组成型大豆启动子的制作方法
【专利说明】组成型大豆启动子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请61/790, 907的权益，其内容通 过引用以其全文结合在此。
[0003] 以电子方式提交的序列表的参考
[0004] 通过EFS-Web以电子方式提交ASCII格式的序列表副本，其文件名为 "2912939-20179TO01_Sequence_Listing.txt"，创建于 2014 年 3 月 10 日，文件大小为 4. 14 千字节，并与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分 并通过引用以其全文结合在此。 发明领域
[0005] 本发明涉及植物分子生物学领域，更具体而言涉及植物中调控元件的识别和使 用。
[0006] 发明背景
[0007] 当前存在对转基因植物的高度需求，这些转基因植物通过生物技术以高水平或可 诱导水平表达重要蛋白产物。对作物植物进行操作以改变和/或改善表型特征（例如生产 率或质量）需要在植物组织中表达异源基因。该基因操作由于以下两个发现已经成为可 能，即将异源遗传物质转化进植物细胞的能力，以及存在能够驱动异源遗传物质表达的启 动子。
[0008] 最常用的启动子是胭脂碱合酶（NOS)启动子（艾伯特等人，美国国 家科学院院刊 84:5745-5749(1987))任匕6^6七31，？代(3.他七1^〇3(1.5(^. U.S.A. 84:5745-5749 (1987));章鱼碱合酶（OCS)启动子，花椰菜花叶病毒启动子，如 花椰菜花叶病毒（CaMV) 19S启动子（劳顿等人，植物分子生物学9:315-324 (1987)) (Lawtonetal,PlantMol.Biol. 9:315-324(1987));CaMV35S启动子（奥德尔等 人，自然 313:810-812(1985))(Odelletal，Nature313:810-812(1985))，以及玄 参花叶病毒35S启动子（桑格尔等人，植物分子生物学14:433-43 (1990))(Sanger etal，PlantMol.Biol. 14:433-43(1990));来自核酮糖二磷酸羧化酶小亚基的光 诱导型启动子（佩莱格里内斯基等人，生物化学学会会刊23(2):247-250(1995)) (Pellegrineschietal. ,Biochem.Soc.Trans. 23 (2) :247-250 (1995));Adh启动子（沃 克等人，美国国家科学院院刊84:6624-66280(1987))(^11?^6七31，？1〇(3.恥七1.六〇 &(1. Sci.U.S.A. 84:6624-66280 (1987));蔗糖合酶启动子（杨等人，美国国家科学院院刊 87:4144-4148(1990))(Yangetal,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87:4144-4148 (1990))；R 基因复合物启动子（钱德勒等人，植物细胞1:1175-1183(1989))(Chandleretal，Plant Cell1:1175-1183(1989));叶绿素a/b结合蛋白基因启动子；等等。
[0009] 识别和分离有用于微生物和植物中基因的强烈表达或可诱导表达的调控元件在 转基因植物的商业品种开发中将是有益的。
【发明内容】
[0010] 本发明提供了用于调控植物中基因表达的组合物和方法。组合物包括源自大豆的 核苷酸序列及其在植物中启动转录的变体。特别地，提供了从Y液泡膜分离出的转录起始 区和大豆的质膜基因。本发明的组合物还包括SEQIDN0:1和2所示的核苷酸序列及其变 体和片段。本发明的组合物也包括表达盒，其包括可操作地连接到目的异源核苷酸序列的 启动子。本发明还提供包括表达盒的载体，以及基因组中稳定地结合了上述表达盒的植物 和植物细胞。此外，组合物包括这些植物的转基因的种子。
[0011] 可操作地连接到启动子的是可以修饰植物表型的目的序列。该修饰可以包括，例 如，调整内源性产物的产生，或可以包括外源表达产物的产生，以在植物中提供新功能或产 物。例如，包括异源核苷酸序列，其编码赋予对除草剂或有害生物的抗性的基因产物。
【附图说明】
[0012] 图1显示了当处于Pbdc6(SEQIDN0:1)和Pbdc7(SEQIDN0:2)启动子控制下时 荧光素酶的高水平表达。
[0013] 详细说明
[0014] 本发明涉及用于调控植物或植物细胞中基因表达的组合物和方法。本发明的组合 物包括用于大豆启动子的新型核苷酸序列。具体地，本发明提供了分离的启动子核酸分子， 其包含SEQIDN0:1或2所示的核苷酸序列，及其片段和变体。此外，还提供了转化的植物、 植物细胞以及种子。
[0015]当本发明的启动子序列在DNA构建体内被组装好以使该启动子可操作地连接到 目的核苷酸序列时，该启动子序列驱动通过该DNA构建体稳定转化的生物体细胞，特别是 植物细胞，的核苷酸序列的表达。启动子序列也可用作探针用于隔离其他大豆启动子序列 或基因，用作分子标记等等。
[0016]用于在植物中表达核苷酸序列的方法包括：将包括本发明的启动子的表达盒引入 植物细胞，该启动子可操作地连接到目的核苷酸序列，并且从植物细胞再生成转化植物。
[0017] 本文所用冠词"一"是指语法上该冠词的宾语有一个或一个以上（即指至少一 个）。举例而言，"元件"意指一个或多个元件。
[0018] 本文所用术语"核酸分子"旨在包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA)和RNA 分子（例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA类似物。该核酸分子可以是单 链的，或是双链的，但优选地是双链的DNA。
[0019] "分离的"或"纯化的"核酸分子或其生物活性部分，当由重组技术制备而得时，基 本不含其它细胞物质或培养基，或当经化学合成时，基本不含化学前体或其它化学物质。优 选地，"分离的"核酸中不含有天然侧接生物体基因组DNA中核酸（即位于该核酸5'端和 3'端的序列）的序列（优选地蛋白编码序列），该生物体为该核酸来源。就本发明而言，当 "分离的"用于表述核酸分子时，不包括分离的染色体。例如，在不同的实施例中，启动子分 子可包含小于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0.Ikb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然 侧接细胞基因组DNA中的核酸分子，该细胞为该核酸来源。以下小节中更详细地阐述本发 明的不同方面。
[0020] 分离的核酸分子及其夺体和片段
[0021] 本发明的核苷酸序列包含SEQIDNO: 1和2所示的启动序列及其变体。"启动子" 是指作用是引导下游编码序列转录的核酸序列。启动子一般包括DNA序列，该序列与位于 转录起始（加帽）位点5'端10-30个碱基对附近的共有5' -TATAAT-3'（TATA盒）同源，该 转录起始位点能够引导RNA聚合酶以启动RNA合成。启动子可以进一步包括其他识别序 列，通常位于TATA盒上游或5'端，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。这些包括 CAAT盒，其经常在TATA盒5'端30-70碱基对附近被发现，并且与标准形式5' -CCAAT-3'（布 里纳希和尚邦（1981)生物化学年鉴 50:349-383)(BreathnachandChambon(1981)Ann. Rev.Biochem. 50:349-383)同源。在植物中，CAAT盒有时由称为AGGA盒的序列所替换，该 序列区具有腺嘌呤残基，其对称地侧接三联体G(或T)NG(梅辛等人（1983)，植物基因工 程，T.小菅，C.梅雷迪思以及A.霍尔安德尔（编），纽约普莱南出版社，第211-227页） (Messingetal. (1983),inGeneticEngineeringofPlants,T.Kosuge,C.Meredithand A.Hollaender(eds.),PlenumPress,NewYork,pp. 211-227)。这些元件，连同其他转录和 翻译调控核酸序列（也称"控制序列"），都是表达目的DNA序列所必需的。用于分离和识 别本文未提及的调控元件的方法是本领域中公知的，例如增强子和负责编码区的组织或时 空表达的元件，参见例如，美国专利号5, 635, 618、6, 218, 140、6, 303, 370、6, 310, 197以及 6, 355, 864。
[0022] "核心启动子"是指无启动子元件的启动子。核心启动子含有用于启动子起作用的 必需核苷酸序列，包括TATA盒和转录起始位点。这样的区域通常存在于大多数启动子中， 并伴随一些变化。核心启动子区通常被称为最小启动子区，因为其能够独自起作用以启动 基础水平的转录。在不同的实施例中，Pbdc6的核心启动子序列对应于SEQIDNO: 1的约 29-318核苷酸；TATA对应于SEQIDNO: 1的约288-296核苷酸；并且翻译起始位点对应于 SEQIDNO: 1的核苷酸位置318。在其他实施例中，Pbdc7的核心启动子序列对应于SEQID NO: 2的约1341-1643核苷酸，TATA对应于SEQIDNO: 2的约1603-1608核苷酸；并且翻译 起始位点对应于SEQIDNO: 2的核苷酸位置1643。本领域的技术人员将理解核心启动子区 可以与以上所述位置在上游或者下游有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多核苷酸不同，并 且可以容许核心启动子序列内的变化。
[0023] 本发明还包括核酸分子，该核酸分子为所披露的启动子序列的片段。"片段"是指 启动子序列的一部分。核苷酸序列的片段可以具有生物活性，并且因此能够启动在植物中 可操作地连接的核苷酸序列的转录，或者它可以是用作使用下述方法的杂交探针或PCR引 物的片段。确定这些片段是否降低表达水平或改变表达特性（组成型表达或诱导型表达） 的试验是本领域中所公知的。
[0024] 核酸分子是启动子序列的片段，根据所期望的用途可包括至少大约20、50、100、 200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600 个连续核苷 酸，或高达存在于本文披露的全长启动子序列中的核苷酸数目（例如，用于SEQIDN0:1的 1230个核苷酸，或用于SEQIDNO: 2的1688个核苷酸）。"连续的"核苷酸是指彼此紧邻的 核酸残基。本发明的启动子的生物活性片段将保留启动子活性（即，启动转录）。"保留启 动子活性"是指片段将具有全长启动子的启动子活性的至少大约30%、至少大约50%、至少 大约70%或至少大约80%。启动子的生物活性部分可通过分离本发明的启动子核苷酸序 列之一的一部分，并且评估该启动子部分的活性来进行制备。用于测定启动子活性的方法 是本领域中所公知的。适当方法的实例，参见题为"启动子活性评估"的部分。
[0025] 这些片段将一般包括具体启动子序列的TA