具有粘度改变表型的丝状真菌的制作方法
【专利摘要】本发明描述的是与具有改变的生长特性的变异丝状真菌相关的组合物和方法。此类变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质。
【专利说明】具有粘度改变表型的丝状真菌
[0001]优先权
[0002]本专利申请要求于2011年4月22日提交的美国临时申请系列号61/478，162和61/478，160 以及各自于 2011 年 4 月 29 日提交的 61/480，610,61/480, 602 和 61/480，629的优先权，所述美国临时申请在此以引用的方式全文并入。
【技术领域】
[0003]本发明的菌株和方法涉及丝状真菌中的基因突变，该基因突变产生具有改变的生长特性的菌株变体。此类变体非常适于在深层培养中生长，例如用于大规模生产用于商业应用的酶和其他蛋白质或代谢物。
【背景技术】
[0004]丝状真菌能够高水平表达天然和异源蛋白质，从而使得它们非常适于大规模生产用于工业应用、医药应用、动物健康应用以及食品和饮料应用的酶和其他蛋白质。丝状真菌通常在生物反应器中的菌丝体深层培养中生长，该生物反应器适于将氧和营养物引入培养基(即，肉汤)内并在其中分布。菌丝体的形态特征影响肉汤的流变特性，从而影响生物反应器性能。
[0005]一般来讲，肉汤的粘度越高，氧气和营养物质的分布越不均匀，搅拌培养物所需的能量越高。在一些情况下，肉汤的粘度变得足够高而明显妨碍氧气和营养物质的溶解，从而不利地影响真菌的生长。另外，混合粘稠肉汤以及对粘稠肉汤进行充气所需的能量可大大增加生产成本，以及招致在马达和电源供应方面的资本支出较高。
【发明内容】
[0006]描述的是涉及丝状真菌的菌株和方法，所述丝状真菌具有产生粘度改变表型的遗传改变。
[0007]在一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含引起变异株的细胞与亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Tps2蛋白的遗传改变，其中变异株的细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。
[0008]在一些实施例中，功能性Tps2蛋白的改变量为减少量，并且变异株在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。
[0009]在一些实施例中，遗传改变包含亲本株中存在的tps2基因的破坏。在一些实施例中，tps2基因的破坏是tps2基因 的全部或部分缺失的结果。在一些实施例中，tps2基因的破坏是包含tps2基因的基因组DNA的一部分缺失的结果。在一些实施例中，tps2基因的破坏是tps2基因诱变的结果。
[0010]在一些实施例中，tps2基因的破坏使用位点特异性重组进行。在一些实施例中，tps2基因的破坏与在tps2基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
[0011]在一些实施例中，变异株不产生功能性Tps2蛋白。在一些实施例中，变异株不产生Tps2蛋白。
[0012]在一些实施例中，变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，变异株还含sfb3基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sebl基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含sfb3基因和sebl基因的破坏。在一些实施例中，变异株还包含至少一个选自以下的基因的破坏:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。
[0013]在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头抱霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、Geosmithia属物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(Trichoderma reesei)(此前分类为长梗木霉(Trichoderma1ngibrachiatum)和红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、解乌头酸曲霉(Aspergillus itaconicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus) > 酱油曲霉(Aspergillus sojae)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、多育赛多抱(Scedosporium pro lificans)、粗糖脉抱霉(Neurospora crassa)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、埃默森篮状菌(Talaromyces (Geosmithia) emersonii)、腐皮键刀菌(Fusarium venenatum)和Chrysosporium lucknowense。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。
[0014]在另一个方面，提供产生丝状真菌细胞变异株的方法，该方法包括:将遗传改变引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传改变改变了功能性Tps2蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。
[0015]在一些实施例中，遗传改变减少或防止功能性Tps2蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，该变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。
[0016]在一些实施例中，遗传改变包含使用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的tps2基因。在一些实施例中，遗传改变包含使用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的tps2基因。在一些实施例中，遗传改变使用位点特异性遗传重组进行。
[0017]在一些实施例中，tps2基因的破坏与在tps2基因的基因座处引入选择性标记组合进行。在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。在一些实施例中，tps2基因的破坏与破坏sfb3基因组合进行。在一些实施例中，tps2基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。
[0018]在一些实施例中，变异株每单位量生物质产生与亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。
[0019]在一些实施例中，丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。在一些实施例中，丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种、曲霉属(Aspergillus)物种、镰刀菌属(Fusarium)物种、足放线病菌属(Scedosporium)物种、青霉属(Penicillium)物种、金孢子菌属(Chrysosporium)物种、头抱霉属(Cephalosporium)物种、篮状菌属(Talaromyces)物种、白乔史密斯霉属(Geosmithia)物种和链孢霉属(Neurospora)物种。在一些实施例中，丝状真菌可包括但不限于里氏木霉(此前分类为长梗木霉和红褐肉座菌)、黑曲霉、烟曲霉、解乌头Ife曲霉、米曲霉、构桌曲霉、土曲霉、醫油曲霉、日本曲霉、多育赛多抱、粗糖脉孢霉、绳状青霉、产黄青霉、埃默森篮状菌、腐皮镰刀菌和勒克瑙金孢菌(Chrysosporiumlucknowense)。在一些实施例中，丝状真菌为里氏木霉。
[0020]在一些实施例中，亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。在一些实施例中，在引入减少或防止功能性Tps2蛋白的产生的遗传改变之前，编码所关注的蛋白质的基因存在于亲本株中。在一些实施例中，亲本株内的所关注的蛋白质由内源基因或异源基因编码。
[0021]在另一方面，提供由上述变异株中任一者产生的所关注的蛋白质。
[0022]在又一方面，提供由上述方法中任一者产生的且具有上述特性中任一者的丝状真菌。
[0023]在另一个方面，提供衍生自亲本株的丝状真菌变异株，该变异株包含:(a)遗传改变，所述遗传改变使得(i)与亲本`株的细胞相比，需要减少的搅拌来保持深层培养物中预选的溶氧量，和/或(ii)与亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处保持深层培养物中增加的溶氧量；和(b)编码所关注的蛋白的基因，其中所述编码所关注的蛋白的基因在(a)中的遗传改变之前存在于变异株中。
[0024]在一些实施例中，所得的变异株的遗传改变包含亲本株中存在的tps2基因的破坏。在一些实施例中，tps2基因的破坏与在tps2基因的基因座处引入选择性标记组合进行。在一些实施例中，tps2基因的破坏与破坏sfb3基因组合进行。在一些实施例中，tps2基因的破坏与破坏sebl基因组合进行。在一些实施例中，tps2基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。
[0025]根据本说明书包括附图，本发明的变异株和方法的这些及其他的方面和实施例将是显而易见的。
[0026]附图简述
[0027]图1为如实例I中所述的tps2破坏载体pRATT251_tps2D_pyr2的图谱。
【具体实施方式】
[0028]1.综沭
[0029]本发明的菌株和方法涉及具有可影响其形态和生长特性的遗传修饰的丝状真菌细胞变异株。当在深层培养中培养该变异细胞时，其产生与包含亲本株细胞的细胞肉汤相比具有不同流变特性的细胞肉汤。这些变异株中的一些非常适于大规模生产酶及其他在商业上重要的蛋白质。
[0030]IL 穿 SL
[0031]在详细描述本发明菌株和方法之前，为了清楚起见对如下术语进行定义。未定义的术语应该与它们在相关领域中所用的普通含义一致。
[0032]如本文所用，“里氏木霉”是指子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门的丝状真菌。该生物体此前被分类为长梗木霉或被分类为红褐肉座菌。
[0033]如本文所用，短语“丝状真菌细胞的变异株”或类似短语是指例如通过遗传操作，衍生自(即得自或可得自)属于盘菌亚门的亲本(或参照)株的丝状真菌细胞的菌株。在本说明书中，亲本株和变异株可描述为具有某些特性，例如遗传修饰、表达变型、形态等；然而，技术人员应当理解在技术上具有此类特性的亲本株或变异株的细胞和“菌株”为了方便起见而提及。
[0034]如本文所用，术语“所关注的蛋白质”是指期望在丝状真菌中表达的多肽。此类蛋白质可以是酶、底物结合蛋白质、表面活性蛋白质、结构蛋白质等，并且可以高水平表达，并且可用于商业化的目的。所关注的蛋白质可由相对于变异株和/或亲本株的内源基因或异源基因编码。所关注的蛋白质可在细胞内表达或作为分泌性蛋白表达。
[0035]如本文所用，短语“基本上无活性”或类似短语，意指特定的活性在混合物中不能检测到或者其存在量不会干扰该混合物的预期目的。
[0036]如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”(和/或它们各自的复数形式)可互换使用来指包含肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文中使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。该聚合物可以是线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。所述术语还涵盖天然改性或通过干预改性的氨基酸聚合物；所述干预例如是二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或改性，如与标记组分缀合。还包括在该定义中的是例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
[0037]如本文所用，功能上和/或结构上类似的蛋白质被视为“相关蛋白质”。此类蛋白质可衍生自不同属和/或种的生物体、或甚至不同纲的生物体(例如细菌和真菌)。相关蛋白还涵盖通过一级序列分析确定、通过二级或三级结构分析确定或通过免疫交叉反应确定的同源物。
[0038]如本文所用，术语“衍生的多肽/蛋白质”是指通过在N末端或C末端任一端或这两个末端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列中的一个或多个不同位点置换一个或多个氨基酸、在蛋白质的任一端或两个末端或在氨基酸序列中的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸和/或在氨基酸序列中的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而衍生自或可衍生自蛋白质的蛋白质。可通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化进合适的宿主中并使该经修饰的DNA序列表达而形成衍生的蛋白质来实现蛋白质衍生物的制备。
[0039]相关(和衍生)蛋白质包括“变体蛋白质”。变体蛋白质通过在少数氨基酸残基处的置换、缺失和/或插入而不同于参考蛋白质/亲本蛋白质(例如野生型蛋白质)。变体蛋白与亲本蛋白质间的差异氨基酸残基的数目可以为一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多个氨基酸残基。变体蛋白可与参照蛋白具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或甚至至少约99或更多的氨基酸序列同一性。变体蛋白与参照蛋白的差别还可在于所选的基序、结构域、表位、保守区等等。
[0040]如本文所用，术语“类似序列”是指蛋白质内提供与所关注的蛋白质(即通常是所关注的起始蛋白质)类似的功能、三级结构和/或保守残基的序列。例如，在含有α-螺旋或β_片层结构的表位区域中，类似序列中的置换氨基酸优选维持相同的特异性结构。该术语还指核苷酸序列以及氨基酸序列。在一些实施例中，开发类似序列使得置换氨基酸导致显示类似或改善功能的变体酶。在一些实施例中，所关注蛋白质中的氨基酸的三级结构和/或保守残基位于或接近所关注的区段或片段。因而，若所关注的区段或片段含有例如α -螺旋或β -片层结构，则置换氨基酸优选维持该特异性结构。
[0041]如本文所用，术语“同源蛋白”是指具有与参照蛋白类似的活性和/或结构的蛋白质。同源物不一定是进化相关的。因而，预期该术语涵盖从不同生物体获得的相同、类似或对应的酶(例如，就结构和功能而言)。在一些实施例中，希望鉴定具有与参照蛋白类似的四级、三级和/或一级结构的同源物。在一些实施例中，同源蛋白可诱导与参照蛋白类似的免疫应答。在`一些实施例中，同源蛋白经工程改造而产生具有所需活性的酶。
[0042]序列间的同源性程度可使用本领域中已知的任何合适的方法确定(参见例如 Smith 和 Waterman(1981)Adv.Appl.Math《高等应用数学》2:482 ；Needleman 和Wunsch (1970) J.Mol.Biol《分子生物学杂志》，48:443 ；Pearson 和 Lipman (1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国国家科学院院刊》，85:2444 ;程序，诸如在威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package,得自威斯康星州麦迪逊市遗传学计算机小组(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA ；和Devereux 等人(1984)Nucleic Acids Res《核酸研究》12:387-95)。
[0043]例如，PILEUP是测定序列同源性水平的有用程序。PILEUP利用渐进性双序列比对从一组相关序列产生多序列比对。其还可绘出关系树，该关系树示出了用于产生比对的聚类关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进式比对方法(Feng和Doolittle，(1987)，(J.Mol.Evol《分子进化杂志》35:351-60)的简化版。该方法类似于Higgins和Sharp ((1989) CABIOS 5:151-53)所描述的方法。可用的PILEUP参数包括:默认空位权重=3.00，默认空位长度权重=0.10，以及加权的末端空位。可用的算法的另一例子是由Altschul 等人((1990) J.Mol.Biol《分子生物学杂志》215:403-10)和 Karlin 等人，((1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国国家科学院院刊》90:5873-87)描述的BLAST算法。一种特别有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(参见，例如，Altschul等人(1996)Meth.Enzymol《酶学方法》266:460-80)。参数“W”、“T”和“X”决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用下述作为缺省值:字长(W) 11、BL0SUM62评分矩阵(参见，例如，Henikoff和Henikoff (1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国国家科学院院刊》89:10915)比对(B) 50次、期望值(E) 10、W 5、K -4和两条链的比较。
[0044]如本文所用，在至少两个核酸或多肽的背景下，短语“基本上相似”和“基本上相同”通常意指与参照(例如野生型)序列相比，多核苷酸或多肽包含具有至少约70%同一性、至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一^丨生、至少约92%同一丨丨生、至少约93%同一丨丨生、至少约94%同一‘丨生、至少约95%同一‘丨生、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或甚至至少约99%同一性或更高同一性的序列。序列同一性可用已知的程序如BLAST、ALIGN和CLUSTAL，使用标准参数测定。(参见，例如，Altschul 等人(1990) J.Mol.Biol《分子生物学杂志》215:403-410);Henikoff等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国国家科学院院刊》89:10915 ;Karin 等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA《美国国家科学院院刊》90:5873 ;以及 Higgins 等人(1988) Gene《基因》73:237-244)。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)公开获得。另外,可使用FASTA对数据库进行搜索(Pearson 等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA《美国国家科学院院刊》85:2444-48)。两个多肽基本上相同的一个指示是第一多肽与第二多肽是免疫交叉反应性的。通常，差别在于保守氨基酸置换的多肽是免疫交叉反应性的。因而，例如，若两个肽差别仅在于保守置换，则多肽基本上与第二多肽相同。两种核酸序列基本上一致的另一个指示是两种分子在严格的条件(如，在中至高严格度的范围内)下彼此杂交。
[0045]如本文所用，术语“基因”与术语“等位基因”在关于编码和引导蛋白质或RNA表达的核酸时是同义的。丝状真菌的营养体形式通常是单倍体，因而单拷贝的指定基因(即单个等位基因)足以赋予指定表型。
[0046]如本文所用，术语“野生型的”和“天然的”可互换使用并且是指自然中存在的基因、蛋白质或株系。
[0047]如本文所用，“缺失基因”是指从宿主细胞的基因组移除基因。当基因包括未紧邻基因的编码序列的控制元件(例如，增强子元件)时，基因的缺失是指编码序列的缺失，以及任选的相邻增强子元件(包括但不限于例如启动子和/或终止序列)的缺失。
[0048]如本文所用，“基 因的破坏”泛指在宿主细胞中基本上防止细胞产生功能基因产物，例如蛋白质的任何遗传或化学操作，即突变。破坏方法的例子包括完全或部分缺失基因的任何部分，包括多肽编码序列、启动子、增强子或另一调控元件，或者诱变上述者，其中诱变涵盖置换、插入、缺失、倒位以及它们的组合和变型形式，上述突变中的任一者可基本上防止功能基因产物的产生。基因还可使用RNA1、反义或废止基因表达的任何其他方法来破坏。
[0049]如本文所用，术语“遗传操作”和“遗传改变”可交换使用并且是指核酸序列的改变/变化。该改变可包括但不限于核酸序列中的至少一个核酸的置换、缺失、插入或化学修饰。
[0050]如本文所用，“好氧发酵”是指在存在氧气的情况下的生长。
[0051]如本文所用，术语“细胞肉汤”统指液体/深层培养物中的培养基和细胞。
[0052]如本文所用，术语“细胞群(cell mass) ”是指液体/深层培养物中存在的细胞组分(包括完整的和溶解的细胞)。细胞群可以干重或湿重表示。
[0053]如本文所用，术语“流变学”是指研究物质形变和流动的物理学分支。
[0054]如本文所用，“粘度”是流体对机械应力(如剪切应力或拉伸应力)引起的形变的抗性的量度。在本发明背景下，粘度还可指包含丝状真菌细胞的细胞肉汤对例如通过转子/叶轮所提供的机械应力的抗性。由于细胞肉汤的粘度可能难以直接测量，可使用粘度的间接量度，如在预选的搅拌量处培养物肉汤的溶氧量、维持预选溶氧量所需的搅拌量、搅拌细胞肉汤以维持所选溶氧量所需的能量量或甚至是固体培养基上的集落形态。[0055]如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度改变”变异株是指产生这样的细胞肉汤的变异株，该细胞肉汤与亲本株产生的等价细胞肉汤相比具有减少的或增加的粘度(即，减少的或增加的对剪切或拉伸应力的抗性)。一般来讲，相当的细胞肉汤或等价的细胞肉汤具有相当的细胞群。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。本发明描述了用于比较丝状真菌细胞肉汤的粘度的方法。
[0056]如本文所用，丝状真菌细胞的“粘度降低”变异株是指产生这样的细胞肉汤的变异株，该细胞肉汤与亲本株产生的等价细胞肉汤相比具有减少的粘度(即减少的对剪切或拉伸应力的抗性)。优选地，关于粘度的任何直接或间接量度，粘度改变的变异株与亲本株之间的差别为至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、或甚至至少50%或更多。
[0057]如本文所用，“溶氧”(DO)是指以体积/体积单位测量的液体培养基中存在的氧(O2)量。在整个发酵过程中，溶氧水平可维持在高的水平，例如170-100%至20%之间、100-80%至20%之间、70%至20%之间、65%至20%之间、60%至20%之间、55%至20%之间、50%至20%之间、45%至20%之间、44%至20%之间、43%至20%之间、42%至20%之间、41%至20%之间、40%至20%之间、35%至20%之间、30%至20%之间以及25%至20%之间。具体地讲，溶氧可在发酵开始时高并且允许随着发酵进行而下降。溶解氧水平可受在其下搅拌例如搅动发酵的速率和/或受空气或氧的添加速率控制。培养物可以400-700rpm搅拌例如搅动，并且溶解氧水平通过改变空气或氧流速和叶轮速度维持超过20%、超过25%、超过30%、超过35%、超过40%、超过45%、超过50%和超过55%或更多。
[0058]如本文所用，“主要遗传定子 ”是指基因或其遗传操作，该基因或其遗传操作是在缺少其他基因或其他基因的遗传操作的情况下赋予指定表型所必要且充分的。然而，特定基因是赋予指定表型所必要且充分的并不排除可通过进一步的遗传操作实现对表型的附加影响的可能性。
[0059]如本文所用，“功能性多肽/蛋白质”为具有活性，例如酶活性、结合活性、表面活性性质等，并且尚未被诱变、截短或以其他方式修饰来废止或降低该活性的蛋白质。如所指定的，功能性多肽可以是热稳定性的或不耐热的。
[0060]如本文所用，“功能性基因”为能够被细胞组分用于产生活性基因产物，通常是蛋白质的基因。功能性基因是被破坏的基因的对立物，被破坏的基因被修饰而使得它们不能被细胞组分用于产生活性基因产物，或者具有降低的被细胞组分用于产生活性基因产物的能力。
[0061]如本文所用，如果变异株与亲本株之间蛋白质的表达差异小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约7%、小于约5%、或甚至小于约3%，则相比于亲本株，变异细胞“维持或保持高的蛋白质表达和/或分泌水平”。
[0062]如本文所用，如果宿主细胞已通过遗传方式或化学方式改变而防止产生表现具有野生型蛋白质的特征性活性，尤其是促进菌丝伸长或以其他方式增加液体培养物中丝状真菌的粘度的活性的功能性蛋白质/多肽，则宿主细胞已经“经过修饰而防止产生规定的蛋白质”。此类修饰包括但不限于缺失或破坏编码该蛋白质的基因、修饰该基因而使得所编码的多肽缺少上述活性、修饰该基因以影响翻译后加工或稳定性、以及它们的组合。[0063]如本文所用，“所关注的蛋白质”为期望在丝状真菌细胞的深层培养中产生的蛋白质。一般来讲，所关注的蛋白质在商业上对于工业用途、医药用途、动物健康用途以及食品和饮料用途而言是重要的，从而使得期望它们大量产生。要将所关注的蛋白质与由丝状真菌细胞表达的众多其他蛋白质区分开，后者通常不作为产物被关注，并且主要被视为本底蛋白质污染物。
[0064]如本文所用，若相比于亲本株产生的蛋白量，变异株产生的蛋白量减少不超过20%、减少不超过15%、减少不超过10%或甚至减少不超过5%，其中蛋白量被归一化为测定了蛋白产量的细胞的生物质总量，其中生物质可用湿重(如，细胞团块)或干重方式表示，则变异株每单位量生物质产生与亲本株“基本上等量”的蛋白质。
[0065]如本文所用，若相比于亲本株，变异株产生的蛋白量增加至少5%、增加至少10%、增加至少15%或更多，其中蛋白量被归一化为测定了蛋白产量的细胞的生物质总量，其中生物质可用湿重(如，细胞团块)或干重方式表示，则变异株较之亲本株“每单位量生物质产生基本上更多的蛋白质”。
[0066]如本文所用，“荧光染料”为发荧光的染料。优选的荧光染料与真菌细胞壁中的纤维素和/或几丁质结合。
[0067]如本文所用，单数冠词“一个”、“一种”和“所述”涵盖多个指代物，除非上下文明确指明不是这样。特此以引用的方式将本文所引用的所有参考文献全文并入本文。如下缩写/首字母缩写具有如下含义，除非另外规定: [0068]
【权利要求】
1.一种衍生自亲本株的丝状真菌变异株，所述变异株包含引起所述变异株的细胞与所述亲本株的细胞相比产生改变量的功能性Tps2蛋白的遗传改变，其中所述变异株的细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。
2.根据权利要求1所述的变异株，其中所述功能性Tps2蛋白的改变量为减少量，并且所述变异株在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。
3.根据权利要求1或2所述的变异株，其中所述遗传改变包含所述亲本株中存在的tps2基因的破坏。
4.根据权利要求3所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏是所述tps2基因的全部或部分缺失的结果。
5.根据权利要求3所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏是包含所述tps2基因的基因组DNA的一部分缺失的结果。
6.根据任何权利要求3所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏是所述tps2基因诱变的结果。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏使用位点特异性重组进行。
8.根据权利要求3至7中任一项`所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏与在所述tps2基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生功能性Tps2蛋白。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的变异株，其中所述变异株不产生Tps2蛋白。
11.根据权利要求ι-?ο中任一项所述的变异株，其中所述变异株还包含编码所关注的蛋白质的基因。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的变异株，其还包含sfb3基因的破坏。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的变异株，其还包含至少一个选自以下的基因的破坏:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gas I基因和crzl基因。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的变异株，其中所述变异株每单位量生物质产生与所述亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌为盘菌亚门(Pezizomycotina)物种。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌为木霉属(Trichoderma)物种。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的变异株，其中所述丝状真菌为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
18.—种产生丝状真菌细胞变异株的方法，其包括:将遗传改变引入丝状真菌细胞的亲本株中，与所述亲本株的细胞相比所述遗传改变改变了功能性Tps2蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要改变的搅拌量来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持改变的溶氧量。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述遗传改变减少或防止功能性Tps2蛋白的产生，从而产生变异丝状真菌细胞，所述变异丝状真菌细胞在深层培养中的好氧发酵过程中产生这样的细胞肉汤，所述细胞肉汤(i)与所述亲本株的细胞相比，需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持增加的溶氧量。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述遗传改变包含使用遗传操作破坏亲本丝状真菌细胞中的所述tps2基因。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述遗传改变包含使用遗传操作缺失亲本丝状真菌细胞中的所述tps2基因。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述遗传改变使用位点特异性遗传重组进行。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述tps2基因的破坏与在所述tps2基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
24.根据权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述tps2基因的破坏与破坏所述sfb3基因组合进行。
25.根据权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述tps2基因的破坏与至少一个选自以下的基因的破坏组合进行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。`
26.根据权利要求18-25中任一项所述的方法，其中所述变异株每单位量生物质产生与所述亲本株基本上相同量或更多的蛋白质。
27.根据权利要求18-26中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌为盘菌亚门物种。
28.根据权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌为木霉属物种。
29.根据权利要求18-28中任一项所述的方法，其中所述丝状真菌为里氏木霉。
30.根据权利要求18-29中任一项所述的方法，其中所述亲本株还包含编码所关注的蛋白质的基因。
31.根据权利要求30所述的方法，其中在引入所述减少或防止功能性Tps2蛋白的产生的遗传改变之前，所述编码所关注的蛋白质的基因存在于所述亲本株中。
32.—种所关注的蛋白质，其由根据权利要求11所述的变异株产生。
33.一种丝状真菌变异株，其通过根据权利要求18-31中任一项所述的方法产生。
34.一种衍生自亲本株的丝状真菌变异株，其包含: (a)遗传改变，所述遗传改变导致(i)与所述亲本株的细胞相比，在深层培养物中需要减少的搅拌来维持预选的溶氧量，和/或(ii)与所述亲本株的细胞相比，在预选的搅拌量处维持深层培养物中增加的溶氧量，和 (b)编码所关注的蛋白质的基因， 其中所述编码所关注的蛋白质的基因在(a)中的所述遗传改变之前存在于所述变异株中。
35.根据权利要求34所述的变异株，其中所述遗传改变包含所述亲本株中存在的所述tps2基因的破坏。
36.根据权利要求35所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏与在所述tps2基因的基因座处引入选择性标记组合进行。
37.根据权利要求35或36所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏与破坏至少一个选自以下的基因组合进行:sfb3基因、sebl基因、mpgl基因、gasl基因和crzl基因。
38.根据权利要求35-37中任一项所述的变异株，其中所述tps2基因的破坏与破坏所述sebl基因组合进行。`
【文档编号】C12N1/14GK103517981SQ201280019432
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月22日
【发明者】E·A·博迪, R·J·普莱特二世 申请人:丹尼斯科美国公司