生型菌株；PC 阳性对照，含bar抗性元件的质粒。图3 =PMagasl-EGFP蝗绿僵菌转化子在各阶段的荧光观察；A 转化子孢子；B 萌发的孢子；C 附着胞；D 菌丝；E 血淋巴中菌丝体；标尺为10 μ m。图4 不同生长时期Magasl半定量RT-PCR ； 1-6分别为孢子、萌发孢子、菌丝、附着胞、体内菌丝及体表孢子总RNA中Magasl表达分析；组成型基因gpd作为内参。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法；所用材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业得到。实施例1 启动子的分离本发明中所用菌株为蝗绿僵菌(Metarzhizium acridum)菌株CQMal02。取培养在1/4SDAY培养基(葡萄糖10g/L，蛋白胨2. 5g/L，酵母浸膏5. Og/L，琼脂18g/L，pH值调至6. 0)上的CQMal02菌株IO5个孢子，接种于1. 5ml 1/4SDAY液体培养基中，28°C 250rpm 振荡培养3天，用真菌基因DNA提取试剂盒(Biof lux，杭州)提取基因组DNA。用已克隆的Magasl基因序列与已有的蝗绿僵菌基因组序列进行比对，获取 Magasl基因上游的部分序列，通过启动子预测软件分析，截取1222bp的一段序列，设计引物 PMagas 1F5，CGactaRtTTGTACGGAGTACTCCAG ACGT3，(含有 SpeI 酶切位点)和 PMagasl R5’ CArrrcccGGATAAGGTAGGGGGTTTTGTA3‘(含有 ApaI 酶切位点)。以提取的基因组 DNA 为模板，进行扩增。扩增体系(25μ 1) =IOXLA Taq缓冲液2. 5μ l，25mMMgCl2 1.5μ1，引物 PMagaslF和 PMagaslR各 1 μ 1，IOmM dNTPs 0. 5 μ 1, LATaq 0. 25 μ 1，基因组DNA Ιμ ，超纯水 17. 75 μ 1。PCR 扩增程序为:94°C预变性 4min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 1. 5min 30 个循环，然后72°C延伸5min ；4°C保存。电泳结果显示PCR扩增出目标带约1200bp。得到的PCR 产物克隆到PMD18-T中间载体上，DNA测序验证，该PCR产物具有序列的核苷酸序列。将含有启动子PMagasl的pMD18_T载体用ApaI和SpeI酶切后插入PDPB载体上(Cao，Y.，Peng， G. , He, Ζ. , Wang, Ζ. , Yin, Y. , Xia, Y. , 2007. Transformation of Metarhizium anisopliae with benomyl resistance and green fluorescent protein genes provides a tag for genetically engineered strains. Biotechnol. Lett. 29,907-911)。实施例2 :PMagas I-EGFP表达载体构建
根据EGFP 序列设计引物 EGFPF5，ATgggcccATGGTGAGCAAGGGCGAGG3，(下划线为 ApaI 酶切位点)禾Π EGFPR5’ CAcccgggTTACTTGTACAGCTCGTCC3，(下划线为 SmaI 酶切位点)， 从pEGFPN-Ι质粒(BD，USA)扩增EGFP序列，测序验证序列正确性。将EGFP扩增产物用ApaI 和SmaI酶切后插入同样用ApaI和SmaI切过PDPB-PMagasl上。构建PDPB-PMagasl-EGFP 载体。转化大肠杆菌后，提取质粒。用SpeI切PDPB-PMagasl-EGFP载体将表达元件 PMagasl-EGFP切下，插入到含有Bar抗性的pK2载体上，构建pK2_PMagasl-EGFP表达载体， 载体模式图如图1所示。实施例3 =PMagasl-EGFP表达载体转化蝗绿僵菌及鉴定将PMagasl-EGFP表达载体通过电转化转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EAH105菌株(北京鼎国)中，再进行PCR验证。通过农杆菌介导的方法 (Fang, W. , Zhang, Y. , Yang, Χ. , Zheng, Χ. , Duan, H. , Li, Y. , Pei, Y. , 2004. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Beauveria bassiana using an herbicide resistance gene as a selection marker. J Invertebr Pathol 85，18—24)，转化it皇參录僵菌CQMal02。在含有80μ g/ml除草剂的查氏培养基上(蔗糖30g/L，NaN03 2g/L, KH2PO4 lg/ L，MgSO4 0. 5g/L，KCl 0. 5g/L，FeSO4 0. 01g/L，琼脂 15g/L)筛选转化子。培养 10 天后，挑选转化子至1/4SDAY上进行培养，用真菌基因DNA提取试剂盒(Bioflux，杭州)提取转化子基因组DNA，PCR扩增bar基因元件，验证转化子。1 %琼脂糖凝胶电泳显示，在转化子中能检测到bar基因元件，大小为970bp (如图幻，说明PMagasl-EGFP表达元件已成功转入蝗绿僵菌中。阴性对照为蝗绿僵菌CQMal02野生型菌株基因组DNA做模板。阳性对照为含bar 抗性元件的质粒做模板。本发明表达载体除可转化蝗绿僵菌外，还可用于转化其他病原丝状真菌，如金龟子绿僵菌，白僵菌属各个种如球孢白僵菌，拟青霉属各个种等等。实施例4 =PMagasl-EGFP转化子荧光观察在蝗绿僵菌的腐生及寄生阶段观察PMagasl-EGFP转化子荧光情况。腐生阶段将 PMagasl-EGFP转化子所验证的培养在1/4SDAY中，取孢子、孢子萌发及菌丝时期的蝗绿僵菌在荧光显微镜下(Olympus)观察。寄生阶段将孢子接种于东亚飞蝗翅膀及在前胸背板点滴接种，观察翅膀上附着胞时期及侵染后昆虫血淋巴中菌丝体的荧光情况。结果如图3 所示仅在附着胞形成时期有荧光，而在腐生和寄生的其他阶段均未发现荧光。实施例5 启动子活性分析通过半定量RT-PCR比较蝗绿僵菌中PMagasl调控的Magasl基因和组成性高表达的三磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpd)的表达，分析PMagasl启动子启动活性。提取蝗绿僵菌各个生长时期的总RNA。包括孢子、萌发孢子、菌丝、附着胞、血淋巴中的菌丝体和侵染致病蝗虫体表再形成的孢子这几个时期。孢子、萌发孢子和菌丝直接液氮研磨后，按^witrogen公司的Trizol试剂按操作说明进行。附着胞诱导和附着胞RNA提取、血淋巴中绿僵菌菌丝体RNA提取按Siang & Xia (Siang，C.，Xia, Y.， 2009.Identification of genes differentially expressed in vivo by Metarhizium anisopliae in the hemolymph of Locusta migratoria using suppression subtractive hybridization. Curr. Genet. 55，399-407)方法进行。半定量RT-PCR 以上述6个不同时期的RNA为模板，用反转录试剂盒(i^ermentas，USA)分别反转录成cDNA第一条链，体系如下5XReaction Buffer 4μ1，总RNA lug, oligo(dT) 18 1 μ 1, RNase Inhibitor (20u/ μ 1) 1 μ 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, M-MuLV 反转录酶(200u/ μ 1)1 μ 1.混合均匀后42°C温浴lh，70°C 5min以终止反应。PCR体系Q5 μ 1) 如下10XPCR Buffer (25mM Mg2+) 2. 5 μ 1，IOmM dNTPs 0. 5 μ l,5U/y 1 Taq DNA 聚合酶 0. 25 μ 1，引物对各 1μ 1 cDNA, 1 μ l，MilliQ水，18. 75 μ 1。程序PCR反应条件为94°C 5min ； 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 28个循环；72°C IOmin0凝胶电泳图谱如图4所示；结果显示gpd在各个时期均能扩增到，且带亮度一致，Magasl基因在附着胞形成期间高表达，且亮度与gpd基因一致，说明PMagasl启动子活性在附着胞期间与gpd启动子活性相近，具有很高的启动活性。为了更好的了解PMagasl启动子的功能，将PMagasl启动子在真核生物启动子数据库 http //www. Rene-reRulation. com/pub/proRrams/al ibaba2/index, html 中进行了顺式作用元件分析，如表1所示。表IPMagasl启动子顺式作用元件
FactorLocationStrandSignal sequenceGR31(+)cggtacttggSPl38(+)ttggaggcgaC/EBPalp75agctgcaataNF-I123(+)/㈠ctggcaagNF-kappaB131(+)/㈠aggaaaacccDl132(+)/㈠gaaaacccgaAdf-I145(+)acgtcgactgGAGAT-I155(+)/㈠tcagataatgcGAGAT-I172(+)/㈠ggataagaatSpl193(+)/(-)aggcgggcagggcC/EBPalp195(+)/(-)gggcaaggttSpl218(+)/(-)ggtcggagcgC/EBPalp222(+)/(-)ggagcgacgcSpl225(+)/(-)gcgacgccccNF-I229(+)/(-)gccccggctcSpl242(+)/(-)gtgtcggaggat
权利要求
1.一种病原丝状真菌的特异性启动子，其特征在于它的核苷酸序列是(1)至少含有SEQID NO. 1所示的DNA序列；或(2)与SEQID NO. 1所示序列互补的DNA序列；或(3)与SEQIDN0. 1所示序列或其互补序列具有90%或90%以上相似性、且具有相同功能的DNA序列。
2.含如权利要求1所述病原丝状真菌特异性启动子的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于其具有如图1所示的结构。
4.根据权利要求1所述的病原丝状真菌特异性启动子在制备转基因菌株中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述菌株为蝗绿僵菌的菌株。
6.一种含如权利要求1所述病原丝状真菌特异性启动子的基因工程菌。
7.一种制备如权利要求6所述的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)、将所述的启动子与目的基因可操作地连接；O)、构建含所述的启动子与目的基因的表达载体； (3)、将所述表达载体转化菌株，得到转基因菌株。
全文摘要
一种病原丝状真菌的特异性启动子，其核苷酸序列为至少含有SEQ ID NO.1所示的DNA序列；或与SEQ ID NO.1所示序列互补的DNA序列；或与SEQ ID NO.1所示序列或其互补序列具有90％或90％以上相似性，且具有相同功能的DNA序列。经实验研究证明本发明启动子在附着胞时期特异性高效表达，为研究病原丝状真菌在附着胞形成及穿透寄主体壁过程的调控，以及野生型昆虫病原菌株基因工程改造提供了重要工具，具有重要很好的应用价值。
文档编号C12N15/113GK102229931SQ20111013546
公开日2011年11月2日 申请日期2011年5月23日 优先权日2011年5月23日
发明者夏玉先, 曹月青, 朱祥先, 焦润 申请人:重庆大学