钠通道敏感性芋螺肽和类似物，包括其组合物和方法
【专利说明】钠通道敏感性芋螺肽和类似物，包括其组合物和方法 发明领域
[0001] 本发明涉及芋螺肽（conopeptide)和其类似物，其可控制或另外影响电压门控的 钠通道，如Nav1.1-1. 7通道的行为。许多芋螺肽在锥体螺（芋螺属）的毒液中以微量被 发现。因此，本发明涉及化学、生物化学、分子生物学和药学等领域。
[0002] 发明背景
[0003] 本文利用的所有的出版物、专利和其它材料通过引用被并入。
[0004] 芋螺属中海洋腹足类的毒液已产生为数众多的的结构和功能不同的肽组分。锥体 螺毒液中鉴定的渐增种类的生物活性肽已提供对在使神经活性分子进化以适合它们不同 的生物学目的中芋螺属物种采取的表面上无尽种类的方向的了解。
[0005] 芋螺属中的生物活性肽（"芋螺肽"）被分成两大类：非富含二硫化物的和富含 二硫化物的。后者通常称作芋螺毒素。非富含二硫化物的分类包括没有半胱氨酸的芋 螺肽（contulakins和conorfamides)，和具有形成单个二硫键的两个半胱氨酸的芋螺肽 (conopressins和contryphans)。包括富含二硫化物的分类的芋螺肽具有两个或多个二硫 键。针对这些结构不同的芋螺肽鉴定的主要分类的分子靶标是电压门控和配体门控离子通 道超家族的成员等等。
[0006] 许多这些肽的结构和功能已确定。三种分类的靶标已被阐明：电压门控离子通道； 配体门控离子通道和G蛋白连接的受体。
[0007] 靶向电压门控离子通道的芋螺肽包括延迟钠通道失活的那些，以及对钠通道、钙 通道和钾通道特异性的阻断剂。靶向配体门控离子通道的肽包括NMDA和血清素受体拮抗 剂，以及竞争和非竞争性烟碱受体拮抗剂。对G蛋白受体起作用的肽包括神经降压素和血 管加压素受体激动剂。芋螺毒素的药物选择性至少部分由特定的二硫键框架结合二硫化物 环内高变的氨基酸限定。
[0008] 电压门控的钠通道在包括肌肉的肌细胞以及中枢和周围神经系统的神经元在内 的所有可兴奋细胞中被发现。在神经元细胞中，钠通道主要负责产生动作电位的快速上升。 以该方式，钠通道对神经系统中电信号的开始和传播是必要的。钠通道合适和适当的功能 因此对神经元的正常功能是必需的。因此，认为异常的钠通道功能为许多种医学病症一一 包括癫痫、心律失常、肌强直和疼痛一一的基础。
[0009] 目前存在电压门控的钠通道（VGSC)a亚单位家族的至少九个已知成员。该家族 的名称包括CNx、SCNAx和Navx.x。VGSC家族已被系统发生地分成两个亚家族Navi.X(除 SCN6A外的所有）和Nav2.X(SCN6A)。Navi.X亚家族可被在功能上细分成两类，对河豚毒素 的阻断敏感的那些（TTX-敏感性或TTX-s)和抵抗河豚毒素的阻断的那些（TTX-抵抗性或 TTX-r)〇
[0010]NavL7,可选地写作NaVL7、（PN1，SCN9A)VGSC，对河豚毒素的阻断敏感并且优选 在周围交感神经和感觉神经元中表达。SCN9A基因已从包括人、大鼠和兔的许多物种克隆， 并显示人和大鼠基因之间约90%的氨基酸同一性。
[0011] 附图简沐
[0012] 图IA和IB显示C.geol类似物对hNaVl. 7的浓度响应曲线。图IA:内部截短的 合成肽C.geol[des-Ser34]的IC5。值被计算为I. 8yM。图IB:浓度响应曲线在全长肽上重 复，除含有在位置24的氨基丁酸等排置换的类似物（C.geol[C24Abu])外。
[0013]详细描沐
[0014] 在描述和要求保护本发明中，以下术语将根据下面提出的定义来使用。
[0015] 单数形式"一（a) "、"一（an)"和"所述（the)"可包括复数的指示物，除非上下文 另外清楚地指示。因此，例如，提及"一（a)肽"包括提及一个或更多这样的肽，提及"所述 类似物"可包括提及一个或更多这样的类似物。
[0016] 如本文所用，"对象"指可获益于根据本公开方面的组合物或方法施用的哺乳动 物。对象的实例包括人，并还可包括其它动物如马、猪、牛、狗、猫、兔和水生哺乳动物。
[0017] 如本文所用，术语"肽"可用于指天然或合成的分子，其包括两个或更多的氨基 酸一一由一个氨基酸的羧基与另一个的Ct氨基连接。本发明的肽不受长度限制，因此"肽" 可包括多肽和蛋白质。氨基酸序列分别以氨基至羧基方向从左至右书写。
[0018] 如本文所用，关于肽，术语"分离的"指已从其最初的环境去除的物质，如果该物质 天然存在。例如，活的动物中存在的天然存在的肽不是分离的，但是从自然系统中共存的物 质中的一些或全部分离的相同肽是分离的。这样的分离的肽可以是组合物的部分，并仍然 是分离的，因为组合物不是其自然环境的部分。"分离的"肽还包括通过重组DNA技术合 成或产生的物质或合成地产生的物质。
[0019] 除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与该发明所属领域的技术人 员通常理解相同的意义。
[0020] 如本文所用，术语"基本上"指作用、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或 几乎完全的范围或程度。例如，"基本上"被密封的物体将指该物体被完全密封或被几乎完 全密封。与绝对完全的偏差的确切允许的程度在一些情况中可取决于特定的上下文（环 境，context)。然而，通常说完全的接近将是这样的以具有相同的整体结果，好像获得绝对 和完全完成。当以否定的含义使用时，"基本上"的使用是同等可适用的，指作用、特性、性 质、状态、结构、项目或结果的完全或接近完全的缺少。例如，"基本上没有"颗粒的组合物将 完全缺少颗粒，或几乎完全缺少颗粒，以至于效果将是相同的，好像它完全缺少颗粒。换言 之，"基本上没有"成分或要素的组合物可仍然实际上含有这样的项目，只要不存在其可测 量的效果。
[0021] 如本文所用，术语"约"用于通过提供给定的值可以是端点"之上一点"或"之下一 点"而不影响期望的结果而对数值范围端点提供灵活性。
[0022] 如本文所用，多个项目、结构要素、组成要素和/或物质可以为了方便而存在于共 同的名单中。然而，这些名单应被解释为名单的每个成员被个别地鉴定为单独和独特的成 员。因此，这样的名单的个体成员不应仅基于它们在共同分组中的呈现，而被解释为同一名 单任何其它成员的事实上相等物一一在没有相反的指示的情况下。
[0023] 浓度、量和其它数值数据在本文可以以范围形式被表达或呈现。应当理解，这样的 范围形式仅为了方便和简洁而使用，因此应被灵活地解释为不但包括被明确地描述为范围 界限的数值，而且包括该范围内包括的所有单个数值或子范围，好像每个数值和子范围被 明确地描述。作为实例，"约1至约5"的数值范围应被解释为不但包括明确描述的约1至 约5的值，而且包括指示的范围内的单个值和子范围。因此，该数值范围包括单个值如2、3 和4和子范围如1-3、2-4和3-5等，以及单个的1、2、3、4和5。
[0024] 该相同的原则适用于仅描述一个数值作为最小值或最大值的范围。此外，这样的 解释应适用，而不管范围的宽度或正被描述的特性。
[0025] 详细描沐
[0026] 本公开提供新的肽，其显示在阻断钠通道中的活性，包括多种相关的组合物和方 法。更具体地，这些肽至少阻断电压门控的钠通道。本文中的许多描述与NaVL7钠通道有 关；然而应当理解，目前的范围包括电压门控或另外的任何钠通道，其受目前的肽的影响。 注意，这些肽利用毒液分部分离（分馏，fractionation)、测序、克隆和转录组学的组合而 衍生自纹芋螺（Conusgeographus)的毒液，并且目前的范围另外包括天然存在的肽、完全 或部分合成的肽和其相关的类似物。
[0027]目前的肽可通过从芋螺属毒液的分离而被鉴定。另外，目前的肽可利用重组DNA技术，通过利用常规技术如逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR)的使用或退化探针的使用筛 选多种芋螺属物种的cDNA文库而被鉴定。RT-PCR的引物基于信号序列中的保守序列和推 进器肽基因的3'非翻译区。与这些探针杂交的克隆可被分析以鉴定满足最小尺寸需要的 那些，即，具有大约300个核苷酸（对于前体肽）的克隆，如对于正被检查的特定cDNA文库 利用位于cDNA克隆位点两侧的PCR引物所测定的。这些最小尺寸的克隆然后可被测序。然 后检查序列存在具有上面提到的肽特性的肽。测试该方法鉴定的肽的生物活性，如本文、美 国专利号5, 635, 347或本领域常规所描述的。
[0028]目前的肽足够小以通过本领域熟知的技术被化学合成。肽通过合适的方法合成， 如通过专有的固相技术（Merrifield固相合成），通过部分固相技术，通过片段凝结或通过 经典溶液偶联（solutioncouplings)。合适的技术由美国专利号4, 105, 603 ;3, 972, 859 ; 3, 842, 067 ;3, 862, 925 ;4, 447, 356 ;5, 514, 774 ;5, 591，821 和 7, 115, 708 的公开内容来例 示，每个通过引用被并入本文。在非限制性方面，固体肽合成程序可利用低预负载的王氏树 脂结合假脯氨酸Fmoc-Tyr(tBu)-Thr(也Me'Mepro) -OH来优化以获得粗制线性产物的提高的 纯度。
[0029] 本文描述的各种肽还可通过利用美国专利号4, 447, 356 ;5, 514, 774和 5, 591,821--其公开内容通过引用被并入本文--中描述的技术，从特定芋螺属物种的 分离和纯化而获得。本文描述的肽还可通过本领域熟知的重组DNA技术产生。
[0030] 化学合成或重组DNA技术产生的肽可被分离，被还原（如需要）和被氧化以形成 二硫键。一种形成二硫键的方法是在冷的室温下或在室温持续延长时期的线性肽的空气氧 化。该程序导致大量生物活性的、二硫化物连接的肽的产生。氧化的肽可利用反相高效液 相色谱法（HPLC)或类似方法分部分离以分离具有不同连接构型的肽。此后，通过比较这些 部分（馏分，fraction)与天然物质的洗脱或通过利用测定，具有最大生物学效能的正确键 合的特定部分可被测定。然而，由于由较小生物效能的其它部分的存在产生的稀释，稍微更 高的剂量可以是有利的。
[0031] 本文描述的肽的突变蛋白、类似物或活性片段也被考虑。目前的肽衍生的突 变蛋白、类似物或活性片段可根据已知技术合成，包括保守氨基酸置换，如美国专利号 5, 545, 723 (具体参见第2栏第50行至第3栏第8行）；5, 534, 615 (具体参见第19栏第45 行至第22栏第33行）和5, 364, 769 (具体参见第4栏第55行至第7栏第26行）一一每个 通过引用被并入本文一一中所概括描述的。
[0032] 在本发明的一个方面，提供具有7个半胱氨酸残基的新的肽，其中所述肽具有 X1X2CX4X5X6X7X8X9CX11X12X13X14X15X16CCX19X 意，X1 2、X4 9、X11 16、X19 21、&3和X25 28每个可独立地是允许产生的肽的功能性并且保持半胱 氨酸残基的间距的任何氨基酸。C24是半胱氨酸或取代的半胱氨酸，'是羧化的C端，如在本 文中进一步讨论的。
[0033] -方面，乂27可以是赖氨酸或甘氨酸。另一方面，X6可以是羟脯氨酸或丙氨酸。再 一方面，X23可以是天冬氨酸、Y-羧基谷氨酸或天冬酰胺。在另外的方面，X25可以是酪氨 酸或天冬氨酸。
[0034] 一方面，本发明提供具有序列GWCGDOGATCGKLRLYCCSGFCX23C24X25TKTC-X31T(SEQ ID001)的肽，其中0是羟脯氨酸，X23是天冬氨酸、天冬酰胺或羧基谷氨酸，C24是半胱氨酸 或取代的半胱氨酸，乂25是酪氨酸或天冬氨酸，X3。是0至6个氨基酸的肽，并且'是羧化的 C端。一方面，肽可以是分