一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法

专利名称：一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，属于基因工程菌株构建方法，具体涉及一种高产油酸 的丝状真菌工程菌株的构建方法。
背景技术：
为应对愈演愈烈的石油危机，世界各国都在积极制定和实施新的能源发展战略， 希望通过各种可能途径寻找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生产生物柴 油的原料主要依赖于油料作物、木本油料人工林、动物脂肪及废弃油脂等。从油料树木中提 取油脂，具有占用耕地面积、周期长、成本高等一系列制约因素。发展动物油脂也同样面临 一系列制约因素。因此，开辟新的植物源油脂生产途径，特别是工业化生产途径对满足不断 增长的生物柴油的需求具有重要意义。研究发现，除高等植物和动物能生产油脂外，低等的微生物也能产生油脂，大部分 微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相似。通常情况下微生物细胞仅含油2 3%，但在 适宜条件下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20%以上，在已知细菌、酵母、 霉菌和藻类中都发现有产油脂的菌株。霉菌即丝状真菌以菌丝的方式繁殖很快，利用丝状 真菌作为生物反应器生产脂肪酸，为生物柴油原料生产开辟了一条新的技术途径。丝状真 菌生产油脂时，具有增殖快，生长周期短，适合工厂化生产，投入较少，收获稳定，不受季节、 气候等环境条件影响，且不消耗化学肥料和农药，因而对环境污染减轻。但目前丝状真菌存 在产油率低，油脂成分组成复杂，与生产优质生物柴油的原料要求仍为较大距离。运用分子 生物学技术，将植物脂肪酸合成相关基因特别是控制产脂量和脂肪酸品质的基因导入丝状 真菌中，构建优质“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在真菌细胞中的高效表达，增 加真菌产脂量，提高和控制脂肪酸组成。此种新方式可从根本上解决真菌产脂菌油质差、产 油率低的缺陷，又可充分发挥丝状真菌适合于生物反应器发酵以及林源优质脂肪酸合成酶 的优点。Δ 12脂肪酸脱饱和酶(又称油酸脱氢酶，简称FAD2)是脱饱和反应中的关键酶之 一，它催化油酸18 1(Δ9)脱氢形成亚油酸18 2(Δ9，12)，在碳链中引入第2个双键。 我国南方广泛分布的生物质能源树种千年桐(Vernicia Montana)具有脂肪酸合成效率高 的特性，本实验室已从千年桐发育中的种子中克隆到VeSAD2基因，将千年桐VeSAD2基因反 向导入酵母基因组可以抑制酵母自身VeSAD2基因的表达，从而降低酵母油脂中亚油酸的含 量，为酵母产油符合生物柴油的质量要求奠定基础。

发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构 建方法，反义千年桐VeFAD2基因构建在表达载体PBI121质粒上，以pBI121为基本骨架，将 千年桐VeFAD2基因反向连接在该载体上，其构建过程如图1。采用农杆菌介导法将VeFAD2 基因反向转入少根根霉后，可以改变脂肪酸成分提高油酸含量，该菌株的名称为RhizopusarrhiZUSVeFAD2-l，保存在中国林业科学研究院亚热带林业研究所观赏植物研究组实验室。本发明解决其技术问题采用的技术方案这种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构 建方法，在丝状真菌基因组中含有千年桐VeFAD2基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S 启动子、千年桐VeFAD2序列、终止密码子，所述的丝状真菌是少根根霉；该方法的步骤如 下(1)、含酶切位点千年桐VeFAD2基因cDNA编码区全长序列获得根据千年桐VeFAD2基因(GenBank登录号为EF152993)核苷酸序列设计引物，以 千年桐未成熟种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，在VeFAD2上游引入Xbal I酶切位点，下 游引入BamH I酶切位点，电泳回收VeFAD2基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化 大肠杆菌DH5 α，测序，命名该载体为pGEM-T_Vefad2 ；(2)、VeFAD2反义表达载体构建结合表达载体pBI121的限制性酶切位点图谱，选用Xbal I和BamH I两个位置来 作为插入目的片段的酶切位点，设计带Xbal I和BamH I酶切位点的引物，以克隆载体质粒 pGEM-T-XBfad2为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300 —起均用Xbal I和 BamH I双酶切；分别回收相应的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化E. coli DH 5 α感受 态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pBI-fad2;(3)农杆菌转化子的获得采用冻溶法将重组表达载体pBI-fad2农杆菌菌株EHA105、AGL-I ；(4)、少根根霉工程菌株的获得采用农杆菌介导法，活化含重组表达载体的农杆菌，与少根根霉菌液共培养，转移 到含卡那霉素的筛选培养基上，获得具有卡那霉素抗性的转化子，经PCR和Southern分子 鉴定，表明千年桐VeFAD2基因已经插入少根根霉的基因组中。经过油脂成分检测，该菌株 的油酸占总含油量的42. 44%，比对照提高了 26. 99%。本发明有益的效果是本发明将从千年桐种子总RNA中分离的VeFAD2基因构建到 表达载体PBI121上，并采用农杆菌介导法将VeFAD2基因反向导入少根根霉，使植物脂肪酸 合成基因在酵母中高效表达，提高了油脂中油酸的含量，更加适合生物柴油的要求，为生物 柴油原料生产提供一种高效高质的工程菌株。


图1 本发明质粒pBI-fad2构建过程示意图；
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明1实验材料1.1植物材料从中国林业科学研究院亚热带林业研究所树木园采取千年桐发育中的果实，将种 子剥出在液氮中速冻后-80°C冰箱保存备用。1.2菌株与质粒
少根根霉(Rhizopus arrhizus)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，大 肠杆菌E. coli DH5 α、根癌农杆菌EHA 105、AGL-I为本实验室保存。质粒ρΒΙ121为本实 验室保存，克隆载体pGEM-T Easy购自Promega公司。1. 3主要生化试剂RNA提取试剂盒购自天泽基因工程有限公司(四川绵阳)；eDNA合成试剂盒、 IPTG、X-gal、购自上海生工生物工程技术有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂 盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；大肠杆菌E. coli DH5a感受态细胞、T4 连接酶、限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。引物合成及菌液测序分别由上 海生工生物工程技术有限公司和上海联合基因公司完成，脂肪酸成分测定由亚热带林木培 育重点开放性实验室完成。1. 4培养基配制LB培养基(g.L—1)蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠10，调pH至7. O。YPD培养基(组分g·!/1):蛋白胨20，酵母膏10，葡萄糖20，自然pH。SM培养基(选择培养基)(g · L—1)酵母氮基6. 70，葡萄糖20，调pH至6.0。MM (组分 g · L-1) =K2HPO4 2. 2822，KH2PO4 1. 3609，NaCl 0. 146，MgSO4 · 7H20 0. 49294，CaCl2 0. 077693，FeSO4 · 7H20 0. 0025021，(NH4)2SO4 0. 52856，C6H2O6 1. 9817。IM (诱导培养基)在匪液体培养基的基础上加入40mM MES,调pH到5. 3，然后加入5%的甘油(W/V)，115°C灭菌30min。固体培养基灭菌前加入琼脂0. 8_1 %。YEPD培养基(种子培养基)(g · L—1):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，自然pH。发酵培养基(g· Γ1)葡萄糖 80，(NH4)2SO4 3. 0，MgSO4 · 7H20 3. 0，KH2PO4 2. 0， ρΗ5· 5-6. 02实验方法2. 1千年桐发育中种子总RNA提取(1)液氮研磨破碎细胞，取约IOOmg左右的细粉至新离心管中；(2)加入ImL溶液A振荡混合30s ；(3)加入0. 3mL溶液B和0. 2mL氯仿，振荡混勻；(4)室温离心13000g，5min,取上清(约0. 8mL)移至新离心管中；
(5)加入0. 5mL溶液C和0. 2mL氯仿，振荡混勻；(6)室温离心13000g，3min，取上清(约950mL)移至新管中；(7)加1/2体积的溶液D，振荡混勻；(8)室温离心13000g，5min，形成白色沉淀；(9)加ImL 75%乙醇振荡混勻，离心13000g, 3min，弃上清；(10)重复步骤9，吹干后溶于30uL DEPC处理的纯水中。(11)取2uL在1. 0%的琼脂糖凝胶中快速电泳检测总RNA的完整性。于_80°C保 存待用。溶液A-D是试剂盒中的产品，A 裂解缓冲液，B 第一次分相液，C 第二次分相液， D =RNA沉淀液。2. 2反转录
运用(上海生工)AMV第一链cDNA合成试剂盒，以总RNA为模板，合成cDNA第一 链。具体方法如下(1)冰浴中加总 RNA3uL下游特异性引物 IuL无RNA酶去离子水 3uL总体积7uL(2)混勻离心 3 5s，70°C 5min,冰浴 30s(3)冰浴加入5 X Reaction Buffer 4uLRNA 酶抑制剂(20U/uL) IuLdNTP (IOmM)2uL(4)混勻离心，37°C 5min，加入 luLM-MLV RT (20U/uL)，混勻。(5) 37°C 6Omin ；最后 70°C保温 IOmin02. 3PCR扩增VeFAD2基因含酶切位点cDNA编码区全长根据在GenBank上登录的VeFAD2基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序 列如下Vefad2 FP :ATA GGA TCC ATG GGT GCT GGTVefad2 RP :GCG TCT AGA TCA GAA CTT CCA其中Vefad2FP含酶切位点Xbal I和，Vefad2RP含酶切位点BamH I，以2. 2合成 的cDNA为模板，PCR扩增千年桐VeSAD2基因cDNA编码区。扩增条件为94°C预变性4min， 94°C 30S、54°C 30S、72°C lmin，30个循环，72°C延伸lOmin。扩增产物用琼脂糖凝胶电 泳进行检测。2. 4扩增产物的克隆和测序2. 4. IPCR产物的回收将VeFAD2CDNA用B型小量DNA片断快速胶回收试剂盒(博大泰克)进行特异性 扩增产物的回收纯化，操作步骤如下(1)在1. 0%的琼脂糖凝胶中电泳，使扩增产物分离形成特异带；(2)切下目的条带置离心管中；(3)加700uL溶胶液，55°C溶胶，其间偶尔摇动；装柱，12000rpm,离心30s ；去掉废 液；(4)加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。 倒掉废液后再于12000rpm离心2min ；(5)加入45uL的洗脱缓冲液(Elution buffer)或水，室温放置2min，12000rpm离 心。管底溶液即为回收的目的片断。2. 4. 2回收产物的连接和转化回收产物连接到pGEM T-Easy载体上，按照Promega公司pGEM_T Easy连接试剂 盒说明书进行操作。转化按照宝生物E. coli DH 5α感受态转化方法进行。(1)将回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体上，在离心管中分别加入下列成分回收产物4uL ；T载体IuL ；2 X T4Buffer 5uL ；T4 DNA连接酶(3U/uL) IuL ；轻轻混勻后 离心收集到管底，16°C过夜连接。(2)从-80°C冰箱中取IOOuL感受态细胞，室温下解冻后立即置冰上；(3)加入5uL连接产物，混勻，冰浴30min ；(4) 42°C水浴热击90s，迅速置于冰上冷却3 5min ；(5)向管中加入ImL LB液体培养基(不含Amp)，混勻后37°C振荡培养lh，使菌恢 复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp1O ；(6)将上述菌液摇勻后取200uL加入40uL X-gal及4uL IPTG混合均勻，涂布于含 Amp的筛选平板上。37°C倒置过夜培养。(7)白色菌落为重组子。2. 4. 3 质粒 DNA 提取将5mL含Amp (50mg/L)LB液体培养基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色单菌落 37 振荡过夜。质粒提取按照博大泰克公司试剂盒描述的方法进行。(1)取l-3mL在LB培养基中过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，弃尽上清。(2)用250uL已加入RNaseA的溶液I均勻悬浮细菌沉淀，室温放置5min ；(3)加入250uL溶液II，温和上下翻转4_6次混勻，使菌体充分裂解；(4)加入350uL溶液III，上下翻转6-8次混勻，12000rpm离心IOmin ；(5)吸取离心上清并转移到DNA制备管中，12000rpm离心Imin ；(6)将制备管放回离心管，加入500uL的Buffer Wl，12000rpm离心Imin ；弃滤液；(7)将制备管放回离心管，加入700uL的Buffer W2，12000rpm离心Imin ；弃滤液； 重复洗涤一次。(8)将制备管移入新的离心管中，在膜正中央加40-60UL水，室温静置Imin ； 12000rpm离心lmin。将收获的重组质粒于_20°C保存。2. 4. 4质粒的酶切鉴定根据pGEM T-Easy载体的图谱，选用EcoR I限制性内切酶对提取的质粒进行鉴 定。将酶切鉴定的阳性克隆对应的菌液，送往上海联合基因集团公司联众基因科技研究院 测序部进行测序。命名该载体为pGEM-T-Vefad2，在添加Amp的液体LB培养基中繁殖含该 载体的大肠杆菌E. coli DH 5α然后提取质粒就能大量生产该载体。2. 5含VeFAD2基因的表达载体构建将pGEM-T_XBfad2与表达载体pBI 121用Xbal I和BamH I双酶切。分别回收相应 的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化E. coli DH 5α感受态细胞。将菌液涂布在含Kan 的LB平板上，37°C倒置培养过夜。碱法提取质粒DNA，双酶切质粒来验证目的片段插入是否 正确。表达载体命名为pBI-fad2，全长15910bp，其特征在于所含VeFAD2基因能在植物、真 菌中表达，在添加Kan的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌E. coli DH 5α然后提 取质粒就能大量生产该载体。2. 6表达载体转化农杆菌采用冻融法，将表达载体pBI-fad2导入根癌农杆菌EHA105、AGL-1中。(1)取200uL感受态细胞，加入IOuL表达载体质粒，冰浴30min ；(2)液氮中速冻5min，迅速置于37°C水浴5min ；
(3)冰浴5min后，加入800uL LB液体培养基，180rpm 28°C培养3h后涂布在含有 相应抗生素的LB固体平板上，28°C培养1-2天。(4)挑选单菌落于含有相应抗生素的LB液体培养基中过夜培养，碱法提取农杆菌 质粒DNA。(5)以相应的菌液和质粒DNA为模板，进行PCR鉴定，判断目的片段是否插入到表 达载体上。PCR反应条件参照2. 3。经电泳检测表明2个农杆菌均已导入表达载体质粒pBI-fad2。2. 7农杆菌的活化及预培养从LB平板上挑取根癌农杆菌AGL-I或EHA105的单克隆菌落(均含质粒载体 pBI-fad2)，接种于LB液体培养基中(含50ug/ml卡那霉素，50ug/ml利福平)，180r/min, 28°C培养过夜，离心收集菌体，用等体积的IM诱导培养液重悬菌体，继续摇瓶预培养4-5h 至OD66tl为0. 6左右。2. 8真菌孢子悬液的制备用无菌蒸馏水从培养5-7d的PDA斜面培养基上洗下真菌孢子，三层擦镜纸过滤， 用适量蒸馏水稀释至OD66tl为0. 45左右(血球计数板计数，孢子浓度约为1. 0 X IO7个/mL)。2. 9共培养吸取50ul根癌农杆菌菌液与200ul少根根霉孢子悬液混合，只吸取IOul的混合 液，加入到IOOul的IM诱导培养液中稀释，混合均勻后，将稀释液全部涂布在铺有微孔滤膜 的IM固体培养基上(含200umol/L AS)，28°C暗培养24h。2. 10转化子的筛选将滤膜转移至选择培养基SMI平板上(含一定浓度的筛选剂和抑菌剂)，28 °C暗培 养24h后，随机挑取抗性菌丝转接到含更高浓度筛选剂的选择培养基SMII上，继续筛选至 再次出现抗性菌落。2.11转化子的PCR快速鉴定随机挑取SM II上的抗性菌落，接种于YEPD液体培养基，180r/min，28°C培养过 夜，收集菌体，采用氯化苄法提取转化子基因组DNA，并进行VeFAD2基因的PCR扩增(反应 体系与反应条件同2. 3)，根据能否扩增得到特异性片段来初步判断目的基因是否已转入少 根根霉中。2. 10 转化子的 PCR-Southern 鉴定PCR扩增同2. 3，回收纯化VeFAD2扩增产物，以未转化的野生菌作为阴性对照， 表达载体质粒pBI_fad2作为阳性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。按Roche公司的DIG High Prime DNALabeling and Detection Starter KitII操作步骤探针标记、转膜、杂交，最后进 行显影分析。杂交结果表明千年桐VeFAD2基因已整合到少根根霉基因组中。2. 11转基因产油脂少根根霉的发酵培养挑取保存于斜面的少量菌丝或孢子，于PDA斜面培养基上28°C培养3_5d，直至长 出大量孢子。用无菌水冲洗斜面上的孢子并用移液枪分别吸取50 μ 1接入50ml的液体种子 培养基中，于28°C，180r/min振荡培养24h。然后将种子液按10%的比例接种到装有发酵 培养基的250ml三角瓶中，三角瓶装液量均为为100ml，于28°C，180r/min振荡培养144h。2. 12油脂提取及脂肪酸成分测定
油脂提取利用酸热法提取油脂，脂肪甲酯化采用氢氧化钾_甲醇室温酯化法，油 脂脂肪酸组成及相对含量的气相色谱分析在Agilent 6890N气相色谱仪上测定。测定结果表明，转千年桐VeFAD2基因的少根根霉菌株的油酸含量均高于未转化的 野生型菌株，平均含量为38. 13%，最高含量为42. 44%，比对照提高了 26. 99%。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
1.一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是在丝状真菌基因组中含 有千年桐VeFAD2基因表达盒，该表达盒依次含有CaMV35S启动子、千年桐VeFAD2序列、终止 密码子，所述的丝状真菌是少根根霉；该方法的步骤如下(1)、含酶切位点千年桐VeFAD2基因cDNA编码区全长序列获得根据千年桐VeFAD2基因核苷酸序列设计引物，以千年桐未成熟种子总RNA为模板，经 RT-PCR扩增，在VeFAD2上游弓|入Xbal I酶切位点，下游弓|入BamH I酶切位点，电泳回收 VeFAD2基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5 α，测序，命名该载体 为 pGEM-T-Vefad2 ；(2)、VeFAD2反义表达载体构建结合表达载体PBI121的限制性酶切位点图谱，选用Xbal I和BamH I两个位置来作 为插入目的片段的酶切位点，设计带Xbal I和BamH I酶切位点的引物，以克隆载体质粒 pGEM-T-XBfad2为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300 —起均用Xbal I和 BamH I双酶切；分别回收相应的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化E. coli DH 5 α感受 态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pBI-fad2;(3)农杆菌转化子的获得采用冻溶法将重组表达载体pBI-fad2农杆菌菌株EHA105、AGL-I ；(4)少根根霉转化子的获得采用农杆菌介导法将VeFAD2K向导入少根根霉基因组，获得了转千年桐VeFAD2基因的 少根根霉工程菌株。
2.根据权利要求1所述的高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是PCR扩 增VeFAD2基因含酶切位点cDNA编码区全长，根据在GenBank上登录的VeFAD2基因核苷酸 和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下Vefad2FP :ATA GGA TCC ATG GGT GCT GGTVefad2RP :GCG TCT AGA TCA GAA CTT CCA其中Vefad2FP含酶切位点Xbal I, Vefad2 RP含酶切位点BamH I，以合成的cDNA为 模板，PCR扩增千年桐VeSAD2基因cDNA编码区；扩增条件为94°C预变性4min，94°C 30S、 54°C 30S、72°C lmin,30个循环，72°C延伸IOmin ；扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检 测。
3.根据权利要求1所述的高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，其特征是所述 的千年桐VeFAD2基因的产油酵母表达载体pBI-fad2反向插入了千年桐VeFAD2基因。
全文摘要
本发明涉及一种高产油酸的丝状真菌工程菌株的构建方法，反义千年桐VeFAD2基因构建在表达载体pBI121质粒上，以pBI121为基本骨架，将千年桐VeFAD2基因反向连接在该载体上，采用农杆菌介导法将VeFAD2基因反向转入少根根霉后，可以改变脂肪酸成分提高油酸含量。该方法的步骤如下(1)含酶切位点千年桐VeFAD2基因cDNA编码区全长序列获得；(2)VeFAD2反义表达载体构建；(3)农杆菌转化子的获得；(4)少根根霉工程菌株的获得。本发明有益的效果是本发明将从千年桐种子总RNA中分离的VeFAD2基因构建到表达载体pBI121上，并采用农杆菌介导法将VeFAD2基因反向导入少根根霉，使植物脂肪酸合成基因在酵母中高效表达，提高了油脂中油酸的含量。
文档编号C12N15/80GK101993881SQ20101016200
公开日2011年3月30日 申请日期2010年4月8日 优先权日2010年4月8日
发明者刘明靖, 吴开云, 李纪元, 李辛雷, 田敏, 范正琪 申请人:中国林业科学研究院亚热带林业研究所