具有选择性自噬途径的灭活组分的丝状真菌细胞及其使用方法
【专利说明】具有选择性自噬途径的灭活组分的丝状真菌细胞及其使用 方法
[0001 ] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及经修饰的丝状真菌细胞以及使用此类经修饰的丝状真菌细胞用于生 产生物化合物如多肽（例如，酶）的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 自噬是真核细胞中的一种系统，其中使用液泡/溶酶体消化细胞质组分和细胞 器。自噬与饥饿期间连同生长和发育中的营养再循环连同其他细胞事件相关联。自噬机 制是复杂的，并且可涉及被指定为以下各项的超过30个自基因的相互作用：atgl、atg2、 atg3、atg4、atg5、atg6、atg7、atg8、atg9、atgl0、atgll、atgl2、atgl3、atgl4、atgl5、atgl6、 atgl7、atgl8、atgl9、atg20、atg21、atg22、atg23、atg24、atg25、atg26、atg27、atg28、 atg29、atg30、和atg31 基因D
[0006] 自噬和这些自噬基因中的许多的作用已经在大量的真核细胞中（包括在酵母 和丝状真菌中）进行了研究。马滕（Marten)等人，"在丝状真菌中的自(Autophagy infilamentousfungi)"，真菌遗传学和生物学（FungalGeneticsandBiology)， 46(2009)，1-8 ;艾斯丘（Askew)等人，"在烟曲霉中金属离子缺乏型与自噬之间的不 期望的耳关系(UnexpectedlinkbetweenMetalIonDeficiencyandAutophagyin Aspergillusfumigatus)"，真核细胞（EukaryoticCell)，2007 年 12 月，2437-2447 ;北元 (Kitamoto)等人，"ATG8同源物Aoatg8的功能分析以及自在米曲霉的分化和发生中的 作用（FunctionalanaylysisoftheATG8HomologoueAoatg8andRoleofAutophagy inDifferentiationandGerminationofAspergillusoryzae)''，真核细胞（Eukaryotic Cell)，2006 年 8 月，1328-1336;北元（KitamotoK.)和菊间T(KikumaT)，"通过破坏 Aoatgl3、Aoatg4、和Aoatgl5 基因分析在米曲霉中的自卩麓（Analysisofautophagyin AspergillusoryzaebydisruptionofAoatgl3,Aoatg4,andAoatgl5genes)"，FEMS微 生物学通讯（FEMSMicrobiolLett)316(2011)61_69;歌林斯凯（Klionsky)等人，"Atgl 激酶复合体参与蛋白招募的调控以起始对酿酒酵母中的非特异性自噬的囊泡形成的隔绝 (TheAtglKinaseComplexIsInvolvedintheRegulationofProteinRecruitment toInitiateSequesteringVesicleFormationforNonspecificAutophagyin Saccharomycescerevisiaes)"，细胞分子生物学细胞（MolecularBiologyofthe Cell)，第19卷，2008年2月19日，668-681;范德尔（vanderKlei)，"自噬缺陷促进 旦_ 乳胺在产黄青霉中的产生（AutophagyDeficiencyPromotes0-LactamProduction inPeniciliumchrysogenum) "，应用与环境微生物学（AppliedandEnvironmental Microbiology)，第 77 卷，2011 年 2月 4 日，1413-1422;歌林斯凯（Klionsky)等人，"在 酵母酿酒酵母中肌动蛋白细胞骨架是选择性自噬类型所需要的，但非特异性自噬并不需 要（TheActinCytoskeletonIsRequiredForSelectiveTypesofAutophagy,but NotNonspecificAutophagy,intheYeastSaccharomycescerevisiae) "，细胞分子 生物学（MolecularBiologyoftheCell)，第 16 卷，2005 年 12 月，5843-5865;歌林斯 凯D.J.(KlionskyD.J.)和张H.(CheongH.)，"Atgl在酿酒酵母中调节自-特异性 PAS组装的双重作用（DualroleofAtglinregulationofautophagy-specificPAS assemblyinSaccharomycescerevisiae)"，自IM(Autophagy)J=S, 2008 年 7月，724-726; 钟（Chung)等人，"ATG1和自噬调节剂通过负向调节S6激酶抑制细胞生长（ATG1，and autophagyregulator,inhibitcellgrowthbynegativelyregulatingS6kinase) '，， ￡]\^0报告出]\^0 1印〇竹8)，第8卷，第4期，（2007)，360-365;水岛（]\^21181111^)，"3七81/ ULKl复合物在自卩策调节中的作用（Theroleoftheatgl/ULKlcomplexinautophagy regulation)"，细胞生物学当前观点（CurrentOpinionCellBiology)，22:132-139 (2010); 北元（Kitamoto)等人，"Aoatgl的功能分析以及在米曲霉中Cvt途径的检测（Functional analysisofAoatglanddetectionoftheCvtpathwayinAspergillusoryzae) '，， (2012);歌林斯凯D.(KlionskyD.)&尾上松T(YorimitsuT)，"Atgll将货物与细胞质至 液泡革向途径中的囊泡形成机制相联系（AtgllLinksCargototheVesicle-forming MachineryintheCytoplasmtoVaculoeTargetingPathway) "，细胞分子生物学 (MolecularBiologyoftheCell)，第 16 卷，2005 年 4月 16 日，159301605;以及K?铃木 (K.Suzuki)，"在芽殖酵母中的选择性自卩策（Selectiveautophagyinbuddingyeast)"， 细胞死亡和分化（CellDeathandDifferentiation) (2013)20,43-48。
[0007] 然而，自噬系统和自噬基因的全部作用尚未完全阐明。
[0008] 发明概述
[0009] 本发明涉及经遗传修饰的丝状真菌宿主细胞，其中一种丝状真菌细胞的该选择性 自噬系统已经部分或完全失活，并且涉及在此类经修饰的宿主细胞中多肽的产生。丝状真 菌细胞的选择性自噬系统的失活导致感兴趣的生物产品（如一种感兴趣的多肽）的表达产 量增加。在一个具体实施例中，本发明提供了一种经修饰的丝状真菌宿主细胞，包括一种部 分或完全失活的选择性自噬系统，其中该经修饰的丝状真菌宿主细胞已经用编码感兴趣的 生物产品的基因（如编码一种感兴趣的多肽（例如酶）的基因）进行转化。在一种丝状真 菌细胞中该选择性自噬系统的活化可以通过缺失或破坏参与丝状真菌细胞的选择性自噬 途径的一种或多种基因/蛋白（atg基因/蛋白质）来完成，包括通过缺失、破坏、或沉默存 在于该丝状真菌细胞中的内源atgll活性和/或通过缺失或破坏直接或间接地参与该丝状 真菌细胞的选择性自噬途径中的atgll活性的一种或多种基因/蛋白。
[0010] 本发明涉及经遗传修饰的丝状真菌宿主细胞，其中丝状真菌细胞的atgll活性已 经例如通过缺失或破坏存在于该丝状真菌细胞中的内源atgll基因的表达而被缺失、破坏 或沉默。丝状真菌宿主细胞中的atgll活性的缺失、破坏或沉默导致感兴趣的生物产品（如 感兴趣的多肽）的表达产量增加。在一个具体实施例中，本发明提供了一种经修饰的丝状 真菌宿主细胞，该细胞包括一种缺失或破坏或沉默的atgll基因，该丝状真菌宿主细胞已 经用编码感兴趣的生物产品的基因（如编码一种感兴趣的多肽（例如酶）的基因）进行转 化。
[0011] 本发明还提供了用于生产经修饰的丝状真菌宿主细胞的方法，其中该真菌细胞的 atgll活性已经被缺失或破坏或沉默。在一个具体实施例中，本发明提供了一种用于生产丝 状真菌宿主细胞的方法，该方法包括缺失或破坏丝状真菌细胞中的atgll基因。在另一个 实施例中，本发明提供了一种用于生产丝状真菌宿主细胞的方法，该方法包用编码感兴趣 的生物产品（如感兴趣的多肽）的表达载体来转化丝状真菌细胞，并且其中该丝状真菌细 胞已经被修饰或被进一步修饰以包括该atgll基因的缺失或破坏或沉默。
[0012] 本发明进一步提供了用于生产感兴趣的生物化合物的方法，这些方法包括使用经 修饰的丝状真菌宿主细胞重组生产感兴趣的多肽，其中该真菌细胞的atgll活性已经缺失 或破坏。在一个具体实施例中，本发明包括培养一种包括编码感兴趣的多肽的基因的丝状 真菌细胞，其中该真菌细胞的atgll基因已经缺失或破坏。该培养发生在有益于诱导感兴 趣的异源多肽的条件下，可以从培养基中回收该异源多肽以用在一个或多个应用中，或可 替代地，可以将包含感兴趣的多肽的培养基或发酵液用于一个或多个应用中。
[0013] 可以应用本发明的这些宿主细胞和方法以产生任何感兴趣的生物产品。在具体 的实施例中，这些经修饰的丝状宿主细胞和方法被应用以产生一种感兴趣的多肽，如激素、 酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报告基因。本发明的具体实施例针对将本发明的经修 饰的丝状真菌宿主细胞和方法用在重组生产感兴趣的酶中。
[0014] 发明的详细说明
[0015] 定义
[0016] Atgll:术语"atgll"是指自噬相关蛋白，其被认为是一种参与选择性自噬的适配 器蛋白。Atgll蛋白和编码核酸序列的实例在本领域中是已知的，并且包括例如，具有SEQ IDN0:2的氨基酸的黑曲霉atgll蛋白，如由SEQIDNO: 1中所示的核酸序列所编码。其 他atgll蛋白和基因已经如例如在米曲霉和构巢曲霉中进行了表征。因为在真菌细胞中 atgll基因以及蛋白是结构上和功能上相似的，在其他真菌宿主中其他atgll基因和蛋白 (atgll基因和蛋白质同源物）可以使用常规分子生物学方法来鉴定。本领域中普通技术 人员还应当认识到atgll序列的变化可以发生在不同的细胞系中，这不会改变该蛋白质功 能。
[0017] 生物产品：术语"生物产品"是指在一种丝状真菌宿主细胞中产生的任何感兴趣的 产物。该生物产品可以是如下表达产物，其产量通过选择性的自噬途径的部分或完全失活 (例如，通过atgll的缺失或破坏）来直接增加；或一种产品，它产生自通过选择性的自噬 途径的失活（例如，通过该atgll活性破坏或缺失）直接增加的一种表达产物的作用。
[0018] cDNA:术语"cDNA"是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0019] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0020] 控制序列：术语"控制序列"意指对于编码成熟多肽的多核苷酸的表达为必要的核 酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的（即，来自相同基因） 或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不 限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制 序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种 多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多 个接头。术语"控制序列"在此被定义为包括对于一种多肽的表达而言必要或有利的所有 组分。
[0021 ] 该控制序列可以是适当的启动子序列，即由宿主细胞识别以表达核酸序列的一种 核酸序列。该启动子序列包括介导多肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在所选择的 宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的及杂合的启动子，并且可 以是从编码与该宿主细胞同源抑或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
[0022] 用于指导该核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的适合启动子的实例是从 米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶